葛根为豆科植物野葛的干燥块根，人们经常用作食用蔬菜，也可用作药物，素有“千年人参”的美誉[1]。在我国葛根资源极为丰富，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布，豫南大别山区也盛产野生葛。葛根的主要有效成分是以葛根素、大豆苷、大豆苷元为代表的异黄酮类化合物，其中葛根素含量最高[2]。研究表明葛根提取物具有血管舒张、神经保护、心脏保护、抗癌、抗氧化、抗炎症等作用[3-5]。目前文献中对葛根素的提取方法、葛根素和葛根异黄酮粗提液的抗氧化及抑菌活性均有研究[6-8]，而对纯化后的葛根素体外抗氧化及体外抑菌活性分析鲜有报道。本研究以河南省大别山区的野葛根为原料，采用超声波辅助提取葛根素，通过与糖精形成超分子复合物纯化葛根素，利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定其含量，用清除自由基的方法测试纯化的葛根素的体外抗氧化活性，用滤纸片法研究纯化的葛根素的体外抑菌活性，以期使信阳大别山区葛根资源得到充分利用，为葛根研究药物开发及食品加工提供参考。
1 材料与方法
1.1 原料、试剂及仪器
葛根：河南新县豫南葛业有限公司；过硫酸钾、无水乙醇（均为分析纯）：中国医药集团上海化学试剂总公司；水杨酸（分析纯）：石家庄市有机化工厂；硫酸亚铁：信阳市化学试剂厂；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]（均为分析纯）：福州飞净生物科技有限公司；双氧水（分析纯）、甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；维生素C（分析纯）：成都化夏化学试剂有限公司；葛根素标准品：成都植标化纯生物技术有限公司。
营养琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、绳状青霉菌（Penicillium rope）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）：信阳农林学院微生物实验室提供。
KQ3200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪：天津港东科技发展股份有限公司；1100型高效液相色谱仪：日本岛津公司；XFS-30CA电热式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-2F净化工作台：苏州净化设备有限公司；HM-SY96A酶标仪：山东恒美电子科技有限公司；GHA-300Y恒温摇床：杭州绿博仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 葛根素的制备及纯化
将干燥的葛根粉碎后过100目筛，称取粉碎后的葛根粉50 g，参考文献[9-10]的方法制备，按液料比25∶1（mL/g）加70%乙醇溶液，在超声功率350W、60℃条件下提取2 h，过滤去除滤渣；滤液在25℃、4 000 r/min条件下离心10 min后，过滤；再蒸发浓缩滤液至原体积的1/2～1/3后，得葛根素粗提液。低温烘干得到葛根素粗提物9.53 g。
利用葛根素粗提物，参照文献[11]的方法纯化，通过与糖精形成超分子复合物，再调节溶液pH值为4，得到葛根素结晶。洗涤干燥后作为葛根素样品储藏备用。
1.2.2 葛根素含量测定
色谱条件：色谱柱为Pgrandsil C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇∶36%乙酸∶蒸馏水=25∶3∶72（体积比）；流速 1.0 mL/min；柱温 30℃；检测波长250 nm；运行时间30 min；进样量10 μL。利用外标法计算葛根素样品中葛根素含量。
1.2.3 溶液的制备
精密称量葛根素对照品1.0 mg，加甲醇10 mL定容，即得葛根素对照品溶液。取葛根素样品5.0 mg于锥形瓶中，加甲醇50 mL定容至刻度线，即得0.1 mg/mL葛根素样品溶液。
1.2.4 红外光谱测定
将葛根素与KBr按质量比1∶100充分研磨混匀后压片。以KBr为空白，置于傅里叶变换红外光谱仪，在4 000 cm-1～500 cm-1区间内进行红外光谱扫描。
1.3 葛根素样品抗氧化活性试验
1.3.1 葛根素样品对ABTS+自由基清除能力的测定
