蜂蜜是一种成分复杂的天然甜味剂，主要由碳水化合物和水组成，并含有少量其他成分，如有机酸、矿物质、维生素、酶、蛋白质、氨基酸、挥发性化合物和植物化合物等[1]。蜂蜜不易变质[2]，在室温18℃干燥条件下保存即可。蜂蜜除食用外，还能够治疗口腔溃疡[3]、促进伤口愈合[4]、调节肠胃。蜂蜜的抗氧化活性使其在氧化应激相关慢性疾病中发挥重要作用[5-7]。蜂蜜具有广谱抑菌性[8-9]，蜂蜜的高渗透压、低pH值、低水分活度等特性[10-11]，以及存在一些多酚类物质使其具有很好的抗菌效果[12]。蜂蜜中的多酚类成分还具有抗炎作用，能够降低炎症反应[13-14]。蜂蜜所具有的抗氧化、抗菌、抗炎等多种功能活性[15-17]是蜂蜜独特的营养优势。
枸杞蜜是我国西北地区的特色蜂蜜，呈琥珀色或深琥珀色。枸杞蜜的产地集中在青海、宁夏等地。枸杞蜜的蜜源植物为枸杞[18-19]。枸杞作为我国珍贵的中药材，有很高的药用价值，但对于枸杞蜜中多酚类成分研究较少，分析枸杞蜜中多酚类化合物成分对提高其附加值具有重要意义[20]。本研究采用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，对枸杞蜜中多酚类化合物进行结构鉴定和定量分析，同时建立了枸杞蜜的标准指纹图谱，对市售商品蜜进行真实性评价，以期为提高枸杞蜜附加值提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞蜜样品：中国农业科学院蜜蜂研究所提供，来自于青海、宁夏、陕西，并按收集时间对样品进行编号（S1～S8）；枸杞蜜：市售。
甲酸、甲醇、氨水（均为分析纯）：北京奥维森科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙酸（色谱纯）、乙酸（质谱级）：美国赛默飞世尔公司；P-香豆酸、短叶松素、柯因、松属素：美国Sigma公司；红花菜豆酸、三-对-香豆酰亚精胺：中国农业科学院蜜蜂所蜂产品加工与功能评价实验室自制；试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
BSA124S-CW型分析天平：美国Sartorrius公司；SevenEasyS20型pH计：瑞士Mettler公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos台式离心机：美国Thermo Fisher公司；Strata-X-A固相萃取柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱：美国Phenomenex公司；Finnpipette F1单道移液器：美国Thermo Scientific公司；0.22 μm微孔滤膜：德国Merk Milipore公司；SB-80DTD全自动超声波清洗装置：昆山超声仪器有限公司；LC-6AD型高效液相色谱仪：日本Shimedzu公司；6500型Q-TOF液相质谱联用仪：美国Agilent公司；DN-24W氮吹仪：上海达洛科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蜂蜜中多酚类成分的富集
参考乔江涛[21]的研究方法，用Strata-X-A型固相萃取柱对枸杞蜜中的多酚类成分进行富集。
1.3.2 蜂蜜高效液相色谱分析条件
Phenomenex Gemini C18色谱柱、柱温箱温度35℃、枸杞蜜的检测波长280 nm、样品进样量20 μL，总流速0.7 mL/min。流动相A为0.2%乙酸水溶液，流动相B为0.2%乙酸甲醇溶液。枸杞蜜梯度洗脱程序如下：0～10 min，5%～9%B；11 min～17 min，9%～15%B；18 min～30min，15%～18%B；31min～33 min，18%～23%B；34 min～39min，23%～27%B；40min～46 min，27%～31%B；47 min～55min，31%～34%B；56min～60min，34%～35%B；61min～70min，35%～36%B；71min～80min，36%～40%B；81min～90 min，40%～44%B；91 min～100 min，44%～51%B；101 min～105 min，51%～55%B；106 min～110 min，56%～58%B；111 min～120 min，58%～63%B；121 min～130 min，63%～70%B；131 min～135 min，70%～80%B；136 min～145 min，5%～9%B。
1.3.3 质谱分析条件
质谱分析条件：离子源为电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）、离子源喷射电压 4 kV、出口电压130 V、加热温度 350 ℃、氮气（N2）流速 11 L／min、碰撞气体为氦气、雾化气流速80 kPa、雾化器压力40 psi（1 psi=6 895 Pa）、质量扫描范围为m/z100～900。
1.3.4 蜂蜜中多酚类成分定量分析
称取红花菜豆酸、三-对-香豆酰亚精胺、反，反式脱落酸、花旗松素、顺，反式脱落酸，配制梯度浓度标准品溶液。根据梯度浓度及相应峰面积建立标准曲线，采取5点式确保所测物质含量的上限和下限。其中x为标准品的浓度，y为峰面积。
