酶活性是酶和酶制剂的挖掘、创制、研究、生产、分离纯化及应用的一个必不可少的参数，以其在特定的温度等试验条件下所催化的反应的速率表示[1-4]。现有测定酶活性的“两点法”从混合试液启动酶催化反应到终止反应的酶催化反应时长往往长达数分钟甚至数十分钟[5-12]，不能满足高通量测定的需要，不能实现在线监控联动控制要求的实时分析。另一方面，如果酶催化反应时长延长到酶的初始催化反应速率以外（图1中的BC时间段），则测定值降低，影响到酶活性检测结果的准确性、重现性和可比性[13]。酶制剂评价体系与标准体系的不统一，尤其体现在工业酶制剂领域，酶活性标准和应用性能评价差异较大，无法客观评价国内外酶制剂以及国内不同厂家酶制剂产品特性。
图1 酶催化反应速率曲线
Fig.1 Enzymatic reaction rate curve
A、B和C代表3个反应时间点。
本文搭建了一个在酶的恒温催化反应过程中进行吸光度检测的恒温反应分光光度系统，酶的催化反应在分光光度计的比色皿中进行，以水浴恒温比色皿架夹层的循环水准确控制比色皿内酶催化反应体系的温度，可以精确地测定催化过程中反应体系吸光度、透光率的实时变化值。以漆酶活性的测定为研究对象，选用了漆酶活性检测中使用最多的 2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐 [2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]作为底物，考察了ABTS浓度、溶氧浓度和酶浓度的适宜范围，建立了基于初始催化反应速率的漆酶活性快速测定方法，大幅度简化了操作流程。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
漆酶通过冬生多孔菌（Polyporus brumalis TIB.BPE 11072，中国科学院天津工业生物技术研究所保藏）液体发酵获得，制备的原酶液浓度为n。ABTS：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
紫外-可见分光光度计（TU-1810PC）、水浴恒温比色皿架（CH181-1）：中国PERSEE公司；恒温循环水浴（Proline RP1845C）：德国LAUDA公司；溶氧测定仪（HQ40d）：美国HACH公司。
1.3 恒温反应分光光度系统
紫外-可见分光光度计使用水浴恒温比色皿架，通过管路外接高精度的恒温循环水浴，以准确控制比色皿内反应体系的温度。酶的恒温催化反应进行的同时检测该反应体系的吸光度。
1.4 漆酶催化的产物浓度、底物ABTS浓度及漆酶活性的测定
将浓度为n的原酶液适当稀释，制备待测酶液。
取2.7 mL 0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和0.2mL特定浓度的ABTS溶液置于光程为1 cm的比色皿中，加入0.1mL待测酶液，振荡混合启动反应，将比色皿置于水浴恒温比色皿架内，于波长420 nm实时测定酶催化反应体系的吸光度。以加热煮沸5 min的相同浓度的灭活待测酶液作对照。
1.4.1 产物浓度
产物浓度的计算公式如下。
式中：CP为产物浓度，mmol/L；A为420 nm处的吸光度值；ε420为ABTS氧化产物的摩尔消光系数，36 000 L/（mol·cm）。
1.4.2 底物ABTS浓度
底物ABTS浓度的计算公式如下。
式中：CABTS为 ABTS 浓度，mmol/L；CABTS-i为反应体系中初始ABTS浓度，mmol/L；A为420nm处的吸光度值；ε420为ABTS氧化产物的摩尔消光系数，36000L/（mol·cm）。
1.4.3 底物ABTS的转化率
底物ABTS的转化率计算公式如下。
式中：R为底物ABTS的转化率，% ；A为420nm处的吸光度值；CABTS-i为反应体系中初始ABTS浓度，mmol/L；ε420为ABTS氧化产物的摩尔消光系数，36 000 L/（mol·cm）。
1.4.4 漆酶活性
漆酶活性定义：以每分钟氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。漆酶活性计算公式如下。
式中：U为待测酶液的漆酶活性，U/mL；V为反应总体积，mL；A1和A2为两个不同检测时间点的420 nm吸光度值；v为待测酶液的体积，mL；t为检测时长，即A1和A2两个检测时间点之间的时间间隔，min；L为比色皿的光程，cm。
1.5 漆酶催化反应体系中溶氧浓度的测定
