普鲁兰多糖是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵产生的类似葡聚糖的胞外水溶性黏质多糖[1-2]，其分子是由α-1，4-糖苷键连接3个葡萄糖形成麦芽三糖，并通过α-1，6-糖苷键连接麦芽三糖，形成高分子量线形多糖[3-4]。因其具有水溶性好、易降解、易成膜、阻氧、无毒等特点，已被普遍应用于食品、医药、轻化工和农业等多领域，是一种极具研究价值和应用前景的高新生物制品[5-6]。发酵生产普鲁兰多糖时，发酵液黏度高使菌液分离困难，并且发酵过程中产生的蛋白质也对多糖纯化造成一定的困难。因此，去除这些杂质是普鲁兰多糖纯化过程中的重要步骤。
目前，普鲁兰多糖的菌液分离主要是通过无机絮凝剂絮凝除菌和板框过滤除菌，牛登飞[7]采用三氯化铝絮凝除菌，用乙酸锌和亚铁氰化钾进行澄清，用硅藻土进行过滤；万玉军等[8]使用硅藻土作为助滤剂，板框过滤除菌。传统的除菌方式不仅会造成无机金属离子残留，助滤剂的使用还会产生固体废渣，造成环境污染。常用脱蛋白的方法主要有三氟三氯乙烷法、物理吸附法、Sevag 法[9]、盐析法[10]、三氯乙酸法[11]和蛋白酶法。马丽等[12]采用三氟三氯乙烷法去除螺旋藻多糖中的蛋白质；贺晓晗等[13]采用硅镁类物质吸附去除发酵液中的蛋白质；张璐等[14]采用木瓜蛋白酶法去除多糖发酵液中的蛋白质。传统的化学除蛋白方式，从纯化蛋白的角度讲，有较好的效果，但对普鲁兰多糖发酵液中使用化学方法去除蛋白质的同时，不仅会造成有机试剂的残留，而且多糖损失率较高。
本试验首先从4种生物絮凝剂中选定除菌效果最好的絮凝剂，通过单因素试验和响应面试验优化絮凝除菌工艺。然后从6种酶中选定脱蛋白效果最佳的蛋白酶，除菌后发酵液进行脱蛋白处理，通过单因素和响应面试验优化脱蛋白工艺。再经传统脱色、超滤、浓缩干燥成粉末，测定固体普鲁兰多糖粉末的理化指标。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
出芽短梗霉CGMCC.7055（Aureobasidium pullulans CGMCC.7055）、聚谷氨酸：天津北洋百川生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠、壳聚糖：北京索莱宝生物科技有限公司；海藻酸钠、考马斯亮蓝G-250：天津市大茂化学试剂厂；中性蛋白酶（1.5×105U/mL）、复合蛋白酶（1.4×105U/mL）、碱性蛋白酶（8.6×104U/mL）、木瓜蛋白酶（5.0×103U/mL）、风味蛋白酶（4.0×103U/mL）：北京澜翊康生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50 U/mL）、牛血清蛋白：上海源叶生物有限公司；大孔树脂LX-68M：西安蓝晓科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FE20型pH计：瑞士梅特勒-托利多集团；Tecan SunRise酶标仪：帝肯奥地利责任有限公司；B-260恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；UV-1200型紫外分光光度计：泰亚赛福公司；TDL-5-A型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；SP-1500型喷雾干燥机：上海顺仪试验设备有限公司；SY-MU2050型切向流超滤系统：上海世远生物设备工程有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 普鲁兰多糖发酵液制备
参照张攀等[15]的方法，略作修改，以出芽短梗霉进行发酵，发酵96 h，当普鲁兰多糖达到80 g/L时，待用。
1.3.2 多糖含量及得率的测定
参照宋亚琼等[16]的方法，略作修改，取30 mL普鲁兰多糖溶液，用2倍体积的无水乙醇，搅拌静置一段时间，将沉淀放在已恒重的滤纸上抽滤，放入80℃烘箱中干燥至恒重，称量、记录结果。根据式（1）计算出普鲁兰多糖的含量，按照（2）式计算出普鲁兰多糖的得率。
式中：M为普鲁兰多糖含量，g/L；m为普鲁兰多糖和滤纸总重量，g；m0为空白滤纸质量，g。
式中：W为粗多糖得率，% ；M0为处理后普鲁兰多糖的含量，g；M为处理前普鲁兰多糖的含量，g。
1.3.3 除菌率的测定
取未除菌发酵液1 mL稀释25倍，摇匀，使用酶标仪在620 nm处测定其吸光度，记为A；经过絮凝处理的发酵液，5 000 r/min离心10 min，取上清，稀释25倍在620 nm处测定其吸光度，记为A0。吸光度和菌体含量成正比，以吸光度直接表示菌体含量。吸取200 μL待测液，于620 nm处测溶液的吸光度，除菌率（Y）按照式（3）计算。
