红茶菌是一种有着悠久历史的传统发酵茶饮料，以糖、茶、水为原料，主要由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌协同发酵而成，口感清爽宜人，富含茶多酚、有机酸等多种活性功能成分，具有抗氧化、抗炎、预防和治疗糖尿病等保健功效[1-2]。红茶菌一直以来以天然混合菌种家庭自然发酵方式被应用和流传，但这种方式存在微生物菌相复杂、生产周期长、发酵过程易受杂菌污染以及产品风味不均一等多种不利因素，故而限制了它的开发和应用[3]。近年来有学者对其发酵菌种及发酵工艺进行研究[4-5]。林娟等[6]以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp.）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵菌种，制备出香醇爽口、独特风味的新型红茶菌；宋清鹏等[7]以总酸、D-葡糖糖二酸 1，4-内酯（D-glucaro acid-1，4-lactone，DSL）含量为工艺优化指标探讨接种量、发酵温度、初始可溶性固形物等因素对其成分影响，研发出了一款高产DSL且口感佳的红茶菌饮料。目前红茶菌市场产品种类单一、品质不稳定，因此探究红茶菌发酵菌株及优化工艺条件是红茶菌饮料实现产业化、大规模化的研究基础及必要条件。
本试验在前期工作的基础上，以传统发酵红茶菌中分离纯化所获的优良菌株：木糖驹形氏菌（Komagataeibacter xylinus）1512、拜耳接合酵母菌（Zygosaccharomyces bailii）1484、植物乳杆菌1298为发酵菌种，通过检测其发酵液的总酸、总糖含量及感官评分等指标，进行复配研究，制备新型混合发酵剂；同时以总酸含量及感官评分为指标通过单因素及响应面试验优化发酵条件及生产工艺，为红茶菌饮料实现标准化、工业化生产奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿茶：杭州名杭茶叶有限公司；蔗糖：河南金润食品添加剂有限公司；无水乙醇、甲酸、乙酸、丁酸、柠檬酸、硫酸镁、硫酸锰（均为分析纯）：天津市四通化工厂；植物总酚检测试剂盒：北京雷根生物技术有限公司。
红茶菌母液菌种：河南中沃实业有限公司；木糖驹形氏菌（Komagataeibacter xylinus）1512、拜耳接合酵母菌（Zygosaccharomyces bailii）1484、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）1298：天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室从传统红茶菌母液分离所获的优势菌株[6，8]。MRS培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基、葡萄糖-酵母浸膏-碳酸钙（glucose-yeast extract-calcium carbonate，GYC）培养基、琼脂培养基：天津市江天化工技术有限公司。
1.2 仪器与设备
JA2003型电子分析天平：日本YAMATO公司；Multiskan GO型酶标仪：美国Thermo公司；HF safe 900型超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；LC-16高效液相色谱仪：日本岛津公司；Sigma3-18k高速冷冻离心机：德国Sigma公司；B-600型低速离心机：河北省安新县白洋离心机厂。
1.3 试验方法
1.3.1 技术路线
技术路线如下。
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 茶汤制备
将绿茶以一定的比例添加到沸水中，煮沸5 min后用8层纱布过滤，再加入一定量蔗糖溶解，封口膜封口，于90℃水浴灭菌10 min后冷却至25℃～30℃备用[9]。
1.3.2.2 菌种活化与驯化
将木糖驹形氏菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳杆菌1298以及红茶菌母液分别接种于灭菌后的GYC培养基、YPD培养基、MRS培养基、琼脂培养基，于30℃培养48 h后传代2次，再将活化后的菌株（木糖驹形氏菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳杆菌1298）接种于灭菌的茶汤中培养3 d～4 d，使发酵菌种适应茶汤中的环境（种子液浓度达到108CFU/mL）[10]。
1.3.2.3 灭菌
将红茶菌发酵液在90℃水浴杀菌10 min后，冷却至40℃以下[11]。
1.3.3 传统红茶菌制备
将活化后的红茶菌母液以体积分数6%的接种量接种于茶汤中，于30℃恒温静置培养12 d，得到传统红茶菌（pH 值为 2.3～2.9）[12]。
1.3.4 红茶菌发酵菌种复配比例研究
取驯化好的种子液（木糖驹形氏杆菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳杆菌1298），以6%总接种量，按不同体积比复配接种于茶汤中，30℃培养发酵8 d，检测其发酵液总糖、总酸、总酚含量及感官评分指标，筛选得出最佳配比。