将装有0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和特定浓度ABTS溶液的试剂瓶充分振荡后置于设定温度的恒温水浴中，将溶氧测定仪探头浸于试剂瓶的液体中，待溶氧浓度恒定后，加入1 mL待测酶液，振荡混合，连续测定反应体系中的溶氧浓度。
2 结果与分析
2.1 酶活性检测过程中底物和溶氧浓度的适宜范围
在不同温度考察漆酶活性检测的反应体系中，当ABTS浓度足够大时溶氧的变化，以及当溶氧浓度足够大时ABTS的变化规律，寻找在设定的酶活性测定反应过程中适宜的溶氧浓度范围和适宜的ABTS浓度范围，结果见图2。
图2 不同温度的漆酶活性测定体系中溶氧浓度、ABTS浓度及产物浓度的变化
Fig.2 Changes of dissolved oxygen concentration，ABTS concentration and product concentration in laccase activity detection system at different temperatures
a.溶氧浓度；b.ABTS浓度及产物浓度。
由图2可知，反应体系中的ABTS浓度和溶氧浓度表现出一致的变化趋势：起初其浓度足够高时，漆酶催化反应速率最大并在短时间内保持不变，此时的催化反应速率为初始催化反应速率；在试验温度范围内，随着温度的升高，初始催化反应速率增大；但随着反应的进行，ABTS或溶氧消耗，催化反应速率逐渐减小，甚至趋向于零；在图2a中，由于温度升高反应体系中初始溶氧浓度呈现显著的降低趋势。对比图2a和图2b，当ABTS浓度足够大时，溶氧含量逐渐趋近零；而即便溶氧浓度足够大也不能使ABTS全部被催化氧化成产物。
酶浓度（Clac）和 ABTS 的初始浓度（CABTS-i）对 ABTS氧化产物最高生成浓度（CP-h）和ABTS最高转化率（Rh）的影响见表1。
表1 Clac和 CABTS-i对CP-h和Rh的影响
Table 1 Effects of Clacand CABTS-ion CP-hand Rh
ClacCABTS-i/（mmol/L）CP-h（mmol/L）Rh/% 0.012 5n 0.065 0.040 3 62.00 0.025 0n 0.065 0.040 3 62.00 0.037 5n 0.065 0.040 3 62.00 0.050 0n 0.065 0.040 3 62.00 0.062 5n 0.065 0.040 3 62.00 0.075 0n 0.065 0.040 3 62.00 0.031 25n 0.026 0.020 9 80.38 0.031 25n 0.039 0.029 8 76.41 0.031 25n 0.052 0.035 7 68.65 0.031 25n 0.065 0.040 3 62.01 0.031 25n 0.078 0.042 6 54.62 0.031 25n 0.091 0.043 6 47.91
由表1可知，Clac对Rh无影响；但是当CABTS-i增加时，CP-h逐渐增加，但增幅逐渐变小，Rh逐渐减小。漆酶催化氧化作用符合乒乓机制[14-17]，图2和表1结果显示，ABTS氧化产物升高至一定程度时会抑制该催化氧化反应的进行，因此，ABTS无法全部被催化氧化；而溶氧被还原并与氢离子结合形成的水分子不会反映抑制反应的进行，当ABTS浓度足够大，反应时间足够长时，溶氧会全部被还原形成水分子。
在漆酶活性检测过程中，当ABTS和溶氧浓度均足够大时，曲线斜率最大并保持不变[18]，此时的催化反应速率是初始催化反应速率，可以代表漆酶的催化能力，体现了该酶分子的特性，这样的检测结果重现性好，使不同来源、不同酶学性质、不同纯度的漆酶及其酶制剂的酶活性数据更具可比性。随着催化反应的进行，任何一种底物无论ABTS还是溶氧降低到一定浓度，均会降低催化反应速率，因而此时ABTS与溶氧的消耗速率均无法真正反映漆酶的催化能力[13]。溶氧的浓度直接影响漆酶的催化反应速率[19]，在测定漆酶活性的实践中，通常不再通过搅拌或通入氧气等手段提高反应体系的溶氧浓度，而是采取降低酶浓度的方式使之与溶氧和ABTS的浓度相匹配，检测漆酶的初始催化反应速率。为此，考察了不同酶浓度的酶活性检测体系中溶氧浓度及ABTS浓度随检测时间的变化规律，结果见图3；同时通过图3得到了酶浓度（Clac）对初始催化反应速率（VO2-i和VABTS-i）、使漆酶保持初始催化反应速率的ABTS的最低浓度（CABTS-l）或溶氧的最低浓度（CO2-l）以及使漆酶保持初始催化反应速率的最长检测时间（T）的影响，结果见表2和表3。
