梧州六堡茶为中国名茶，具有1500多年历史，采用特殊的渥堆、陈化等发酵工艺加工而成，梧州六堡茶以“红、浓、陈、醇”特殊品质深受广大消费者喜爱[1-3]。近年来消费者十分关注后发酵黑茶受到真菌毒素污染而引起的食品安全问题[4-5]。由于六堡茶属于后发酵的黑茶，因此其饮用安全性也受到广大消费者的关注[6-8]。虽然六堡茶在加工过程中有高温双蒸、干燥等工艺进行灭菌，但是在渥堆发酵、陈化、仓储过程中六堡茶水分比较高，容易滋生真菌，存在受到真菌毒素污染的风险。目前国内对六堡茶中真菌分布情况以及是否会产生有害真菌毒素等问题鲜有研究。因此，对六堡茶中真菌毒素种类及关键的真菌毒素含量进行相关研究，对确保广大六堡茶消费者饮用安全具有一定研究与现实意义[9-11]。
六堡茶中在发酵陈化过程中各类真菌种类、数量繁多，而且不同企业、原料生产六堡茶其微生物多样性也变化较大；如果仅从形态学、生理学、微生物学的特征上分析，难以准确分离和鉴定[9-11]。随着基因测序技术的出现，高通量测序技术快速发展，该技术采用合成与测序同时进行方法对样本的DNA分子进行测序，具有检测速度快、检验量大、结果精密度高的优点。该技术广泛应用可以为分析六堡茶中真菌菌群结构提供技术手段。
茶叶中常见真菌有黑曲霉、米曲霉、寄生曲霉、黄曲霉、土曲霉、杂色曲霉、烟曲霉和构巢曲霉等[14-16]。黄曲霉常见有害代谢物包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2、黄曲霉毒素 M1、黄曲霉毒素M2[17]和赭曲霉毒素A[18-19]；镰刀菌产生的有害代谢物包括伏马菌素[20]、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮[21]、镰刀菌烯酮X和T-2毒素等单端孢霉烯族毒素[22-23]。茶叶中青霉属常见的有黄绿青霉（P.citreo-viride）、桔青霉（P.citrinum）、产黄青霉（P.chrysogenum）、娄地青霉（P.roqueforti）、展青霉（P.patulum）、绳状青霉（P.funiculosum）和产紫青霉（P.purpurogenum）等，日常生活中青霉素有害代谢产物为桔青霉素[24-25]。
本文采用基于18S宏基因组测序技术的Illumina HiSeq TM2500分析仪器，提取六堡茶DNA样本后，利用ITS1F和ITS2R序列测定方法，分析对比10种不同厂家、批次、年份的六堡茶中的真菌微生物组成。同时采用 QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）-液相/质谱联用方法，分析样品中常见真菌的代谢毒素残留量。通过研究样品探讨六堡茶中真菌毒素群落结构、组成，并对食品中常见的真菌素残进行留量检测分析，为科学防控六堡茶中真菌毒素对消费者可能产生的食品安全风险，提供实际检测数据与理论研究基础。
1 材料和方法
1.1 材料与设备
样品：市售不同厂家、批次、年份（陈化时间1年～12年）的六堡茶成品10份。样品具体编号、陈化开始时间及样品含水量见表1。
表1 试验样品信息
Table 1 Test sample information
样品编号 陈化开始时间样品含水量/% 备注LBC-1 2020.01 13.0 同一产品系列，不同陈化开始时间LBC-2 2018.05 11.9 LBC-3 2012.09 9.9 LBC-4 2008.10 8.9 LBC-5 2019.12 12.6 同一生产企业，不同产品系列LBC-6 2018.04 11.5 LBC-7 2018.10 11.6 LBC-8 2019.03 12.3 不同企业不同产品系列LBC-9 2017.06 10.8 LBC-10 2020.04 12.9
16种真菌毒素标准物质（纯度＞98%）：美国Romer Labs公司；DNA提取试剂：北京诺博莱德科技公司；乙腈（色谱纯）：美国霍尼韦尔公司；甲酸（色谱纯）：美国热电公司；HC-C18型吸附剂（40 μm～60 μm）、N-丙基乙二胺（40 μm～60 μm）：上海安谱实验科技股份有限公司；硫酸镁（分析纯）：西陇化工股份有限公司。净化管：分别称取80 mg N-丙基乙二胺、0.25 g硫酸镁、15 mg HC-C18至2.0 mL离心管中。
LC1290-QQQ6490液质联用仪：美国安捷伦公司；X-30R冷冻离心机：德国贝克曼库尔特公司。
1.2 样品总DNA提取方法
按照提取试剂的使用说明对六堡茶样品进行真菌的DNA进行提取。
1.3 聚合酶链式反应扩增