参照文献[12]的方法进行改良，配制7mmol/LABTS溶液5 mL与140 mmol/L过硫酸钾溶液88 μL混合，在25℃静置避光12 h，得到ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.70±0.02，得ABTS+自由基工作液。用无水乙醇制备葛根素样品溶液，使其浓度分别为4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL。向试管中依次加入 1.0 mL 的ABTS+自由基工作液和3.0 mL不同浓度的葛根素乙醇溶液，摇匀后放置15 min，在734 nm波长下测其吸光度，记为A样品。无水乙醇代替ABTS+自由基工作液测其吸光度，记为A对照。无水乙醇代替样品溶液测其吸光度，记为A空白。阳性对照用维生素C溶液代替样品液，试验平行3次，取平均值，按式（1）计算ABTS+自由基清除率。
1.3.2 葛根素样品对DPPH自由基清除能力的测定
DPPH自由基是一种稳定的质子自由基，其甲醇溶液显紫色，当与具有抗氧化活性物质反应后，溶液颜色由紫色逐渐变为无色，吸光度变小，通过测定DPPH自由基的吸光度变化来评价抗氧化物质的抗氧化活性[13]。
参照文献[13]的方法，稍作改动。取质量浓度为4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL 的葛根素样品溶液2.0mL，均加入浓度为2mmol/LDPPH-甲醇溶液2.0mL，25℃避光1h后在517 nm处测定其吸光度，记为A样品。甲醇代替DPPH-甲醇溶液测其吸光度，记为A对照。甲醇代替样品溶液测其吸光度，记为A空白。阳性对照用维生素C溶液代替样品液，试验平行3次，取平均值，按式（2）计算DPPH自由基清除率。
1.3.3 葛根素样品对羟基自由基清除能力的测定
H2O2和 FeSO4混合发生芬顿（Fenton）反应，生成具有高反应活性的羟基自由基，水杨酸能有效地捕捉羟基自由基，并产生紫色物质。采用Fenton反应法，参照文献[14]的方法进行改良，用蒸馏水配制浓度为4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL 的葛根素样品溶液，依次取2.0 mL不同浓度的葛根素样品液，向各试管中加入9 mmoL/L FeSO4溶液2.0 mL和9 mmoL/L水杨酸溶液2.0 mL，摇匀后，再加入8.8 mmoL/L过氧化氢2.0 mL和蒸馏水2.0 mL，摇匀后盖上塞子，于37℃水浴锅中加热30 min，在510 nm处测其吸光度，记为A样品。设置样品对照组试验，用相同体积的蒸馏水代替H2O2溶液测定吸光度，记为A对照。使用相同体积的蒸馏水代替样品溶液测定吸光度，记为A空白。用维生素C溶液代替样品溶液做阳性对照。试验平行3次，取平均值，按式（3）计算羟基自由基的清除率。
1.4 葛根素样品抑菌活性试验
1.4.1 培养基的配制
营养琼脂液体培养基[15]：称取营养琼脂33 g于1 000 mL锥形瓶中，加入适量蒸馏水，加热融化，搅拌摇匀、定容至1 000 mL，调pH值为7.0±0.2，盖上塞子并包扎好，高压蒸汽灭菌30 min备用。
马铃薯液体培养基：取去皮并切成小块的马铃薯200 g，加蒸馏水1 000 mL煮沸30 min，然后用4层脱脂棉过滤取上清液，加入葡萄糖20 g，搅拌均匀后补加蒸馏水至1 000 mL，调pH值到7.0±0.2，高压灭菌备用。马铃薯固体培养基则另加琼脂15 g～20 g，其他条件相同。
1.4.2 菌悬液的制备
参照文献[16]的方法，用马铃薯液体培养基制备黑曲霉菌、绳状青霉菌菌悬液，在25℃～28℃、150 r/min摇床中培养72 h后备用。用营养琼脂液体培养基制备枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌菌悬液，在37℃电热恒温培养箱中培养24 h后备用。
1.4.3 抑菌圈的测定
该试验参考文献[16]，稍作改动。将直径为6 mm的圆形滤纸片经高压灭菌后，分别放入6种浓度为6.5、8.5、10.5、12.5、14.5、16.5 mg/mL 的葛根素样品液中浸泡2 h。将上述菌悬液用移液枪分别吸取100 μL注射到不同的琼脂平板表面，涂布均匀，制成大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、黑曲霉菌、绳状青霉菌含菌平板。取浸泡过不同浓度葛根素样品的滤纸片贴在含菌平板上，每个培养皿中各放置4片浸泡过同一浓度样品液的滤纸片。以蒸馏水为空白对照组。将贴好滤纸片的含菌平板封好置于37℃电热恒温培养箱中，培养24 h后用游标卡尺测量其抑菌圈的直径，取其平均值。