1.3.5 蜂蜜中多酚类化合物成分指纹图谱的建立
原料蜜的高效液相色谱图通过质谱软件生成所需格式，将此数据利用中药色谱指纹图谱[22]相似度评价系统进行分析，在此过程中对比并记录各个样品中的色谱峰相似度，并在允许范围内进行多点校正。
1.4 数据分析
定量试验重复3次，使用SPSS 16.0软件进行分析。采用高效液相色谱法、中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行色谱相似度和指纹图谱分析。
2 结果分析
2.1 枸杞蜜中多酚类成分鉴定
枸杞蜜的高效液相色谱图如图1所示。化合物1的一级质谱图及二级质谱图如图2、图3所示。
图1 枸杞蜜样品的HPLC图
Fig.1 Chromatograms of wolfberry honey
1.红花菜豆酸；2.花旗松素；3.槲皮素-3-O-槐糖苷；4.反，反式脱落酸；5.顺，反式脱落酸；6.顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺；7.顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺；8.反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺；9.反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺。
图2 化合物1正负离子模式下的一级质谱图
Fig.2 Primary mass spectrum of compounds 1 in positive and negative ion modes
图3 化合物1在负离子模式下的二级质谱图
Fig.3 Secondary mass spectrum of compounds 1 in negative ion mode
如图2所示，正离子模式下有m/z303.1176[M+Na]+的准分子离子峰，负离子模式下有m/z 279.1221[M-H]-的准分子离子峰，判断其分子量为280 Da，且为偶电子离子，从而得到化合物分子式为C15H20O5，计算不饱和度（环加双键值）为6。根据该化合物的二级质谱碎片特征（图3）及断裂规律，加入标准品验证，判断该化合物为红花菜豆酸，并推导其裂解途径，结果如图4所示。
图4 化合物1在负离子模式下质谱裂解途径
Fig.4 Mass spectrum cleavage pathway of compound 1 in negative ion mode
化合物2的一级质谱图及二级质谱图如图5、图6所示。
图5 化合物2在正负离子模式下一级质谱图
Fig.5 Primary mass spectrum of composition 2 in positive and negative ion modes
图6 化合物2在正离子模式下的二级质谱图
Fig.6 Secondary mass spectrum of composition 2 in positive ion modes
如图5所示，正离子模式下有m/z 305.060 9[M+H]+的准分子离子峰，负离子模式下有m/z 303.049 3[M-H]-的准分子离子峰。判断其分子量为304 Da，通过相关文献、二级质谱断裂信息（图6）以及标准品验证，确定该化合物为花旗松素。首次在枸杞蜜中发现花旗松素，所以将花旗松素作为枸杞蜜的特征性成分。
化合物3的一级质谱图及其二级质谱图如图7、图8所示。
图7 化合物3在正负离子模式下一级质谱图
Fig.7 Primary mass spectrum of composition 3 in positive and negative ion modes
图8 化合物3在正离子模式下的二级质谱图
Fig.8 Secondary mass spectrum of composition 3 in positive ion modes
如图7所示，正离子模式下有m/z627.1453[M+H]+、m/z 649.131 6[M+Na]+的准分子离子峰，负离子模式下有m/z 625.142 1[M-H]-的准分子离子峰。判断其分子量为626 Da。由图8可知，m/z 627.145 3[M+H]+准分子离子峰连续断裂2个m/z162碎片，产生碎片离子m/z 465[M+H-162]+和m/z 303[M+H-162-162]+。碎片离子m/z 303[C15H10O7+H]+来自苷元槲皮素（C15H10O7）。故该化合物为槲皮素-二-葡萄糖苷，后经标准品验证为槲皮素-3-O-槐糖苷。
化合物4、5根据高效液相色谱峰的出峰时间和最大紫外吸收以及标准品验证，判断其分别为反，反式脱落酸和顺，反式脱落酸。化合物6、7、8、9的一级质谱图及其二级质谱图如图9、图10所示。
图9 化合物6、7、8、9在正负离子模式下一级质谱图
Fig.9 Primary mass spectrum of composition 6，7，8，9 in positive and negative ion modes
图10 化合物6、7、8、9在正离子模式下的二级质谱图
Fig.10 Secondary mass spectrum of composition 6，7，8，9 in positive ion modes
