乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类在自然界中广泛分布，可以利用多种糖类进行乳酸发酵的细菌的总称，以其公认的安全性被广泛地应用于食品工业、农牧业、医药行业等领域[1-5]，然而由于其对生长环境的要求较高，如需在厌氧甚至绝氧的条件下生存、对高温耐受能力较差等，给乳酸菌产品的应用与开发带来很大挑战，所以筛选品质性状优良、抗逆性强的菌种成为乳酸菌产品工业化的重要一环[6-7]。
屎肠球菌（Enterococcus faecium）是一种圆形或者椭圆形球菌，不具有芽孢，没有鞭毛，常见为单生的乳酸菌，且属于乳酸菌中抗逆性较强的一种，具有耐酸碱、耐高温、耐高盐、对氧气存在与否无要求、肠道黏附能力好等生长特点[8-10]，同时还具有抑制病原菌[11]、增强免疫力[12]等作用，是动物肠道正常菌群之一，与其它肠道益生菌相互协作共同维持宿主的正常生理功能。
试验前期从传统发酵食品泡菜中分离筛选获得了屎肠球菌RS3，为进一步了解该菌株生长特性，依据《中国药典》（2015年版）的要求对菌株进行菌落及菌体细胞形态观察、菌株脂肪酸指纹图谱绘制、总酸及乳酸的测定，并且对其进行10种常见抗生素药物的耐药性分析，旨在为其进一步开发为益生菌剂提供数据支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品
天津科技大学微生物遗传与代谢实验室前期分离的屎肠球菌RS3，保存于桂林南药股份有限公司。
1.1.2 试剂
牛肉膏（生化级）、尿素（分析纯）、蔗糖（分析纯）、淀粉（生化级）、糖蜜（生化级）、山梨醇（生化级）、L-阿拉伯糖（生化级）、甘露醇（生化级）、D-棉子糖（生化级）、丝氨酸（生化级）、精氨酸（生化级）、甘露糖（生化级）、果糖（生化级）、半乳糖（生化级）、麦芽糖（生化级）、海藻糖（生化级）、甘油（生化级）、明胶（生化级）、脱脂牛奶（生化级）：北京索莱宝科技有限公司；氯化钠（分析纯）、乳糖（分析纯）、葡萄糖（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；吐温-80（生化级）、溴甲酚紫（分析纯）、柠檬酸盐（分析纯）、DL-苹果酸盐（分析纯）、菊粉（生化级）：大连美伦生物技术有限公司；血琼脂平板（成品培养基）：广东环凯威生物科技有限公司。
1.2 仪器
双人超净工作台（SW-CJ-1FD）：苏净集团苏州安泰空气技术；pH计（S210）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS）：上海申安医疗器械；紫外分光光度计（UV-1800）：上海美谱达仪器有限公司；分析天平（BSA124S）：赛多利斯科学仪器有限公司；电热恒温培养箱（DH4000B）：天津市泰斯特仪器有限公司；厌氧培养箱（YQX-T）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；双目生物显微镜（NIKON ECLIPSE 50i）、相机（D3200）：日本 Nikon 公司；电子扫描显微镜（TESCAN VEGA3）：泰思肯（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制
含糖牛肉汤培养基：1% 牛肉膏，0.5% 氯化钠，2% 胰蛋白胨，2% 乳糖，加蒸馏水至1 000 mL，调节pH值至6.0，115℃灭菌20 min。1.5% 碳酸钙含糖牛肉琼脂培养基：按照含糖牛肉培养基的配方和制法，加入溴甲酚紫0.06g、碳酸钙 15g、琼脂 15g，加热溶解，混匀，分装，115℃湿热灭菌20 min。脱脂牛奶培养基：称取脱脂牛奶粉末30 g，加蒸馏水至200 mL，115℃灭菌20 min。
1.3.2 菌株形态特征及电镜扫描观察
1.3.2.1 菌落形态及革兰氏染色
挑取碳酸钙含糖牛肉汤固体平板上有透明圈的单菌落，接种于含糖牛肉汤液体培养基中，37℃静置培养12 h。将菌液梯度稀释至10-6，取稀释后的菌液100 μL分别涂布于血琼脂平板、不含碳酸钙的含糖牛肉汤固体平板以及含有碳酸钙的含糖牛肉汤固体平板上，分别置于有氧和无氧条件下培养，通过肉眼观察菌落表征特征。同时对菌体进行革兰氏染色观察其菌体特征。
1.3.2.2 电镜扫描观察