1.3.4 蛋白质标准曲线的制作及脱蛋白率的测定
采用考马斯亮蓝法[17]测定普鲁兰多糖发酵液蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品，经波长扫描后在595 nm条件下测定吸光度，得回归方程y=6.151 4x+0.011 1，R2=0.999（x为蛋白含量，mg/mL；y为吸光度），脱蛋白率按照式（4）计算。
式中：X为脱蛋白率，% ；x为处理前样品中蛋白质含量，mg/mL；x0为处理后样品中蛋白质含量，mg/mL。
1.3.5 固体普鲁兰多糖中指标的测定
水分、灰分、单糖、二糖及寡糖含量分别参考GB 5009.3—2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》、GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》、GB 28402—2012《食品安全国家标准食品添加剂普鲁兰多糖》进行测定。
1.4 生物絮凝剂除菌试验
1.4.1 生物絮凝剂的筛选
取100 mL发酵液各4份，考察羧甲基纤维素钠、壳聚糖、海藻酸钠、聚谷氨酸4种生物絮凝剂在添加量0.6 g/L，絮凝温度40℃，絮凝时间30 min，不同pH值下的除菌率，确定最佳生物絮凝剂的类型。
1.4.2 单因素试验
取100 mL发酵液各7份，在絮凝剂的添加量0.6g/L，絮凝温度40℃，絮凝时间30 min的条件下，分别以pH 值 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 进行试验，离心去除菌体，以除菌率和多糖得率为指标，确定最佳pH值。
按照上述试验最优pH值，取100 mL发酵液各6份，在絮凝剂的添加量0.6 g/L，絮凝时间30 min的条件下， 分别以絮凝温度 20、30、40、50、60、70 ℃进行试验，离心去除菌体，以除菌率和多糖得率为指标，确定最佳絮凝温度。
按照上述试验最优pH值和絮凝温度，取100 mL发酵液各6份，在絮凝剂的添加量0.6 g/L，分别以絮凝时间 10、20、30、40、50、60 min 进行试验，离心去除菌体，以除菌率和多糖得率为指标，确定最佳絮凝时间。
按照上述试验最优pH值，絮凝温度和絮凝时间的条件下，取100 mL发酵液各6份，分别以壳聚糖添加量 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L 进行试验， 离心去除菌体，以除菌率和多糖得率为指标，确定最佳壳聚糖添加量。
1.4.3 生物絮凝除菌响应面优化试验
在单因素的基础上应用Box-Behnken Design进行响应面优化试验设计（三因素三水平），因素与水平的具体参数见表1。
表1 生物絮凝除菌响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design of biopolymer flocculation in sterilization
水平A1pH值B1絮凝时间/minC1壳聚糖添加量/（g/L）-1 3.0 10 0.6 0 4.0 20 0.8 1 5.0 30 1.0
1.5 酶法脱蛋白试验
1.5.1 蛋白酶的筛选
以脱蛋白率和多糖得率为指标，取经除菌的发酵液100 mL各6份，比较中性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和酸性蛋白酶6种蛋白酶，在各自最适温度，加酶量100 U/mL条件下的脱蛋白率，确定最佳蛋白酶的类型。
1.5.2 单因素试验
取经除菌的发酵液100 mL各7份，在加酶量100 U/mL，酶解温度50℃，酶解2.0h的条件下，分别以pH 值 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 进行试验，90 ℃灭酶5 min，离心去除沉淀后，以脱蛋白率和多糖得率为指标，确定最佳pH值。
取经除菌的发酵液100 mL各6份，按照上述试验最优pH值，在加酶量100 U/mL，酶解2.0 h的条件下，分别以酶解温度 40、45、50、55、60、65 ℃进行试验，90℃灭酶5 min，离心去除沉淀后，以脱蛋白率和多糖得率为指标，确定最佳酶解温度。
取经除菌的发酵液100 mL各7份，按照上述试验最优pH值和酶解温度，在加酶量100 U/mL条件下，分别以酶解时间 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 进行试验，90℃灭酶5 min，离心去除沉淀后，以脱蛋白率和多糖得率为指标，确定最佳酶解时间。