如图9所示，化合物6、7、8、9均为亚精胺类化合物，在正离子模式下有m/z 584[M+H]+、m/z 606[M+Na]+的准分子离子峰，在负离子模式下有m/z 582[M-H]-的准分子离子峰，因此确定这4个化合物分子量均为583 Da；在二级质谱图中发现，4个化合物的断裂规律相同：由准分子离子峰m/z 584[M+H]+连续断裂3个香豆酰碎片后，产生分子离子碎片峰m/z 438[M+H]+、m/z 292[M+H]+，最终得到相对分子质量145 Da，即为亚精胺。根据紫外吸收不同区分4个同分异构体。化合物6、7、8、9结构如图11所示。
图11 三-对-香豆酰亚精胺结构图
Fig.11 Structural diagram of P-coumaroyl spermidine
枸杞蜜样品成分信息见表1。
表1 枸杞蜜样品成分信息
Table 1 Composition information in wolfberry honey samples
编号 成分 保留时间/min 最大紫外吸收值/nm 分子量/Da [M+H]+ [M-H]-1红花菜豆酸 51.47 264 280 281.085 9 279.122 6 2花旗松素 52.82 289 304 305.065 5 303.050 0 3槲皮素-3-O-槐糖苷 70.17 353 626 627.154 5 625.141 3 4反，反式脱落酸 80.37 265 264 265.143 5 263.127 1 5顺，反式脱落酸 90.03 264 264 265.142 6 263.127 3 6 顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺 109.30 269 583 584.276 3 582.205 3 7 顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺 114.20 278 583 584.274 9 582.203 2 8 反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺 117.97 291 583 584.277 5 582.259 8 9 反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺 121.87 299 583 584.268 5 582.259 4
2.2 枸杞蜜中多酚类成分定量分析
标准品标准曲线的相关系数以及回归方程如表2所示，计算得到枸杞蜜中多酚类化合物含量见表3。
表2 标准品的相关系数以及回归方程
Table 2 Correlation coefficient as well regression equations of standards
标准物质 回归方程 R2红花菜豆酸 y=451 6x+135 048 0.999 5花旗松素槲皮素-3-O-槐糖苷0.997 2 0.999 6脱落酸 y=4 513x+135 049 0.999 5三对香豆酰亚精胺 y=4 014.70x+221 004 0.995 2 y=526.14x-111 770 y=885 311x-29 748
表3 枸杞蜜中多酚类化合物含量
Table 3 Contents of phytochemicals in wolfberry honey samples mg/kg
化合物 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8红花菜豆酸 2.36±0.08 2.96±0.12 1.25±0.13 2.17±0.07 3.39±0.16 4.50±0.09 3.77±0.12 3.58±0.06花旗松素 1.75±0.13 1.11±0.09 1.18±0.05 1.42±0.04 8.34±0.04 6.85±0.05 4.09±0.10 1.06±0.02槲皮素-3-O-槐糖苷 0.40±0.01 0.20±0.02 0.17±0.01 0.40±0.02 0.79±0.03 0.34±0.02 0.30±0.02 0.71±0.06反，反式脱落酸 0.17±0.01 0.46±0.02 0.25±0.01 0.27±0.01 0.42±0.02 0.73±0.03 0.45±0.02 0.84±0.03顺，反式脱落酸 4.26±0.01 4.30±0.05 2.39±0.02 4.04±0.03 5.30±0.03 5.58±0.05 6.02±0.07 5.55±0.06顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺 0.74±0.01 0.60±0.04 0.46±0.03 0.58±0.05 0.74±0.07 0.74±0.06 2.01±0.04 0.86±0.01顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺 0.65±0.04 0.50±0.02 0.50±0.03 0.54±0.03 0.51±0.05 0.45±0.03 0.51±0.03 0.59±0.01反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺 0.32±0.06 0.23±0.01 0.28±0.01 0.15±0.01 0.07±0.01 0.14±0.01 0.28±0.01 0.20±0.01反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺 0.03±0.01 0.07±0.02 0.02±0.00 0.10±0.01 0.02±0.00 0.04±0.00 0.10±0.01 0.11±0.01
