黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的有毒次级代谢物，具有分布广、毒性强的特点，常污染花生、核桃、玉米等产品[1-3]，严重威胁人体健康，已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物质[4]。为保障食品安全和人体健康，世界各国都对AFB1在食品中的含量制定了最高限量标准，其中欧盟最为严格，将花生中AFB1最高限量标准定为2 mg/kg，新加坡和日本的最高限量标准分别设置为5 mg/kg和10mg/kg[5]。我国标准GB2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》将花生中AFB1最高限量标准设置为20mg/kg[6]。因此，开发食品中黄曲霉快速检测方法对食品安全监控和人体健康保障具有重要意义。传统的真菌毒素检测方法主要有高效液相色谱法[7-8]、质谱法[9]等，存在仪器设备昂贵、操作技术要求高、检测费时等不足[10-11]；近年来发展的免疫分析法虽然具有灵敏度高、特异性强的优点，但同样存在抗体制备繁琐耗时、免疫反应需要多步递进和反复洗涤以及成本高等缺点[12-14]。
核酸适配体，又称“化学抗体”，是一种能折叠成特定的三维结构，以较高亲和力和特异性识别各种靶标分子的单链寡核苷酸序列，通常通过体外合成技术——指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 制备获得，无需动物实验，合成方便且制备成本低[15-16]。作为一种新型分子识别探针，在食品安全检测尤其是真菌毒素检测方面受到广泛关注和研究[17-18]。Zhu等[19]利用核酸适配体作为分子探针构建了一种双竞争横向测流试纸条并成功用于多种食品和饲料样品中黄曲霉毒素的检测。Geleta等[20]合成了一种还原氧化石墨烯/二硫化钼/聚苯胺纳米复合材料，并以此构建了一种电化学适配体传感器，该传感器对AFB1具有较好的选择性、灵敏性和稳定性。
氧化石墨烯（graphite oxide，GO）是石墨烯的氧化产物，由于其合成方便、具有较好的亲水性、分散性以及卓越的荧光猝灭能力，在食品安全检测领域得到了广泛应用[21-22]。本试验以AFB1为检测对象，利用氧化石墨烯纳米片建立一种荧光核酸适配体生物传感器，通过优化试验条件应用于花生样品的检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生米：市售。黄曲霉毒素核酸适配体TAF序列具体为 5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3'[23]，其 5'端标记有四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）荧光基团，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和纯化（HPLC级）。黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏马菌素（fumonisin B1，FB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：青岛普瑞邦生物工程有限公司；氧化石墨烯水溶液：江苏先丰纳米材料科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化钠、氯化钙、六水合氯化镁：上海麦克林生化科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Spectra Max i3多功能酶标仪：美国Molecular Devices公司；HR-AFM原子力显微镜：美国AFM Workshop公司；Centrifuge 5427 R冷冻高速离心机：德国艾本德eppendorf公司；RS-FS1401多功能粉碎机：合肥荣事达小家电有限公司；PHS-25型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Medium-e400 up超纯水仪：上海和泰仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 氧化石墨烯浓度优化
分别取100 nmol/L核酸适配体溶液200 μL加入到等体积不同浓度氧化石墨烯溶液中（0、5、10、20、30、40 μg/mL）， 并用 pH7.4 的结合缓冲溶液（binding buffer，BB，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2·6H2O，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl）补至总体积为 500μL，使氧化石墨烯终浓度为 0、2、4、8、12、16 μg/mL，混匀后每孔取200 μL测定其荧光强度（激发波长547 nm，发射波长584 nm），试验设3个平行取平均值。所有操作均在避光条件下进行，以不加GO为对照组。