1.3.5 红茶菌发酵条件的确定
1.3.5.1 单因素试验
以感官评分为主要指标、总酸含量为辅助指标，分别考察茶叶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、蔗糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵时间（4、6、8、10、12 d）、发酵温度（26、28、30、32、34 ℃）对红茶菌发酵效果的影响，以确定最佳单因素水平。
1.3.5.2 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计结合加权综合性评分法[9]，选取影响红茶菌发酵效果较大的4个因素：蔗糖添加量、接种量、发酵时间、发酵温度为考察因素，以总酸（权重比例为30%）与感官评分（权重比例为70%）的综合分值为响应值，进行四因素三水平的响应面优化试验，试验设计见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
水平 A蔗糖D发酵时间/h-1 7 5 29 7 0 8 6 30 8添加量/% B接种量/% C发酵温度/℃1 9 7 31 9
1.3.6 感官品质评定
参考齐海丽等[13]、邓雯瑾等[14]的感官评定方法，结合红茶菌发酵饮料的自身特点，邀请10名专家及工作人员对感官品质进行分析，评分标准见表2。
表2 红茶菌发酵饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of kombucha
项目 评分标准口感风味（4分） 茶香浓郁，酸甜适口（4.0分～3.0分）发酵液颜色过深或过浅，暗沉无光泽（＜1.0分）组织状态（3分） 发酵液清澈透亮，允许有少量杂质（3.0分～2.5分）口感刺激，酸涩味重，杂味明显（＜1.0分）色泽（3分） 棕黄色、颜色均匀、清澈透亮（3.0分～2.5分）滋味宜人，无异味、无涩味（2.9分～2.0分）滋味较淡或较苦涩（1.9分～1.0分）颜色均匀，棕黄色（2.4分～2.0分）颜色均匀但偏深或偏浅（1.9分～1.0分）发酵液较清澈，有部分沉淀杂质（2.4分～2.0分）发酵液浑浊，有较多沉淀杂质（1.9分～1.0分）发酵液浑浊，沉淀分层严重（＜1.0分）
1.3.7 理化指标的测定
pH值参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》进行测定；总酸参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》进行测定；总糖采用苯酚硫酸法[15]测定；总酚采用总酚试剂盒检测；生长曲线采用分光光度计测定OD600 nm值；有机酸采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[16]测定。
1.3.8 数据统计分析
采 用 PASW Statistics v18、Design Expert 8.0.6 及Excel软件对各项指标进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 红茶菌纯种混合最佳体积比研究结果
红茶菌中主要微生物由醋酸菌、酵母菌以及少量乳酸菌组成[1]，在前期试验基础上，以河南济源地区传统红茶菌筛选所获的优良菌株（木糖驹形氏杆菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳杆菌1298）为发酵菌种，并组成不同的菌种比例，以6%总接种量接种于茶汤发酵8 d后，观察发酵液主要成分变化及感官品质，筛选最佳菌株体积比，结果如表3所示。
表3 红茶菌理化指标及感官评分结果
Table 3 Physicochemical index and sensory score of kombucha
注：同列不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
木糖驹形氏杆菌 1512∶拜耳接合酵母菌 1484∶植物乳杆菌1298（体积比）总糖含量/（mg/mL）总酸含量/（mg/mL）总酚含量/（mg/mL） 感官评分2∶1∶1 21.17±1.81c 7.96±0.50a 1.38±0.03a 8.60±0.51a 1∶2∶1 28.66±1.77b 6.51±0.13b 1.30±0.05b 7.50±0.37b 1∶1∶2 30.68±2.06a 6.08±0.29c 1.21±0.04c 6.80±0.52c 1∶1∶1 27.11±2.11b 6.59±0.31b 1.35±0.06a 7.90±0.41b
由表3可知，不同菌种体积比制备的红茶菌总糖、总酸、总酚含量及感官评分均有不同。拜耳接合酵母菌1484比例过高（1∶2∶1）或植物乳杆菌1298比例过高（1∶1∶2），均会引起发酵不足、糖代谢不充分、酸味不够的现象；其中木糖驹形氏杆菌1512∶拜耳接合酵母菌1484∶植物乳杆菌1298体积比为2∶1∶1时，发酵的红茶菌总酸、总酚含量最高，分别为7.96mg/mL和1.38mg/mL，总糖含量最低为21.17 mg/mL，口感酸甜适口，滋味最佳。