1.4.4 葛根素样品对G+和G－最低抑菌浓度的测定
最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）是衡量抗生素抗菌活性的指标，指体外培养18 h～24 h后能抑制培养基中致病菌生长的最低药物浓度[17]。大多数近球形细菌的最大吸收波长为600 nm，形状规则的菌液浓度与吸光度呈线性关系。因此，大多数细菌的测定通常选择菌液在600 nm处的吸光度[18]；该试验以大肠杆菌为革兰氏阴性试验菌，以金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性试验菌来分析其最小抑菌浓度的差异[19]。
参考李桥妹等[20]的方法，稍作修改。分别取10 mL培养液于试管中，加入0.2 mL不同的菌悬液，加入1.0 mL不同浓度的葛根素样品液，再加入0.8 mL丙酮，使其配制成总体积为12 mL的混合液，于37℃恒温培养24 h。阳性对照液：只加菌悬液，不加葛根素样品和丙酮；阴性对照液：不加菌悬液的混合液。测定各试管中混合液的OD600nm值，与阴性对照管OD600nm值相同的最小葛根素样品浓度，即为最低抑菌浓度。
1.5 数据处理
所有试验数据平行测定3次取平均值，采用通过SPSS、Excel软件进行数据处理和图片绘制。
2 结果与讨论
2.1 葛根素含量测定结果
葛根素对照品和葛根素样品HPLC色谱图见图1、图2。
图1 葛根素对照品HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of puerarin control product
利用外标法计算葛根素样品中葛根素含量为62.03%。
图2 葛根素样品HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of puerarin sample
2.2 红外测定结果
利用红外光谱仪测定葛根素样品的红外光谱（infrared spectrum，IR），见图3。
图3 红外吸收图
Fig.3 IR absorption diagram
由图3可知，在3 392.17 cm－1处有一个吸收峰是-OH伸缩振动峰，1 631.48 cm－1吸收峰为C=O伸缩振动峰，1 511.92、1 444.42、1 392.35 cm－1处是芳环骨架伸缩振动峰，1 255.43、1 056.80 cm－1处为 C-O-C 伸缩振动峰，符合葛根素结构[21]。
2.3 葛根素样品抗氧化活性的测定结果
葛根素样品对ABTS+自由基、DPPH自由基和羟基自由基的清除能力结果见图4～图6。
图4 葛根素样品对ABTS+自由基清除能力
Fig.4 Scavenging ability of puerarin sample to ABTS+radical
图5 葛根素样品对DPPH自由基清除能力
Fig.5 Scavenging ability of puerarin sample to DPPH radical
图6 葛根素样品对羟基自由基清除能力
Fig.6 Scavenging ability of puerarin sample to hydroxy radical
由图4可知，在4.5 mg/mL～24.5 mg/mL的质量浓度内，葛根素样品对ABTS+自由基的清除能力随浓度的升高逐渐增强；样品质量浓度为24.5 mg/mL时，自由基清除率达84.26%，虽然ABTS+自由基清除率稍小于同浓度的维生素C，但葛根素样品仍表现出显著的清除能力。
由图5可知，随着葛根素样品浓度的增加，DPPH自由基的清除率明显增大；样品质量浓度在20.5 mg/mL时，样品与维生素C清除率相差不大，样品质量浓度为24.5 mg/mL时，DPPH自由基清除率达87.25%，样品的清除能力显著。
由图6可知，葛根素样品对羟基自由基的清除能力，随着样品浓度的增加逐渐增强，当浓度为8.5 mg/mL时，两者清除率相近，之后随着浓度的增加维生素C的清除率高于葛根素样品的清除率；样品质量浓度为24.5 mg/mL时，羟基自由基清除率达80.10%，清除率略小于维生素C，但仍表现出较好的清除效果。