取经除菌的发酵液100 mL各6份，按照上述试验最优pH值，酶解温度和酶解时间，分别以加酶量20、40、60、80、100、120 U/mL 进行试验，90 ℃灭酶 5 min，离心去除沉淀后，以脱蛋白率和多糖得率为指标，确定最佳加酶量。
1.5.3 酶法脱蛋白响应面优化试验
在单因素的基础上应用Box-Behnken Design进行响应面优化试验设计（四因素三水平），因素与水平的具体参数见表2。
表2 酶法脱蛋白响应面试验因素及水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design of enzymatic deproteinization
水平 A2pH值 B2酶解温度/℃C2酶解时间/h D2加酶量/（U/mL）-1 8.0 40 0 8.5 45 1 9.0 50 2.0 2.5 3.0 60 80 100
1.6 树脂脱色
取经脱蛋白后的发酵液，按照5 BV/h进行大孔树脂脱色试验，当滤液为淡黄色或无色，收集滤液。
1.7 超滤、浓缩
取经脱色后的发酵液进行超滤除盐，经截留分子量10 kDa超滤膜组件，水洗6次后，浓缩至5% ，收集滤液。
1.8 干燥
取经超滤浓缩后的滤液，设置进风温度为180℃，出风温度为85℃，进料速度为25 mL/min，雾化驱动，压力为0.4 MPa，喷雾干燥，得到固体普鲁兰多糖粉末。
1.9 数据处理
采用Design-Expert 8.06软件进行Box-Behnken试验设计和响应面结果分析，用SPSS 25.0软件进行显著性分析，用Origin 2019b软件进行数据处理和绘图。
2 结果与分析
2.1 生物絮凝剂的筛选
不同pH值下生物絮凝剂对普鲁兰多糖发酵液除菌效果的影响见图1。
图1 不同pH值下生物絮凝剂对除菌效果的影响
Fig.1 Effect of biopolymer flocculation on sterilization under different pH values
不同小写字母表示同一样品不同pH值之间存在显著性差异（P＜0.05）。
由图1可知，4种生物絮凝剂中，在相同条件下壳聚糖对普鲁兰多糖发酵液菌体的絮凝效果最好，pH值为3.0～4.0时除菌率可达97.6% 左右。故选壳聚糖进行普鲁兰多糖发酵液絮凝除菌试验。
2.2 壳聚糖絮凝除菌单因素试验结果
2.2.1 pH值对壳聚糖絮凝除菌率的影响
pH值对壳聚糖除菌率的影响见图2。
图2 pH值对壳聚糖除菌效果的影响
Fig.2 Effect of pH value on sterilization of chitosan
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图2可知，pH值是影响絮凝的一个重要因素，在碱性条件下絮凝效果不理想，而酸性条件下效果较好。壳聚糖属于阳离子絮凝剂，整个体系的pH值对絮凝效果影响明显。在碱性条件下，其氨基成电中性，吸附络合能力显著降低[18]；并且普鲁兰多糖发酵液的黏度也受pH值的影响，酸性条件下黏度较低，有利于壳聚糖絮凝菌体分离。当絮凝剂pH值为3.0～4.0时，除菌率较高，分别为97.6% 和96.76% ；多糖得率分别为91.15% 和91.5% 。pH值3.0和pH值4.0壳聚糖除菌效果差异不显著，而且考虑普鲁兰多糖发酵液pH值在4.0～5.0之间，为了节约成本，选择最佳pH值为4.0。
2.2.2 絮凝温度对壳聚糖除菌率的影响
絮凝温度对壳聚糖除菌率的影响见图3。
图3 絮凝温度对壳聚糖除菌效果的影响
Fig.3 Effect of flocculation temperature on the sterilization of chitosan
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图3可知，随着絮凝温度的升高，壳聚糖絮凝除菌率缓慢上升，多糖得率逐渐上升，温度达到40℃时除菌率和多糖得率达到最高，分别为98.10% 和95.47% ，且随着温度继续升高，除菌率整体上保持稳定，多糖得率也趋于平缓，说明絮凝温度（＞30℃）对絮凝除菌影响较小。
2.2.3 絮凝时间对壳聚糖除菌率的影响
絮凝时间对壳聚糖除菌率的影响见图4。
图4 絮凝时间对壳聚糖除菌效果的影响
Fig.4 Effect of flocculation time on the sterilization of chitosan