1.3.2 核酸适配体浓度优化
根据1.3.1结果取最佳浓度的氧化石墨烯溶液200 μL 和等体积不同初始浓度的适配体（70、80、90、100、110、120、130 nmol/L） 于 1.5 mL 棕色离心管中混合，补加BB缓冲溶液至500 μL，则适配体终浓度分别为 28、32、36、40、44、48、52 nmol/L。 室温下避光孵育20 min后用酶标仪测定其荧光强度（激发波长547 nm，发射波长584 nm），试验设3个平行，取平均值。
1.3.3 孵育时间优化
采用酶标仪荧光动力学模式进行氧化石墨烯和适配体孵育时间的优化，具体程序设置如下：延迟3 s，振板5 s，运行时长5 min，检测间隔20 s。取一定体积最佳浓度适配体溶液先进行动力学试验5 min后，立即快速加入等体积最佳浓度氧化石墨烯溶液，然后按照上述程序进行荧光动力学试验。
1.3.4 检测时间优化
最佳检测时间同样采用动力学试验进行优化。设置程序如下：延迟3 s，振板5 s，运行时长45 min，检测间隔20 s。在1.3.3步骤优化结果基础上，向氧化石墨烯/适配体孵育体系中加入一定体积AFB1溶液（终浓度为0.5 μg/mL），按照上述程序进行荧光动力学试验。
1.3.5 检测灵敏度分析
在优化试验基础上，分别取等体积氧化石墨烯溶液和适配体溶液于1.5 mL离心管中混匀，室温下避光孵育最佳时间后，加入100 μL一系列不同浓度AFB1（终浓度分别为 0、1、5、10、50、100、200 ng/mL），继续混匀避光孵育最佳时间后，每孔分别取200 μL测定其荧光强度，试验设置3个平行，取平均值。记对照组（不加AFB1组）的荧光强度为F0，试验组荧光强度为Fi。以ΔF（ΔF=Fi-F0）为纵坐标，以AFB1浓度为横坐标作标准曲线，根据标准曲线计算检测限。
1.3.6 特异性分析
以与AFB1结构或功能类似的FB1、OTA、ZEN 3种真菌毒素代替靶标进行试验方法的特异性分析。取最佳浓度的氧化石墨烯溶液和适配体溶液各200 μL，待孵育完全后分别加入上述3种毒素（终浓度500 ng/mL）和AFB1各100 μL，室温混匀孵育后分别测定其荧光强度记为Fi。对照组以100 μL BB缓冲溶液代替毒素，其荧光强度记为F0。根据荧光强度变化情况ΔF（ΔF=Fi-F0）分析检测方法的特异性。
1.3.7 样品检测
花生米样品预处理参考Ye等[24]的方法进行处理，略有改动。将花生米样品用粉碎机粉碎，再用研钵捣碎较大颗粒后研磨成粉末。准确称取粉末样品5.0 g于50 mL透明离心管中，并加入25 mL 50% 甲醇溶液涡旋振荡30 min，室温静置25 min后在4℃下冷冻离心20 min（5 000 r/min），收集上清液过滤后即为花生米空白提取液。在空白提取液中加入不同浓度（5、50、200 ng/mL）的AFB1溶液，充分振荡。按照1.3.5步骤进行检测，根据所得检测值和实际添加浓度计算回收率。回收率按以下公式进行计算。
1.4 数据分析
试验均设置3个平行，荧光强度值采用平均值±标准差表示，试验所得数据利用Origin 8.5软件进行分析作图。
2 结果与分析
2.1 检测原理
本试验所构建的检测方法原理如图1所示。
图1 氧化石墨烯-核酸适配体传感器检测原理
Fig.1 Schematic presentation of graphene oxide-based fluorescence aptasensor assay
因为氧化石墨烯表面存在着含氧官能团和共轭结构，它能够将TARMA荧光基团标记的核酸适配体通过π-π碱基堆积作用非共价固定在氧化石墨烯表面，这样由于荧光基团与GO靠近而发生荧光共振能量转移，适配体上的荧光被猝灭。在体系中没有AFB1的情况下，核酸适配体仍然被吸附在GO表面，荧光强度基本保持不变。当体系中存在AFB1时，由于适配体与AFB1的高亲和性，使得适配体从GO上解离下来而与AFB1结合，荧光基团远离GO，从而荧光强度得到恢复。因此，可以根据体系荧光强度前后变化与AFB1浓度之间的关系实现AFB1的检测。
2.2 氧化石墨烯纳米片表征及浓度优化
氧化石墨烯纳米片的原子力显微镜表征及浓度优化结果见图2。
图2 GO表征及浓度优化结果
Fig.2 Characterization and concentration optimization of graphene oxide
a.GO的原子力显微镜表征图；b.GO浓度对荧光强度的影响。
由图2a可以看出，氧化石墨烯呈明显的片状单层结构，其平均宽度约为0.5 μm，平均厚度为2 nm，平均径厚比为250∶1，有利于核酸适配体的吸附。
由图2b可以看出，随着氧化石墨烯浓度的增加，核酸适配体荧光强度逐渐降低，当氧化石墨烯浓度大于12 μg/mL时，核酸适配体的荧光强度下降不明显，基本保持不变。这说明12 μg/mL的氧化石墨烯基本能将40 nmol/L浓度核酸适配体的荧光信号猝灭完全。因此，确定氧化石墨烯的最佳终浓度为12 μg/mL。