2.4 葛根素样品抑菌活性结果与分析
2.4.1 葛根素样品对各种菌的抑菌结果
不同浓度的葛根素样品对不同菌种的抑制结果见表1。
表1 葛根素样品抑菌活性测定结果
Table 1 Antibacterial activity test results of puerarin sample
注：-代表无抑菌活性。
样品质量浓度/（m g/m L）绳状青霉菌6.5 6.5±0.2 7.2±0.2 6.4±0.2 6.5±0.1 - -8.5 7.2±0.2 7.6±0.1 7.4±0.1 7.2±0.2 - -1 0.5 8.1±0.2 7.9±0.2 7.8±0.1 7.6±0.2 - -1 2.5 9.0±0.1 8.4±0.2 8.2±0.2 8.1±0.2 - -1 4.5 1 0.3±0.1 9.0±0.1 8.6±0.2 8.4±0.2 - -1 6.5 1 3.5±0.2 1 0.4±0.2 9.2±0.1 8.7±0.2 - -抑菌圈直径/m m大肠杆菌 金黄色葡萄球菌沙门氏菌枯草芽孢杆菌黑曲霉菌
由表1可知，葛根素样品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌均有一定的抑制作用，且随着样品液浓度的增加，对各种菌株的抑制作用也增强。当样品质量浓度≥10.5 mg/mL时，抑制作用顺序为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌＞枯草芽孢杆菌；但对绳状青霉菌和黑曲霉菌没有抑菌活性。
2.4.2 葛根素样品对G+和G-最低抑菌浓度的测定
不同浓度混合液OD600nm值的测定结果见表2。
表2 不同浓度混合液OD600nm值的测定
Table 2 Determination results of OD600nmvalues of mixed liquid with different concentrations
注：I代表金黄色葡萄球菌混合液的OD值；Ⅱ代表大肠杆菌混合液的OD值；-代表无此试验。
菌种 样品质量浓度/(mg/mL) 阳性对照12.5 10.5 8.5 6.5 4.5 2.5I 0.293 0.271 0.258 0.281 0.286 0.292 1.176Ⅱ 0.290 0.276 0.254 0.143 0.109 0.285 1.359阴性对照 0.289 0.270 0.251 0.142 0.107 0.103 -
由表2可知，当葛根素样品浓度大于4.5 mg/mL时，含大肠杆菌的混合液吸光度与阴性对照液吸光度相近，即无菌生长；而当葛根素样品浓度降至2.5 mg/mL时，含大肠杆菌的混合液吸光度增至0.285，由此可以得出，4.5 mg/mL的葛根素样品已经不能抑制大肠杆菌的生长，说明能抑制大肠杆菌生长的最低葛根素样品浓度为4.5 mg/mL，能够抑制金黄色葡萄球菌的最低葛根素提取物浓度为8.5 mg/mL。葛根素样品对大肠杆菌的抑制效果强于金黄色葡萄球菌，可粗略得出葛根素样品对革兰氏阴性菌的抑制作用大于革兰氏阳性菌。
3 结论
葛根素经超声波辅助乙醇提取，纯化后得葛根素样品，经HPLC法测定其含量为62.03%，IR检测显示化合物具有葛根素分子结构。对葛根素样品进行抗氧化生物活性分析，当样品浓度在4.5 mg/mL～24.5 mg/mL时，对3种自由基的清除能力随着样品浓度增大而增强；当样品浓度24.5 mg/mL时，对ABTS+自由基、DPPH自由基、羟基自由基的清除率分别达84.26%、87.25%和80.10%，均在80%以上。具有较强的自由基清除能力，表现出较好的抗氧化生物活性。葛根素样品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌都有一定的抑制作用，且对各种菌株的抑制作用与样品浓度呈现正向关系；其抑制能力大小表现为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌＞枯草芽孢杆菌，但对绳状青霉菌和黑曲霉菌没有抑菌活性。葛根素样品抑制大肠杆菌生长的最低浓度为4.5 mg/mL，抑制金黄色葡萄球菌的最低浓度为8.5 mg/mL。葛根素样品对大肠杆菌的抑制效果强于金黄色葡萄球菌，可粗略得出葛根素样品对革兰氏阴性菌的抑制作用大于革兰氏阳性菌。
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