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图4可知，絮凝除菌反应在20 min时除菌率和多糖得率达到最高，分别为98.17% 和93.97% ，随着絮凝时间的增加，除菌率和多糖得率降低，后趋于稳定；可能是因为保温絮凝时间的延长会造成絮凝剂形成的架桥结构逐渐不稳定，菌体逐渐游离出来，而普鲁兰多糖复合到壳聚糖絮凝沉淀中，进而造成除菌效率降低和多糖损失率升高。因此，最优絮凝时间为20 min。
2.2.4 壳聚糖添加量对壳聚糖除菌率的影响
壳聚糖添加量对壳聚糖絮凝除菌率的影响见图5。
图5 壳聚糖添加量对壳聚糖除菌效果的影响
Fig.5 Effect of chitosan addition on the sterilization of flocculation
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图5可知，随着壳聚糖添加量的逐渐增加，絮凝除菌率逐渐升高随后趋于平稳，表明壳聚糖添加量增加到一定程度后，除菌率整体上趋于稳定。此现象属于架桥絮凝机理，絮凝剂用量增加有利于其与菌体充分架桥，当生物高分子絮凝剂覆盖菌体表面大约为50% 时，其絮凝作用最好[19]；用量过多会造成吸附过饱和，使其在每个胶粒上形成覆盖层，再次让胶粒呈现一种稳定状态[20]。所以，整个体系中絮凝剂用量需要适中，过量或少量都达不到理想的絮凝效果。在壳聚糖添加量为0.8 g/L时，除菌效率最高，为98.45% ，多糖得率为91.3% 。因此选择壳聚糖的最佳添加量为0.8 g/L。
2.3 壳聚糖絮凝除菌响应面优化试验结果
2.3.1 响应面试验设计及回归模型的建立
以单因素试验结果为基础，以pH值（A1）、絮凝时间（B1）、壳聚糖添加量（C1）3 个因素为响应变量，以除菌率为响应值（Y1），设计三因素三水平试验17组，结果见表3。
表3 壳聚糖絮凝除菌Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design of chitosan flocculation in sterilization
编号 A1pH值 B1絮凝时间/min C1壳聚糖添加量/（g/L）Y1除菌率/% 1 4.0 20 0.8 98.9 2 4.0 20 0.8 98.9 3 4.0 30 0.6 91.1 4 5.0 20 1.0 95.6 5 5.0 10 0.8 94.9 6 4.0 10 1.0 95.9 7 3.0 10 0.8 94.1 8 4.0 20 0.8 98.6 9 3.0 30 0.8 94.9 10 4.0 30 1.0 95.6 11 5.0 20 0.6 93.2 12 3.0 20 0.6 94.9 13 4.0 20 0.8 97.8 14 5.0 30 0.8 92.3 15 3.0 20 1.0 99.0 16 4.0 10 0.6 94.6 17 4.0 20 0.8 98.8
对表3进行回归分析，得到回归方程：Y1=98.60-0.862 5A1-0.700 0B1+1.54C1-0.85A1B1-0.425 0A1C1+0.800B1C1-1.59A12-2.96B12-1.34C12。对回归方程进行方差分析，结果见表4。
表4 壳聚糖絮凝除菌的回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验
Table 4 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models for chitosan flocculation in sterilization
注：*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方模型 95.452 8 9 10.605 9 A1 5.9512 5 1 5.951 3 B1 3.920 0 1 3.920 0 C1 18.911 3 1 18.911 3 A1B1 2.890 0 1 2.890 0 A1C1 0.722 5 1 0.722 5 B1C1 2.560 0 1 2.560 0 A12 10.611 2 1 10.611 2 B12 36.953 3 1 36.953 3 C12 7.5322 4 1 7.532 2残差 2.782 5 7 0.397 5失拟项 1.922 5 3 0.640 8纯误差 0.860 0 4 0.215 0总和 98.235 3 16 F值26.681 4 14.9717 9.861 6 47.575 5 7.270 4 1.817 6 6.440 3 26.694 8 92.964 3 18.949 0 P值0.000 1 0.006 1 0.016 4 0.000 2 0.030 8 0.219 6 0.038 8 0.001 3 0.000 1 0.003 3显著性******** * ******2.980 60.159 4