取对数期菌液1 mL，8 000 r/min离心1 min，弃去上清并加入2.5% 戊二醛混匀，4℃固定过夜，8 000 r/min离心1 min，弃去上清液，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗 3 次，每次 10 min。加入 1% 锇酸4℃固定2 h，PBS冲洗3次，每次10 min。利用30% 、50% 、70% 、90% 和100% 的乙醇梯度脱水，每次静置10 min后8 000 r/min离心1 min，其中100% 乙醇脱水两次，样品置于临界点条件下干燥，喷金观察。
1.3.3 运动性鉴定
挑取碳酸钙含糖牛肉汤固体平板上有透明圈的单菌落，接种于含糖牛肉汤液体培养基中，37℃静置培养24 h，用接种环蘸取适量培养物点加到载玻片上的水滴中，以悬滴法进行观察[13]。
1.3.4 菌株生理生化鉴定试验
1.3.4.1 牛奶凝固力测定
挑取碳酸钙含糖牛肉汤固体平板上有透明圈的单菌落，接种于含糖牛肉汤液体培养基中，37℃静置培养12 h，吸取0.2 mL培养物转接入含有20 mL脱脂牛奶培养基的50 mL三角瓶中，混合均匀并置于37℃培养箱中静置培养48 h，观察牛奶凝固情况。
1.3.4.2 生化反应测定
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》以及《中国药典》（2015年版）鉴定菌株RS3生理生化特性。
（1）特征性发酵不同碳源
取碳酸钙含糖牛肉汤固体平板上有透明圈的菌落，接种于不同糖类或者是有机酸类物质的培养基上。将培养基置于37℃下培养24 h～48 h，考察其发酵不同碳源情况。
（2）生物酶试验
菌株触酶（过氧化氢酶）试验：挑取碳酸钙含糖牛肉汤固体培养基上有透明圈的菌落，接种于含糖牛肉汤液体培养基中，37℃静置培养12 h，离心收集菌体进行过氧化氢酶的检测。
氧化酶试验：取细胞色素氧化酶检测滤纸细胞色素氧化酶检测滤纸（cytoehrome oxidase test strip，ziqibio 05180）两枚，用无菌水浸润，挑取碳酸钙含糖牛肉汤固体培养基上有透明圈的菌落，均匀涂至检测滤纸上，于超净台内吹干，观察滤纸显色反应。
1.3.5 菌株发酵产总酸及乳酸的测定
1.3.5.1 总酸的测定
挑取含糖牛肉汤固体平板上的单菌落接种于液体培养基中，37℃静置培养24 h，吸取0.2 mL 24 h培养物接种于20 mL牛奶培养基中，37℃静置培养48 h。培养结束取培养物与脱脂牛奶培养基各5 mL，将培养物与培养基进行5倍稀释并加入3滴酚酞指示液，用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠滴定液分别滴定培养物与培养基至溶液为淡红色，保持1 min不褪色，计算两者消耗氢氧化钠的毫升数差值ΔV（ΔV数据大于2 mL结果有意义），根据氢氧化钠滴定液的消耗体积计算培养物中总酸含量。总酸计算公式如下。
式中：X为样品中总酸的质量浓度（以乳酸计），g/L；C为氢氧化钠标准滴定液的浓度，mol/L；90.08为乳酸的摩尔质量数值，g/mol；25为被测样品的体积，mL；5为被测样品稀释倍数。
1.3.5.2 乳酸的定性及定量测定
定性检测乳酸（《中国药典》（2015年版））：取试验组与对照组培养物各1 mL，加入10% 硫酸溶液3滴～5滴，振荡混匀后加入乙醚10 mL混匀，室温放置10 min，取分层后的上层乙醚液于试管中，100℃水浴。向蒸去乙醚的残渣中加蒸馏水2 mL，混合均匀后取出0.2 mL溶液，加入2 mL浓硫酸，于水浴中加热2 min，取出后用冷水冷却，滴加10% 愈创木酚乙醇溶液1滴，振摇观察显色情况。
定量检测乳酸：准确移取培养物2 mL于EP管中，4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于20 mL容量瓶中定容，取1 mL稀释后的样品经0.22 μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱柱为Aminex
HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm（Bio-Rad）。检测条件为流动相0.005 mol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，柱温65℃，检测器波长210 nm，进样量20 μL，检测时间22 min。
1.3.6 菌株生长曲线绘制
挑取含糖牛肉汤固体平板上的单菌落接种于液体培养基中，37℃静置培养12 h，然后以1% （体积分数）的接种量接种于50 mL液体培养基中，37℃静置培养12 h，再将其以2% （体积分数）的接种量平行地接种于3瓶盛有100 mL的含糖牛肉汤液体培养基中，37℃静置培养，每隔1 h取样1次，用紫外可见光分光光度计在600 nm波长下测定吸光度，绘制该菌体生长曲线。
1.3.7 脂肪酸组分测定
挑取含糖牛肉汤固体平板上的单菌落接种于10mL液体培养基中，37℃静置培养12 h，然后以1% （体积分数）接种量转接到600 mL液体培养基中，37℃静置培养12 h，于4℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，收集菌体，测定脂肪酸组分。
1.3.8 菌株对抗生素药物敏感性试验
参照WS/T 125—2018《抗菌药物敏感性试验的技术要求》，取新鲜的乳酶生菌液200 μL，均匀涂布于含糖牛肉汤固体平板上，然后将药敏纸片置于固体培养基平板表面上，轻压使纸片与培养基完全贴合，于37℃恒温厌氧培养箱中恒温培养12 h，考察菌株对抗生素药物的敏感性。
1.4 数据处理
运用Ecxel 2010软件对试验数据进行记录与初步处理分析，Origin 8软件进行图片绘制。
2 结果与分析
2.1 屎肠球菌RS3菌落及菌体特征
2.1.1 菌落形态分析
对分离得到的屎肠球菌RS3进行平板划线获得该菌单菌落，结果见图1。
图1 屎肠球菌RS3的分离纯化
Fig.1 Isolation and purification of E.faecium RS3
由图1可知，呈现乳白色圆形菌落，质地均匀，不透明，边缘整齐。
利用传统形态学鉴定方法，对分离纯化到的菌株进行观察。经过3种不同培养基（血琼脂平板、含糖牛肉汤固体平板和碳酸钙含糖牛肉汤固体平板）的培养，并分别在有氧和厌氧条件下培养，观察其菌株形态，结果见图2。
图2 屎肠球菌RS3在不同培养基上有氧和厌氧培养的生长情况
Fig.2 Aerobic and anaerobic growth of E.faecium RS3 on different media
RS3在血琼脂培养基、含糖牛肉汤固体培养基以及碳酸钙含糖牛肉汤固体培养基上生长时均表现为乳白色圆形菌落，菌落较大且光滑，具有光泽，直径均在0.5 mm～1.5 mm范围内。其中在血琼脂培养基上生长时菌落周围出现草绿色溶血圈，属于甲型（ɑ）溶血，与杜志林等[14]和魏成威等[15]研究的鸡源、狐源的屎肠球菌存在差异；在碳酸钙含糖牛肉汤固体培养基上培养时菌落周围出现透明圈，说明是菌落生长时产生酸与碳酸钙反应进而生产透明圈，即RS3能够在含糖牛肉汤固体培养基中发酵生产酸。
2.1.2 菌体细胞形态分析
通过革兰氏染色及镜检对屎肠球菌RS3菌株进行个体形态分析，结果见图3。
图3 屎肠球菌RS3菌株革兰氏染色及电镜扫描情况
Fig.3 Gram staining and electron microscopic scanning of E.faecium RS3
由图3可知，屎肠球菌RS3为革兰氏阳性菌株（图3a），扫描电子显微镜分析发现，屎肠球菌RS3菌体细胞呈椭圆，4个～5个细胞成团簇状或短链状分布（图3b）。
2.1.3 菌体细胞运动性
屎肠球菌RS3菌体运动性试验借助成像显微镜完成，可以观察到菌体无明显位移，只在原位置做布朗运动，结果见图4。
图4 细胞运动性观察
Fig.4 Observation of cell motility
2.2 生理生化试验鉴定
根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》以及《中国药典》（2015年版）对筛选菌株进行生理生化试验，检测其对不同碳源发酵产酸情况，增强鉴别专属性以区分相似菌株，生理生化试验结果见表1。
表1 屎肠球菌RS3菌株生理生化特性
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of E.faecium RS3