图3 检测体系中不同漆酶浓度对溶氧浓度及ABTS浓度随检测时间变化的影响
Fig.3 Influences of different laccase concentrations in the detection system on the changes of DO concentration and ABTS concentration with the test time
a.溶氧浓度；b.ABTS浓度。
表2 Clac对 VO2-i、CO2-l和 T 的影响
Table 2 Experimentally observed VO2-i，CO2-l，and T for different Clac
ClacVO2-i/[×10-5mmol/（L·s）]CO2-l/（×10-2mmol/L）T/s 0.093 750n 16.67 10.84 310 0.140 625n 25.00 11.44 184 0.187 500n 33.34 11.89 128 0.234 375n 41.67 12.24 87 0.281 250n 50.01 12.50 72
表3 Clac对 VABTS-i、CABTS-l和 T 的影响
Table 3 Experimentally observed VABTS-i，CABTS-land T for different Clac
ClacVABTS-i/[×10-5mmol/（L·s）]CABTS-l/（×10-2mmol/L）T/s 0.012 500n 8.89 4.89 182 0.025 000n 17.78 5.11 75 0.037 500n 26.67 5.31 37 0.050 000n 35.56 5.50 18 0.062 500n 44.45 5.67 9
通过比较图3a和图3b发现，溶氧浓度的变化趋势与ABTS相似，即随着酶浓度的增加，初始曲线斜率增大，代表初始催化反应速率升高，而且初始催化反应速率与酶浓度呈正比关系（表2和表3），进一步证实了准确测定初始催化反应速率对于酶活性定量测定的重要性。使漆酶保持初始催化反应速率时ABTS的最低浓度（CABTS-l）和溶氧的最低浓度（CO2-l）是漆酶活性检测的关键参数，随着酶浓度（Clac）的增加，CABTS-l和CO2-l逐渐增大（表2和表3），这是由于酶浓度越高，使酶饱和所需要的溶氧浓度和ABTS浓度越高。由图3a和图3b可以看出，随着反应的进行，当ABTS浓度低于CABTS-l或溶氧低于CO2-l，曲线斜率开始变小，催化反应速率下降。因此，在酶活性测定过程中，溶氧及ABTS浓度均不应低于使漆酶保持初始催化反应速率时所要求的最低浓度。
通过表2和表3还发现，随着酶浓度的增加，T逐渐减小，在本试验条件下，当Clac增加至0.062 5n，T仅为9 s。当检测时间大于T时，得到检测结果就不是酶的初始催化反应速率。该结果进一步说明：现有的“两点法”测定漆酶活性（ABTS法），多规定反应的两个检测时间点之间的检测时长为3 min，得到的结果或许并非初始催化反应速率。
本研究通过在恒温反应过程中实时测定吸光度，可以连续得到多个产物或ABTS的浓度，如果发现ABTS浓度已降低至CABTS-l以下，则可截取曲线前段的直线部分的数据进行计算，从而避免由于溶氧或ABTS浓度降低而引起的误差。
2.2 温度的控制
利用恒温反应分光光度系统测定漆酶活性，反应体系经混合均匀才开始测定吸光度，因此，我们从理论上预期，在漆酶活性测定的前期，ABTS和溶氧浓度相对酶的浓度足够大，催化反应速率保持最大，曲线的斜率不会发生变化（如图1的A和B点之间），即ABTS氧化产物生成量与检测时间呈线性关系。但在试验中发现在420 nm处测定的代表产物生成量的吸光度随检测时间变化（图4）的斜率是变化的，与预期的直线不同。
图4 未经预热的漆酶活性检测体系的吸光度变化
Fig.4 Absorbance changes of laccase activity detection system without preheat
由图4可以看出，反应初期的曲线斜率呈逐渐增大趋势，在68 s以后斜率稳定。这可能是由于酶催化反应的试液、待测酶液的温度是室温，而酶催化反应的设定温度为55℃。将上述室温的液体在比色皿中混合均匀即放入水浴恒温比色皿架开始吸光度的测定，吸光度测定开始后反应体系的温度逐渐上升，在68 s以后达到设定温度，是反应体系的温度影响了催化反应速率。
为验证该设想，研究了当Clac为0.025 000n时，酶活性测定所用试液未经预热，不同催化反应温度反应体系的吸光度值随检测时间的变化，结果见图5a，并将所用试液预热后重新测定的不同催化反应温度反应体系的吸光度值随时间的变化结果见图5b。