由表4可以看出，除菌率模型达到极显著水平（P＜0.01），一次项中pH值和壳聚糖添加量影响极显著，絮凝时间影响显著；根据F值大小，可以判断3个因素对菌体去除率的影响主次顺序为壳聚糖添加量（C1）＞pH 值（A1）＞絮凝时间（B1）；相互作用项 A1B1、B1C1显著（P＜0.05）；模型失拟项不显著（P＞0.05），R2=0.971 7，说明模型具有可行性；同时模型的调整决定系数R2adj为0.935 3，说明模型能够解释试验93.53% 的响应值变化，表明此试验模型与实际数据拟合程度好。
2.3.2 壳聚糖絮凝除菌各因素间交互作用
壳聚糖絮凝除菌各因素间交互作用如图6所示。
图6 各因素交互作用的等高线图和曲面图
Fig.6 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors
由图6可知，pH值和絮凝时间、絮凝时间和壳聚糖添加量的交互作用较强，与表4方差分析中显著性检验结果一致。
2.3.3 响应面优化验证
响应面优化最优条件：pH值为3.71、絮凝时间为20.01 min、壳聚糖添加量为0.96 g/L，在此条件下模型预测的除菌率为99.19% 。结合实际操作的可行性，取絮凝pH值为3.70、絮凝时间为20 min、壳聚糖添加量为0.96 g/L，在此条件下进行3组验证试验，实际得到的除菌率为99.05% 。这与模型预测值较为接近，误差不超过5% ，说明该模型能较好地预测实际情况。
2.4 蛋白酶的筛选
不同酶种类对粗多糖溶液脱蛋白率的影响见图7。
图7 酶种类对粗多糖溶液脱蛋白的影响
Fig.7 Effect of enzymes on deproteinization of crude polysaccharide solution
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图7可知，在不同酶各自最适宜的条件下，碱性蛋白酶的脱蛋白效率最高，且多糖得率也最优，分别为67.5% 和98.55% 。表明普鲁兰多糖发酵液中蛋白质以碱性蛋白质为主，因此选择碱性蛋白酶进行酶解试验。
2.5 碱性蛋白酶脱蛋白单因素试验结果
2.5.1 pH值对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响
pH值对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响见图8。
图8 pH值对碱性蛋白酶脱蛋白的影响
Fig.8 Effect of pH on deproteinization of alkaline protease
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
pH值是影响蛋白酶催化活性的主要因素之一。一方面，pH值会改变底物的带电状态，对底物和蛋白酶的特异性结合产生影响；另一方面，过酸过碱的试验条件下，会破坏蛋白酶的空间结构，导致蛋白酶活性降低甚至失活[21]。由图8可知，pH值为8.0～8.5时，脱蛋白率相对较高。而且pH值对多糖得率影响不显著。因此，确定酶解pH值为8.5，此时脱蛋白率为68.82% 。
2.5.2 酶解温度对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响
酶解温度对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响见图9。
图9 酶解温度对碱性蛋白酶脱蛋白的影响
Fig.9 Effect of enzymolysis temperature on deproteinization of alkaline protease
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图9可知，酶解温度在45℃～50℃时，脱蛋白率相对较高。酶解温度也是影响酶的催化效率的一个重要因素，适当的提高酶解温度可以促进酶催化反应的进行，提高脱蛋白率，但酶解温度过高会导致酶失活，故酶解温度确定为45℃，此时脱蛋白率最高，为69.49% ，多糖得率为98.85% 。因此，选择酶解温度45℃。
2.5.3 酶解时间对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响
酶解时间对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响见图10。