2.2 红茶菌发酵单因素试验结果
2.2.1 红茶菌发酵液茶叶添加量的确定
茶叶添加量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响见图1。
图1 茶叶添加量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响
Fig.1 Effects of tea dosage on sensory score and total acid content of kombucha
不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
茶作为红茶菌的发酵基质，为菌株的生长提供了丰富的营养物质，同时在风味上也赋予了红茶菌特有的茶香[17]，因此研究茶叶添加量对红茶菌发酵的影响十分必要。由图1可知，在一定茶叶添加量范围内，红茶菌的感官评分及总酸含量随着茶叶添加量的增加而升高，在茶叶添加量为1.0%时，其感官评分及总酸含量达到最高分别为8.91分和8 mg/mL，但当添加量超过1.0%时，感官评分及总酸含量显著下降（p＜0.05）。研究表明，茶叶添加量不足时，无法给予菌株充足的营养物质，导致产品发酵不充分、酸味不足、茶香不足；茶叶添加量过高时，则会引起发酵液的单宁酸、茶多酚过剩从而抑制了菌体的生长和发酵速度，并且单宁酸也会造成红茶菌涩味过重[18]。综上所述选择茶叶添加量为1.0%进行下一步试验。
2.2.2 红茶菌发酵液蔗糖添加量的确定
蔗糖添加量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响见图2。
图2 蔗糖添加量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响
Fig.2 Effects of sugar dosage on sensory score and total acid content of kombucha
不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
碳源是微生物生长的一类重要营养物质，而蔗糖是发酵饮料的主要碳物质来源[19]。由图2可知，在一定添加量范围内，红茶菌的感官评分及总酸含量随着蔗糖添加量的增加而升高，当蔗糖添加量为8%时，其感官评分达到最高为8.66分，添加量超过8%时，感官评分下降，主要由于过量的蔗糖引发饮料口感过甜，产生腻味；蔗糖添加量为8%时总酸含量最高，超过8%时，总酸含量下降，主要原因是过量的蔗糖会造成菌种的渗透压增强，从而影响到菌种的生长及繁殖[15]，因此综合考虑，选择蔗糖添加量为7%、8%、9%进行下一步试验。
2.2.3 红茶菌发酵液接种量的确定
接种量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响见图3。
图3 接种量对红茶菌感官评分及总酸含量的影响
Fig.3 Effects of inoculation amount on sensory score and total acid content of kombucha
不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
发酵菌种的多少直接影响到发酵速度及品质。由图3可知，一定接种量范围内，红茶菌的感官评分及总酸含量随着接种量的增加而升高，接种量为6%时，感官评分达到最高（8.7分），添加量超过8%时，感官评分下降。主要由于接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成及废物代谢[20]；总酸含量在接种量为8%时含量最高，超过8%其含量下降，主要由于过多的菌种会引起营养缺乏、菌种早衰、自溶等状况，不利于酸类物质的生成[21]，因此综合考虑，选择接种量为5%、6%、7%进行下一步试验。
2.2.4 红茶菌发酵液发酵温度的确定
发酵温度对红茶菌感官评分及总酸含量的影响见图4。
图4 发酵温度对红茶菌感官评分及总酸含量的影响
Fig.4 Effects of fermentation temperature on sensory score and total acid content of kombucha
不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
温度是影响发酵速度和质量的一个重要因素。由图4可知，红茶菌的感官评分及总酸含量随着发酵温度的升高呈先升高后降低的趋势。发酵温度为30℃时红茶菌的感官评分及总酸含量最高，分别为8.89分和7.92 mg/mL；当发酵温度过低时菌种的生长代谢较慢，不利于总酸的生成和品质的稳定[7]；发酵温度过高时发酵菌种体内的酶会失活，同样不利于产品品质的稳定和酸物质的生成[8]。综上，选择发酵温度为29、30、31℃进行下一步试验。
2.2.5 红茶菌发酵液发酵时间的确定