图5 不同温度有无预热漆酶活性检测体系的吸光度变化
Fig.5 Absorbance changes of laccase activity detection system with and without preheat at different temperatures
a.未预热处理；b.预热处理。
由图5a可知，在酶活性测定所用试液未经预热的情况下，随着设定温度的提高，曲线斜率达到稳定值所需要的时间延长，即设定温度与室温差距越大，体系达到设定温度所需的时间越长。我们将酶活性测定所用的试液和待测酶液置于与催化反应温度相同的水浴中进行充分预热，使其温度达到酶活性检测的设定温度。重新测定的不同催化反应温度反应体系的吸光度值随时间的变化结果见图5b。由图5b可知，曲线均为一条斜率几乎无变化的直线（R2≥0.999 9）。这一结果再次证明了温度对酶活性测定的影响。
2.3 检测时长的缩短
多数文献将测定漆酶活性所用的“两点法”的检测时长定为180 s或更长[11，20-21]。由于在初始催化反应阶段产物的生成量与时间呈线性关系，只需任意截取其中的一段直线，即可计算得到基于初始催化反应速率的酶活性。因而设想是否可以仅用两个相邻的吸光度检测点的吸光度值来计算酶活性，从而大幅度缩短酶活性的检测时长。
为此，在相同的反应条件下开展了不同检测时长的多组试验，每组3个平行，各组试验酶活性测定结果的平均值见表4。
表4 不同检测时长对酶活性测定结果的影响
Table 4 Effect of test duration on the detection results of laccase activity
注：采用方差分析法中的Duncan's multiple range test方法分析，同列相同字母表示无显著性差异（p≤0.05，n=3）。
检测时长/s读取吸光度值的次数平均酶活性/（U/mL）1 2 0.160 4±0.00 01a 0.160 6±0.00 02a 10 11 0.160 3±0.00 04a 30 31 0.160 4±0.00 01a 90 91 0.160 3±0.00 00a 150 151 0.160 4±0.00 03a 180 181 0.160 5±0.00 01a 2 3
本试验的检测系统读取吸光度值的最小时间间隔为1 s。由表4可知，即使将检测时长缩短至1 s（吸光度值的读取时间点可以是第0 s和第1 s），酶活性的测定值与检测时长为180 s的测定值无差异，检测时长的缩短对测定结果无影响。这不仅显著提高测定效率，而且这样短的检测时长更能使酶保持初始催化反应速率，进一步避免了酶浓度和底物浓度给检测结果带来的影响。
3 结论
以恒温反应分光光度系统测定漆酶活性，酶的恒温催化反应与吸光度的实时检测在同一时空进行，实现了检测过程中酶催化反应温度的精确控制及催化反应时长的精确计量，大幅度降低因计量而引起的误差。而且，由于可以在酶恒温催化反应的同时实时监测产物或底物浓度及催化反应速率的变化，一方面，可以避免反应过程中因ABTS和溶氧的消耗而引起测定结果的误差，确保通过初始催化反应速率计算酶活性，测定结果准确。另一方面，由于初始催化反应速率是酶的特征指标，因而重现性好，更便于不同漆酶及其制剂酶活力的比较。在此基础上，本研究建立的“三点法”，不仅显著缩短了检测时长，而且大幅度降低了ABTS和待测酶液的浓度，节省试剂成本。由于该方法不需要在催化反应后进行终止反应的操作，简化了操作程序，进一步缩短了检测全过程消耗的总时长。
[1]AN Q,HAN M L,BIAN L S,et al.Enhanced laccase activity of white rot fungi induced by different metal ions under submerged fermentation[J].BioResources,2020,15(4):8369-8383.
[2]GURKOK S,OZDAL M.Purification and characterization of a novel extracellular,alkaline,thermoactive,and detergent-compatible lipase from Aeromonas caviae LipT51 for application in detergent industry[J].Protein Expression and Purification,2021,180:105819.