提取样品中真菌毒素DNA，对DNA的浓度和质量进行检测后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物质量并进行扩增，样品真菌ITS检测选用引物为ITS1F-ITS2R （ITS1F：5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′，ITS2R：5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′）。
1.4 测序
样品中真菌毒素ITS测序试验由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.5 真菌多样性数据处理和分析
对高通量测序检测到的数据与已有的ITS区数据库进行对比分析。对检测到的数据进行过滤拼接，获得有效序列。利用R语言中的函数制作微生物群落组成的柱状分析图。相关数据统计利用Excel软件。
1.6 样品中真菌毒素残留量测定方法
1.6.1 QuEChERS样品前处理方法
采用中药粉碎机对六堡茶样品进行粉碎并过80目筛后混匀，先在离心管（50 mL）中称取2.50 g样品，向离心管中小心逐滴加入2.0 mL纯水湿润样品，加入20.0 mL有机提取溶剂（1%甲酸-乙腈溶液）后用涡旋混合器振摇3 min，4℃下4 000 r/min离心10 min，取出后放置恢复至室温（25℃）分层；吸取1.0 mL上层澄清液到净化管中，在涡旋混合器混匀3 min后冷冻离心分离（15 000 r/min、4℃、10 min），取出待离心管恢复至室温（25℃）、分层后取上层澄清液过滤膜（孔径0.22 μm）后上机检测。
1.6.2 色谱条件
色谱柱：Atlantis
T3色谱柱（2.1mm×150mm，3μm）；柱温：35 ℃；流速：0.30 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，流动相梯度洗脱程序见表2。
表2 流动相梯度洗脱程序
Table 2 Mobile phase gradient elution procedure
时间/min A相/% B相/%0 90 10 1.01 90 10 5.00 25 75 5.06 5 95 12.05 5 95 12.10 90 10 15.10 90 10
1.6.3 质谱条件
电喷雾离子源（electron spray ionization，EI）；采用正负离子源切换模式扫描；毛细管电压4 000 V；干燥气温度325℃；干燥气流速9 L/min；其它参数见表3。
表3 质谱仪检测参数
Table 3 Detection parameters of mass spectrometer
注：*为定量离子。
名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） 碰撞能量/V黄曲霉毒素B1 313.0 285.2*/241.1 20/40黄曲霉毒素B2 315.2 287.2*/259.2 30/30黄曲霉毒素G1 329.1 243.2*/215.1 30/30黄曲霉毒素G2 331.2 313.2*/245.0 30/25黄曲霉毒素M1 329.1 273.1*/259.0 34/34黄曲霉毒素M2 331.1 273.1*/259.0 31/34赭曲霉毒素A 404.2 239.1*/358.2 19/14桔青霉素 251.1 191.0*/205.1 25/25脱氧雪腐镰刀菌烯醇 297.1 203.1*/249.1 15/12 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 339.0 231.0*/203.0 17/21 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 339.0 137.0*/321.0 27/12玉米赤霉烯酮 319.2 185.0*/187.0 22/19 T-2毒素 483.8 305.1*/185.0 20/16伏马毒素B1 722.4 334.2*/352.2 40/38伏马毒素B2 706.4 318.2*/336.2 35/35伏马毒素B3 706.0 336.0*/354.0 35/30
2 结果与分析
2.1 门和属分类水平下真菌类群分析
本文将六堡茶中真菌分为优势门或属（真菌的序列平均相对含量大于1.00%）、其它（真菌的序列平均相对含量小于1.00%）、不可鉴定（不能鉴定到门或者属水平真菌的序列）。
2.1.1 基于门分类学的真菌类群分析
门分类水平下，10批次六堡茶真菌类群结构分析见图1。
图1 基于门水平10个样品中真菌类群的比较分析
Fig.1 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on phylum level