2.3 核酸适配体TAF浓度优化
图3是核酸适配体荧光强度在最优氧化石墨烯浓度条件下的猝灭效果图，即核酸适配体TAF浓度的优化结果图。
图3 核酸适配体TAF浓度优化结果
Fig.3 Concentration optimization of TAF aptamer
从图3可以看出，在氧化石墨烯浓度12μg/mL猝灭条件下，随着核酸适配体TAF浓度的增加，荧光强度逐渐增大，当适配体浓度大于36nmol/L时，体系的荧光强度逐渐增加，而当继续增加适配体的浓度至44 nmol/L时，荧光强度迅速上升。这说明36 nmol/L是适配体TAF的荧光被12 μg/mL浓度氧化石墨烯基本猝灭的临界点。但为了确保适配体的荧光能完全被氧化石墨烯猝灭，最终确定32 nmol/L为适配体最佳终浓度。
2.4 孵育时间优化
氧化石墨烯与核酸适配体TAF孵育时间荧光动力学试验结果见图4。
图4 氧化石墨烯猝灭适配体荧光时间动力学试验结果
Fig.4 Real-time fluorescence kinetic test of aptamer by graphene oxide
从图4可以看出，在未加入氧化石墨烯时（前300 s），适配体的荧光强度较强，当加入氧化石墨烯后，体系荧光强度迅速降低，至550 s后体系荧光强度降到最低并保持稳定。这说明加入氧化石墨烯后，经过约250 s后TAF适配体荧光强度基本被猝灭完全，即此时核酸适配体基本完全吸附在氧化石墨烯表面。因此，扣除加注氧化石墨烯时间（10 s），核酸适配体和氧化石墨烯的最佳孵育时间为240 s，即孵育4 min后可进行下一步试验。
2.5 检测时间优化
荧光动力学试验优化确定最佳检测时间结果如图5所示。
图5 检测时间优化动力学试验结果
Fig.5 Real-time fluorescence kinetic test of the detection
由图5可以看出，在GO/适配体孵育体系中，没有AFB1存在情况下（前5 min），由于TAMRA荧光标记的适配体已经被完全吸附在氧化石墨烯表面，荧光被猝灭并处于一个较低值水平；当向体系中加入AFB1后，其荧光强度随着时间的延长而不断增强，当时间达到32 min后，荧光强度趋于平缓，基本不再增强。这主要是由于核酸适配体TAF与AFB1具有较强的亲和性，适配体逐渐被AFB1从氧化石墨烯表面解离下来而特异性结合，荧光得到增强。因此，当加入待分析样品27 min后（扣除加入样品前5 min的动力学试验时间），体系荧光强度基本不再增强，而趋于稳定，可进行样品分析检测。考虑到优化的GO/适配体最佳孵育时间4 min，因此整个方法从上样到出检测结果约需30 min左右，检测时间相对较快。
2.6 方法性能分析及应用
标准曲线及特异性试验结果见图6。
图6 标准曲线及特异性试验结果
Fig.6 Results of standard curve and specificity test
a.标准曲线；b.特异性试验。
从图6a可以看出，ΔF与AFB1浓度具有良好的对数关系，其方程为y=4 295.23lnx+5 662.90，R2=0.972 7。根据国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）标准计算得该方法的检测限为2.37 ng/mL，检测范围为2.37 ng/mL～200.00 ng/mL。从图6b可以看出，OTA、FB1和ZEN对体系荧光强度恢复基本上无影响，说明本方法特异性较好，具有较好的选择性。
花生实际样品加标回收试验结果见表1。
表1 花生样品AFB1加标回收试验结果
Table 1 Recovery of aflatoxin B1in peanut samples
加标浓度/（ng/mL）检测值/（ng/mL）回收率/% 5 4.25±0.04 85.0 50 57.19±0.13 114.4 200 209.64±0.03 104.8
由表1可知，在3种不同加标浓度条件下，回收率为85.0% ～114.4% ，说明本方法具有较好的回收率，可用于花生实际样品中AFB1检测。本方法的检测灵敏度和回收率均低于王琦等[25]的研究结果，这可能有两个原因，一是两者所用的适配体序列不一致（相差3个碱基）且标记荧光基团不一样；二是本试验所使用的是花生样品提取液，而文献使用的是白酒样品，无需进行提取预处理，干扰因素相对较少。
3 结论
本试验利用氧化石墨烯纳米片构建了一种AFB1的荧光分析检测方法。经过优化试验条件，该方法的检测范围为2.37 ng/mL～200.00 ng/mL，检测限为2.37 ng/mL，能满足日常检测限量要求。同时该方法具有较好的选择性，基本不受OTA、FB1、ZEN等真菌毒素存在的影响。该方法操作简便、检测耗时短，整个检测完成只需约30 min左右时间，对花生实际样品加标分析，回收率为85.0% ～114.4% ，结果比较可靠，具有潜在的实际应用前景。
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