[3]ABD ELLATIF S,EL-SHEEKH M M,SENOUSY H H.Role of microalgal ligninolytic enzymes in industrial dye decolorization[J].International Journal of Phytoremediation,2021,23(1):41-52.
[4]T
LEK A,KARATA
E,
AKAR M M,et al.Optimisation of the production and bleaching process for a new laccase from Madurella mycetomatis,expressed in Pichia pastoris:From secretion to yielding prominent[J].Molecular Biotechnology,2021,63(1):24-39.
[5]樊艳平.绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及抗豆象机理研究[D].太谷:山西农业大学,2018.FAN Yanping.Study on extraction,purification of mung bean trypsin inhibitor and mechanism of resistance to Callosobruchus chinensis(L.)[D].Taigu:Shanxi Agricultural University,2018.
[6]孙倩.三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究[D].北京:中国农业大学,2016.SUN Qian.Purification,characterization and application of three proteases from different resources[D].Beijing:China Agricultural University,2016.
[7]MIYABE R,TAKAHASHI Y,MATSUFUJI H,et al.Purification and partial characterization of an X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus gasseri ME-284[J].Food Science and Technology Research,2015,21(3):445-451.
[8]MEJIAS L,CERDA A,BARRENA R,et al.Microbial strategies for cellulase and xylanase production through solid-state fermentation of digestate from biowaste[J].Sustainability,2018,10(7):2433.
[9]ALHELLI A M,ABDUL MANAP M Y,MOHAMMED A S,et al.Response surface methodology modelling of an aqueous two-phase system for purification of protease from Penicillium candidum(PCA 1/TT031)under solid state fermentation and its biochemical characterization[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(11):1872.
[10]HU H L,VAN DEN BRINK J,GRUBEN B S,et al.Improved enzyme production by co-cultivation of Aspergillus niger and Aspergillus oryzae and with other fungi[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65(1):248-252.
[11]BATISTA-GARCíA R A,BALCÁZAR-LÓPEZ E,MIRANDA-MIRANDA E,et al.Characterization of lignocellulolytic activities from a moderate halophile strain of Aspergillus caesiellus isolated from a sugarcane bagasse fermentation[J].PLoS One,2014,9(8):e105893.
[12]DING Z Y,CHEN Y Z,XU Z H,et al.Production and characterization of laccase from Pleurotus ferulae in submerged fermentation[J].Annals of Microbiology,2014,64(1):121-129.
[13]ILLANES A.Enzyme biocatalysis[M].Dordrecht:Springer Netherlands,2008.
[14]JONES S M,SOLOMON E I.Electron transfer and reaction mechanism of laccases[J].Cellular and Molecular Life Sciences:CMLS,2015,72(5):869-883.
[15]KALLIO J P,ROUVINEN J,KRUUS K,et al.Probing the dioxygen route in Melanocarpus albomyces laccase with pressurized xenon gas[J].Biochemistry,2011,50(21):4396-4398.
[16]PIETRA F.On dioxygen permeation of MaL laccase from the thermophilic fungus Melanocarpus albomyces:An all-atom molecular dynamics investigation[J].Chemistry&Biodiversity,2016,13(11):1493-1501.
[17]DAMAS J M,BAPTISTA A M,SOARES C M.The pathway for O2 diffusion inside CotA laccase and possible implications on the multicopper oxidases family[J].Journal of Chemical Theory and Computation,2014,10(8):3525-3531.
[18]AKTA
N,
I
EK H,TA
PıNAR
NAL A,et al.Reaction kinetics for laccase-catalyzed polymerization of 1-naphthol[J].Bioresource Technology,2001,80(1):29-36.
[19]AKTA
N,TANYOLA
A.Reaction conditions for laccase catalyzed polymerization of catechol[J].Bioresource Technology,2003,87(3):209-214.
[20]YAN J P,CHEN Y H,NIU J Z,et al.Laccase produced by a thermotolerant strain of Trametes trogii LK13[J].Brazilian Journal of Microbiology:[Publication of the Brazilian Society for Microbiology],2015,46(1):59-65.
[21]SONDHI S,SHARMA P,GEORGE N,et al.An extracellular thermo-alkali-stable laccase from Bacillus tequilensis SN4,with a potential to biobleach softwood pulp[J].3 Biotech,2015,5(2):175-185.