图10 酶解时间对碱性蛋白酶脱蛋白的影响
Fig.10 Effect of enzymolysis time on deproteinization of alkaline protease
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图10可知，当酶解时间为2.5 h时，脱蛋白率最高，为72.76% ，多糖得率为98.38% 。并且酶解时间对多糖得率无显著影响。因此，选择最佳酶解时间2.5 h。
2.5.4 加酶量对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响
加酶量对碱性蛋白酶脱蛋白率的影响见图11。
图11 加酶量对碱性蛋白酶脱蛋白的影响
Fig.11 Effect of enzyme addition on deproteinization of alkaline protease
不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图11可知，当加酶量为60 U/mL～80 U/mL时，脱蛋白率较高。随着加酶量的增加，脱蛋白率开始降低，可能是因为蛋白酶量过多，灭酶不完全造成蛋白含量增加。因此，选择加酶量为80 U/mL，此时脱蛋白率最高，为74.40% ，多糖得率为98.42% 。
2.6 碱性蛋白酶法脱蛋白响应面优化试验结果
2.6.1 响应面试验设计及回归模型的建立
以单因素试验结果为基础，以pH值（A2）、酶解温度（B2）、酶解时间（C2）、加酶量（D2）4 个因素为响应变量，以脱蛋白率为响应值（Y2），设计四因素三水平试验29组，结果见表5。
表5 碱性蛋白酶法脱蛋白的Box-Behnken试验设计及结果
Table 5 Factors and levels of Box-Behnken design of alkaline protease in deproteinization
编号 A2pH值 B2酶解温度/℃ 脱蛋白率/% C2酶解时间/h D2加酶量/（U/mL）Y2 1 8.5 45 2.5 80 74.65 2 8.5 45 2.0 100 67.04 3 8.5 45 2.5 80 73.49 4 9.0 45 2.0 80 67.79 5 8.5 40 2.5 60 61.25 6 8.5 40 2.0 80 62.15 7 8.0 50 2.5 80 64.97 8 8.0 45 2.0 80 62.72 9 8.5 50 2.0 80 65.79 10 8.0 45 3.0 80 62.75 11 9.0 40 2.5 80 67.82 12 8.5 40 2.5 100 67.58 13 9.0 45 3.0 80 68.02 14 8.5 40 3.0 80 66.97 15 8.5 45 2.5 80 74.68 16 9.0 50 2.5 80 65.93 17 8.0 45 2.5 60 64.14 18 8.5 45 3.0 100 66.09 19 8.0 40 2.5 80 62.02 20 8.5 45 2.0 60 62.86 21 8.5 45 2.5 80 74.86 22 8.5 45 2.5 80 74.47 23 8.5 50 2.5 60 66.61 24 9.0 45 2.5 100 67.78 25 8.5 50 2.5 100 67.00 26 9.0 45 2.5 60 62.54 27 8.5 45 3.0 60 66.79 28 8.0 45 2.5 100 63.75 29 8.5 50 3.0 80 65.94
对表5进行回归分析，得到回归方程：Y2=74.43+1.63A2+0.70B2+0.68C2+1.25D2-1.21A2B2+0.05A2C2+1.41A2D2-1.17B2C2-1.48B2D2-1.22C2D2-4.95A22-4.47B22-4.36C22-4.55D22。对回归方程进行方差分析，结果见表6。
表6 碱性蛋白酶法脱蛋白的回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验
Table 6 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models by alkaline protease in deproteinization