如表3所示，在所有样品中均检测出了枸杞蜜中的9个多酚类成分。其中，顺，反式脱落酸含量最高，含量范围在2.39 mg/kg～6.02 mg/kg。除顺，反式脱落酸外，枸杞蜜中含量较高的为红花菜豆酸，平均含量为3.00 mg/kg。此外，花旗松素、槲皮素-3-O-槐糖苷的平均含量分别为1.51 mg/kg和0.41 mg/kg。4个三对香豆酰亚精胺的含量总和在0.48 mg/kg～6.72 mg/kg，平均含量为0.41 mg/kg。
2.3 枸杞蜜多酚类成分指纹图谱建立
将枸杞蜜原料蜜样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析，对色谱峰进行匹配和多点校正，并最终生成枸杞原料蜜指纹图谱见图12，选择具有代表性的9个峰，模拟生成具有代表意义的枸杞蜜的标准指纹图谱见图13。
图12 所有枸杞原料蜜样品生成的指纹图谱
Fig.12 Fingerprints of wolfberry raw honey samples
图13 枸杞蜜的标准指纹图谱
Fig.13 Fingerprints of wolfberry honey
枸杞蜜原料蜜样品之间的相似度见表4。
表4 枸杞原料蜜样品之间的相似度
Table 4 Similarity analysis between safflower raw honey samples
项目 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 对照S1 1.00 0.96 0.93 0.93 0.91 0.94 0.95 0.91 0.97 S2 0.96 1.00 0.92 0.92 0.94 0.94 0.96 0.90 0.97 S3 0.93 0.92 1.00 0.94 0.87 0.92 0.91 0.92 0.96 S4 0.93 0.92 0.94 1.00 0.89 0.92 0.92 0.93 0.97 S5 0.91 0.94 0.87 0.89 1.00 0.89 0.94 0.85 0.93 S6 0.94 0.94 0.92 0.92 0.89 1.00 0.92 0.92 0.96 S7 0.95 0.96 0.91 0.92 0.94 0.92 1.00 0.89 0.96 S8 0.91 0.90 0.92 0.93 0.85 0.92 0.89 1.00 0.97对照 0.97 0.97 0.96 0.97 0.93 0.96 0.96 0.97 1.00
由表4可知，将8个样品的高效液相色谱图与标准指纹图谱进行比较，结果显示相似度范围在0.85～0.99之间，说明所有枸杞原料蜜样品之间相似度较高。
2.4 市售商品枸杞蜜的真实性评价
市售枸杞蜜高效液相色谱图如图14所示。
图14 不同品牌的枸杞蜜高效液相色谱图
Fig.14 Different brands of wolfberry honey by high performance liquid chromatography
由图14可知，品牌A、B、C色谱图与标准指纹图谱较一致，枸杞蜜中的特征性化合物花旗松素均存在。表明这3个品牌的枸杞蜜与真正的枸杞蜜一致。品牌D中虽然存在枸杞蜜的特征性成分花旗松素，但是其色谱图与标准指纹图谱比较存在较大的差异，存在较明显的杂峰，推测该品牌的枸杞蜜不纯，可能存在其他品种的蜂蜜，造成了色谱图中杂峰的存在。
3 结论
通过高效液相色谱-串联质谱技术对枸杞蜜中的多酚类成分进行鉴定，共鉴定出枸杞蜜中9种多酚类成分，分别为花旗松素、红花菜豆酸、槲皮素-3-O-槐糖苷、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸以及4个三对香豆酰亚精胺，并将花旗松素定为枸杞蜜的特征性成分。
对8个原料枸杞蜜样品中多酚类成分定量分析，发现顺，反式脱落酸含量最高，含量范围为2.39 mg/kg～6.02 mg/kg。除了顺，反式脱落酸，枸杞蜜中红花菜豆酸含量也较高，平均含量为3.00 mg/kg。花旗松素的平均含量为1.51 mg/kg、槲皮素-3-O-槐糖苷的平均含量为0.41 mg/kg。4个三对香豆酰亚精胺的含量总和在0.48 mg/kg～6.72 mg/kg之间，平均含量为0.41 mg/kg。
在中药指纹图谱相似度评价系统中生成具有代表意义的枸杞蜜标准指纹图谱，并通过相似度计算，结果表明所有枸杞原料蜜样品整体较一致。分析市面上销售的4个枸杞蜜样品，发现整体情况较好，其中3个品牌枸杞蜜品质较好，有一个品牌枸杞蜜为掺假蜂蜜。
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