注：+表示阳性；-表示阴性。
项目 结果 项目 结果山梨醇 - 精氨酸 -L-阿拉伯糖 + 蔗糖 +甘露醇 + 甘露糖 +D-棉子糖 - 果糖 +葡萄糖 + 半乳糖 +葡萄糖酸盐 + 麦芽糖 +丙酮酸盐 + 海藻糖 +柠檬酸盐 - 乳糖 +丝氨酸 + 甘油 -苹果酸盐 - 菊粉 +
由表1可知，该菌株与《中国药典》（2015年版）对屎肠球菌所规定的以山梨醇、L-阿拉伯糖、甘露醇及D-棉子糖为碳源时所呈现的结果一致——山梨醇、D-棉子糖反应呈阴性，L-阿拉伯糖、甘露醇反应呈阳性；另外根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌系统鉴定手册》，本试验新增16种不同的糖类及有机酸类物质发酵，反应结果一致显示分离菌株为屎肠球菌（E.faecium）[16-17]。
过氧化氢酶位于细胞的过氧化物酶体内，是过氧化物酶体的标志酶，大约占过氧化物酶体酶总量的40% ，催化过氧化氢分解成氧和水，可以使细胞免受过氧化氢的毒害作用[18]，测得屎肠球菌RS3菌体中过氧化氢酶的含量为（1 507.39±15.90）U/g。阳性菌涂布于细胞色素氧化酶检测滤纸上会呈现深蓝色，而阴性菌无变化。屎肠球菌RS3细胞色素氧化酶检测结果见图5。
图5 屎肠球菌RS3细胞色素氧化酶检测
Fig.5 Cytochrome oxidase test of E.faecium RS3
由图5可知，屎肠球菌RS3涂布在检测滤纸上反应呈现为蓝色，故其为阳性菌株。
2.3 总酸的测定
通过酸碱滴定法测定屎肠球菌RS3在脱脂牛奶培养基中发酵产酸的情况，氢氧化钠滴定液消耗情况见表2。
表2 氢氧化钠滴定液消耗情况
Table 2 The consumption of sodium hydroxide
组别 始读数/mL终读数/mL消耗量/mL结果 平均值 标准差对照组 3.0 5.7 2.7 0 0 0 5.7 8.4 2.7 0 8.4 11.1 2.7 0实验组 11.1 17.1 6.0 3.3 3.33 0.06 17.1 23.1 6.0 3.3 23.1 29.2 6.1 3.4
由表2可知，消耗氢氧化钠滴定液的体积为3.33mL，满足《中国药典》（2015版）中规定的两者消耗氢氧化钠滴定液毫升数差值不得小于2 mL要求，数据具有参考意义，且计算出培养物中总酸含量为（6.01±0.10）g/L。
2.4 乳酸的测定
定性和定量检测屎肠球菌RS3发酵液中乳酸结果见图6。
图6 定性和定量检测屎肠球菌RS3发酵液中乳酸
Fig.6 Qualitative and quantitive of lactic acid in E.faecium RS3 fermentation broth
乳酸为屎肠球菌在发酵过程中产生的主要次级代谢产物[19]，为了鉴别本研究中分离得到的屎肠球菌RS3在脱脂牛奶培养基中发酵是否积累乳酸，利用愈创木酚显色法检测乳酸发现其发酵液呈现典型的淡粉红色，即菌株在脱脂牛奶培养基中生长时有乳酸积累，与《中国药典》（2015年版）所规定的结果一致（图6a）。通过高效液相色谱检测分析发现其发酵液中有乳酸特征峰，其在脱脂牛奶培养基中生长48 h后乳酸浓度为 5.73 g/L（图6b）。
2.5 菌株的生长曲线测定
菌株RS3进行静置培养，每隔1h取样1次，每次3个平行，将取得的样品用紫外分光光度计在波长600 nm下测定菌体浓度，绘制该菌株生长曲线，结果见图7。
图7 屎肠球菌RS3生长曲线图
Fig.7 Growth curve of strain E.faecium RS3
由图7可知，该菌株在含糖牛肉汤液体培养基中生长时，最初的0～2 h处于延迟期，菌株生长缓慢；2 h～8 h处于对数期，菌株快速生长；8 h～12 h处于稳定期。
2.6 菌株脂肪酸组分测定
脂肪酸是菌体的基本结构成分之一，是构成生物膜的重要物质，细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，不同种属的细菌在脂肪酸的组成和含量上存在不同程度的差异且比较稳定，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱。本研究收集稳定期屎肠球菌RS3菌体并测定其脂肪酸类型及含量，结果见表3。