由图1可知，10个六堡茶样品中真菌类群主要是子囊菌门（Ascomycota），其相对含量在85.2%～94.2%，平均相对含量为90.9%；有3个样品含有担子菌门（Basidiomycota），其相对含量在1.2%～3.2%。其中子囊菌门在同一产品系列中，平均含量随着陈化时间先降后升。采用SPSS 25.0软件经Mann-Whitney检验，采集的10个六堡茶样品在门水平上真菌类群差异均不显著（P＞0.05）。
2.1.2 基于属分类学的真菌类群分析
属分类水平下，10批次六堡茶样品所有序列可鉴定出24个真菌属，其中平均相对含量大于1.00%的有6个，具体真菌类群结构相对含量分析见图2。
图2 基于属水平10个样品中真菌类群的比较分析
Fig.2 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on genus level
由图2可知，6个平均相对含量大于1.00%的真菌属分别为曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、节担菌属（Wallemia）、肉座菌（Hypocreale）、芽生葡萄孢酵母属（Blastobotrys）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces），其中10个样品均含有曲霉属，平均相对含量在50.6%～99.9%，10个样品曲霉属平均相对含量为86.4%，是六堡茶样品的优势真菌属。采用SPSS 25.0软件经Mann-Whitney检验发现，编号LBC-6、LBC-8、LBC-10 3个样品中曲霉属（Aspergillus）含量差异明显，其平均相对含量分别为50.6%、89.2%、57.9%。
2.2 样品中16种真菌毒素残留量检测结果
试验检测真菌毒素线性范围、检出限、定量限和10批次六堡茶样品中16种真菌毒素残留量见表4。
表4 真菌毒素线性范围、检出限、定量限
Table 4 Linear range，limit of detection and limit of quantification of mycotoxins
注：-表示全部样品中真菌毒素残留量低于相应方法检出限，检测结果为未检出。
真菌毒素 线性范围/（ng/mL） 检出限/（μg/kg） 定量限/（μg/kg） 样品中检测出编号及含量/（μg/kg）黄曲霉毒素B1 2.60～20.80 0.030 0.10 -黄曲霉毒素B2 0.88～10.50 0.030 0.10 -黄曲霉毒素G1 2.95～23.60 0.030 0.10 -黄曲霉毒素G2 1.54～11.80 0.030 0.10 -黄曲霉毒素M1 0.18～1.81 0.005 0.015 -黄曲霉毒素M2 0.18～1.81 0.005 0.015 -赭曲霉毒素A 0.38～1.91 0.15 0.30 -桔青霉素 1.22～12.40 3.00 9.00 -脱氧雪腐镰刀菌烯醇 10～320 2.00 6.00 -3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 10～320 5.00 10.00 -15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 10～320 5.00 10.00 -玉米赤霉烯酮 10.91～202.00 1.00 3.00 -T-2毒素 5.74～57.4 0.50 1.50 -伏马毒素B1 1.54～15.40 0.50 1.50 -伏马毒素B2 1.54～15.40 0.50 1.50 -伏马毒素B3 1.54～15.40 0.50 1.50 -
由表4可知，本文试验方法的检出限、定量限与现行国家标准相一致；通过对10批次六堡茶样品中常见16种真菌毒素残留量检测，检测结果为均未检出。初步研究表明，样品六堡茶中真菌虽以曲霉类为主，但暂未发现以上常见的有害真菌代谢毒素残留。
3 结论
本试验首先对不同年份、不同企业生产的10批次六堡茶样品进行茶叶样品的总DNA提取，采用18S宏基因组测序技术进行ITS测序与分析，结果表明：10个六堡茶样品在门分类水平真菌类群主要是子囊菌门，其平均相对含量在85.2%～94.2%，平均相对含量90.9%；在属分类水平6个平均相对含量大于1.00%的依次为曲霉属、青霉属、节担菌属、肉座菌、芽生葡萄孢酵母属、德巴利氏酵母属，其中10个样品均含有曲霉属，平均相对含量在50.6%～99.9%，10个样品曲霉属平均相对含量为86.4%。采用超高效液相-质谱联用仪对实际样品中黄曲霉毒素、伏马毒素等真菌代谢毒素残留量进行检测分析，结果表明样品中16种真菌毒素残留量小于方法检出限，检测结果为未检出。试验表明，六堡茶样品中真菌以曲霉属、青霉属为主，暂未发现以上16种有害真菌代谢毒素残留。
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