注：*表示差异显著（0.01＜P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方模型 445.568 8 14 31.826 3 A2 31.785 1 1 31.785 1 B2 5.950 2 1 5.950 2 C2 5.617 0 1 5.617 0 D2 18.875 2 1 18.875 2 A2B2 5.856 4 1 5.856 4 A2C2 0.010 0 1 0.010 0 A2D2 7.924 2 1 7.924 2 B2C2 5.452 2 1 5.452 2 B2D2 8.820 9 1 8.820 9 C2D2 5.953 6 1 5.953 6 A22 158.854 9 1 158.854 9 F值26.802 1 26.767 3 5.010 8 4.730 3 15.895 5 4.931 9 0.008 4 6.673 3 4.591 5 7.428 3 5.013 7 133.777 4 P值＜0.000 1 0.000 1 0.042 0 0.047 3 0.001 4 0.043 4 0.928 2 0.021 7 0.050 2 0.016 4 0.041 9＜0.000 1显著性***** * ** * * * * **B22 129.823 4 1 129.823 4 109.328 9＜0.000 1 **C22 123.517 7 1 123.517 7 104.018 7＜0.000 1 **D22 134.212 7 1 134.212 7 113.025 3＜0.000 1 **残差 16.624 4 14 1.187 5失拟项 15.443 4 10 1.544 3 5.230 6 0.062 5纯误差 1.181 0 4 0.295 3总方差 462.193 2 28
由表6可以看出，碱性蛋白酶法脱蛋白模型达到极显著水平（P＜0.01），一次项中pH值和加酶量影响极显著，酶解温度和酶解时间影响显著；根据F值大小，可以判断4个因素对脱蛋白率的影响主次顺序为pH 值（A2）＞加酶量（D2）＞酶解温度（B2）＞酶解时间（C2）；相互作用项 A2B2、A2D2、B2D2和 C2D2显著（P＜0.05）；模型失拟项不显著（P＞0.05），R2=0.964 0，说明模型具有可行性；同时模型的调整决定系数R2adj为0.928 1，说明模型能够解释试验92.81% 的响应值变化，表明此试验模型与实际数据拟合程度好。
2.6.2 碱性蛋白酶法脱蛋白各因素间交互作用
碱性蛋白酶法脱蛋白各因素间交互作用如图12所示。
图12 各因素交互作用的等高线图和曲面图
Fig.12 Contour diagrams and surface diagrams for the interaction of factors
由图12可知，pH值和酶解温度、pH值和加酶量、酶解温度和加酶量、酶解时间和加酶量的交互作用较强，与表6的方差分析中显著性检验结果一致。
2.6.3 响应面优化验证
响应面优化最优条件：pH值为8.59、酶解温度为45.10℃、酶解时间为2.53 h，加酶量为83.10 U/mL，在此条件下模型预测的脱蛋白率为74.70% 。结合实际操作的可行性，取pH值为8.6、酶解温度为45℃、酶解时间为2.5 h，加酶量为83 U/mL，在此条件下进行3组验证试验，实际得到的脱蛋白率为74% 。这与模型预测值较为接近，误差不超过5% ，说明该模型能较好地预测实际情况。
2.7 固体普鲁兰多糖理化指标
按照上述普鲁兰多糖提取工艺，得到固体普鲁兰多糖粉末，对产品进行理化性质分析，结果如表7所示，产品质量满足国家标准要求。
表7 固体普鲁兰多糖理化指标结果
Table 7 Physicochemical indexes of solid pullulan
纯度/% 样品 黏度/（mm2/s）pH值 水分含量/% 总氮含量/% 单糖、二糖、寡糖含量/% 灰分含量/% 固体普鲁兰多糖140.34 6.20 4.41 0.039 3.61 0.43 91.5国家标准 15～180 6.0～8.0 ≤10 ≤0.05 ≤10 ≤8 ≥90
3 结论
本研究采用响应面分析优化普鲁兰多糖发酵液除菌和脱蛋白工艺，结果表明最佳除菌条件：pH3.7、絮凝时间为20 min、絮凝温度为40℃、壳聚糖添加量为0.96 g/L，此时除菌率为99.19% ，多糖得率为91.3% 。最佳脱蛋白条件：pH8.6、酶解温度为45℃、酶解时间为2.5 h，碱性蛋白酶加酶量为83 U/mL，此时脱蛋白率为74.70% ，多糖得率为98.42% 。再经传统的树脂脱色、超滤浓缩、干燥得到产品纯度为91.5% ，符合国家标准要求，表明此工艺具有应用于普鲁兰多糖生产的潜能。
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