表3 屎肠球菌RS3脂肪酸组分
Table 3 Fatty acid composition of E.faecium RS3
脂肪酸组分 相对含量/% 脂肪酸组分 相对含量/% 葵酸 0.16 亚麻酸 0.46十一烷酸 0.03 花生酸 0.11月桂酸 2.36 二十碳一烯酸 0.24豆蔻酸 9.52 二十一烷酸 0.28豆蔻一烯酸 1.06 二十碳三烯酸 0.58十五烷酸 0.38 二十碳四烯酸 0.14棕榈酸 27.30 芥酸 0.77棕榈一烯酸 9.28 二十二碳二烯酸 0.73十七烷酸 1.00 二十碳五烯酸 0.13十七碳一烯酸 0.62 木焦油酸 0.44硬脂酸 4.74 二十二碳六烯酸 0.06油酸 22.70 二十二碳五烯酸 0.15亚油酸 16.80
由表3可知，屎肠球菌RS3脂肪酸检测特征峰中主要有十四碳烷酸、十六碳烷酸、十六碳烯酸、十八碳烯酸和十八碳二烯酸，与甘永琦等[20]报道的肠球菌属具有的脂肪酸特征峰相一致。
2.7 菌株对抗生素药物的敏感性
将分离菌株进行头孢噻吩、四环素、氨苄西林等10种典型抗生素药物敏感性试验，检测结果如图8。
图8 药敏纸片法测定屎肠球菌RS3对抗生素药物的敏感性
Fig.8 Sensitivities of E.faecium RS3 to various antibiotics by drug sensitive paper method
1.氨苄西林霉素；2.舒巴坦；3.万古霉素；4.头孢噻吩；5.克林霉素；6.四环素；7.青霉素；8.红霉素；9.苯唑西林霉素；10.萘啶酸。
屎肠球菌RS3的抗生素敏感性见表4。
表4 屎肠球菌RS3的抗生素敏感性
Table 4 Sensitivities of E.faecium RS3 to various antibiotics
注：R表示耐药；I表示中介；S表示敏感；-表示无抑菌圈；/表示标准中未规定。
抗生素 透明圈直径/mm 抑菌圈直径判定标准/mm R I S氨苄西林霉素 22 ≤16 - ≥17舒巴坦 22 / / /万古霉素 17 ≤14 15～16 ≥17头孢噻吩 - ≤14 15～17 ≥18克林霉素 - / / /四环素 15 ≤14 15～18 ≥19青霉素 11 ≤14 - ≥15红霉素 16 ≤13 14～22 ≥23苯唑西林霉素 - ≤10 11～12 ≥13萘啶酸 - / / /
如表4所示，屎肠球菌RS3对氨苄西林霉素敏感；对四环素、万古霉素、红霉素的敏感性为中介；对头孢噻吩、青霉素、苯唑西林霉素具有耐药性。
3 结论
为了明确新分离得到的屎肠球菌RS3的菌株生长特性，为其开发为益生菌剂提供数据支持，本文对泡菜源屎肠球菌RS3进行了全面系统的鉴定，得到以下结论：（1）屎肠球菌RS3为兼性厌氧菌、革兰氏阳性菌，菌落为乳白色圆形、大而光滑、质地均匀、不透明、边缘整齐，菌体细胞为椭圆形，成团簇状或短链状分布，菌体无明显运动，只做布朗运动；（2）屎肠球菌RS3可特征性发酵L-阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖酸盐、丙酮酸盐、丝氨酸、蔗糖、甘露醇、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖及菊粉，与山梨醇、D-棉子糖、柠檬酸盐、苹果酸盐、精氨酸和甘油等无明显反应，菌体中过氧化氢酶的含量为（1 507.39±15.90）U/g，与细胞色素氧化酶检测滤纸反应呈阳性；（3）屎肠球菌RS3在脱脂牛奶培养基中发酵培养，发酵终点总酸含量为（6.01±0.10）g/L，其中乳酸含量为 5.73 g/L；（4）屎肠球菌RS3生长的迟缓期为0～2 h，对数期为2 h～8 h，稳定期为8 h～12 h；（5） 屎肠球菌RS3代谢产物中的主要特征脂肪酸为十四碳烷酸、十六碳烷酸、十六碳烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸；（6）屎肠球菌RS3对氨苄西林霉素敏感，对四环素、万古霉素、红霉素的敏感性为中介，对头孢噻吩、青霉素、苯唑西林霉素具有耐药性。
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