发酵时间对红茶菌感官评分及总酸含量的影响见图5。
图5 发酵时间对红茶菌感官评分及总酸含量的影响
Fig.5 Effects of fermentation time on sensory score and total acid content of kombucha
不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05）。
发酵时间也是影响发酵品质的一个重要因素。由图5可知，红茶菌感官评分随着发酵时间延长呈先升高后降低的趋势。红茶菌发酵液在8 d时己达到发酵成熟的标准，其感官评分最佳，总酸含量相对较高，分别为8.73分和8 mg/mL，而发酵时间超过8 d后感官评分呈下降趋势，总酸含量虽有所上升但趋势缓慢，主要由于随着发酵时间的延长，菌种出现老龄化、产酸能力下降、代谢废物增强，从而影响风味和酸度[17]。综上所述，选择发酵时间为7、8、9 d进行下一步试验。
2.3 响应面法优化红茶菌发酵工艺结果
2.3.1 模型的建立及显著性检验
在单因素试验基础上，选择影响最显著的4个因素（蔗糖添加量、接种量、发酵温度、发酵时间）进行响应面法优化，试验结果见表4。
表4 响应面设计试验结果
Table 4 Response surface test results
试验号 A蔗糖添Y综合分值/%1 -1 -1 0 0 35.90 2 1 -1 0 0 27.12 3 -1 1 0 0 6.17 4 1 1 0 0 2.14 5 0 0 -1 -1 91.60 6 0 0 1 -1 74.82 7 0 0 -1 1 76.91 8 0 0 1 1 54.11 9 -1 0 0 -1 87.42 10 1 0 0 -1 79.83 11 -1 0 0 1 76.91 12 1 0 0 1 56.20 13 0 -1 -1 0 27.13 14 0 1 -1 0 12.55 15 0 -1 1 0 16.53 16 0 1 1 0 2.14 17 -1 0 -1 0 41.67 18 1 0 -1 0 35.44 19 -1 0 1 0 14.55 20 1 0 1 0 6.17 21 0 -1 0 1 85.40 22 0 1 0 -1 80.03 23 0 -1 0 1 78.03 24 0 1 0 1 41.65 25 0 0 0 0 91.56 26 0 0 0 0 97.80 27 0 0 0 0 92.24 28 0 0 0 0 97.87 29 0 0 0 0 91.56加量 B接种量 C发酵温度D发酵时间
用Design Expert 8.0.6软件进行多元回归分析，得到以下回归方程：Y=94.50-4.61A-10.41B-9.74C-9.63D+1.07AB-0.53AC-3.32AD+0.060BC-7.75BD-1.50CD-34.90A2-41.71B2-36.80C2+16.84D2。方差分析见表5。
表5 方差分析
Table 5 Analysis of variance
注：**表示差异极显著（p＜0.01）。
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 p值 显著性模型 31 868.73 14 2 276.34 87.24 ＜0.001 **A蔗糖添加量 255.39 1 255.39 9.79 0.007 4 **B接种量 1 301.04 1 301.04 49.86 ＜0.000 1 **C发酵温度 1 138.61 1 1 138.61 43.63＜0.000 1 **D发酵时间 1 111.69 1 1 111.69 42.60＜0.000 1 **AB 4.56 1 4.56 0.17 0.682 3 AC 1.13 1 1.13 0.043 0.837 9 AD 44.22 1 44.22 1.69 0.214 0 BC 0.014 1 0.014 5.519 0.981 6 BD 240.25 1 240.25 9.21 0.008 9 **CD 9.00 1 9.00 0.34 0.566 4 A2 7 898.34 1 7 898.34 302.69＜0.000 1 **B2 11 285.37 1 11 285.37 432.49＜0.000 1 **C2 8 786.05 1 8 786.05 336.71＜0.000 1 **D2 1 840.57 1 1 840.57 70.54＜0.000 1 **总残差 365.32 14 26.09失拟误差 332.14 10 33.21 4.00 0.096 7纯误差 33.18 4 8.29总和 32 234.05 28
由表5可知，以综合分值为响应值时，模型p＜0.01，表明二次方程模型极显著；同时失拟项p=0.096 7＞0.05，失拟项差异不显著，说明该方程对试验拟合情况好，试验误差小；4个因素对综合分值影响的大小依次为接种量＞发酵温度＞发酵时间＞蔗糖添加量。
2.3.2 响应面交互作用分析与优化
通过Design Expert 8.0.6软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图，结果如图6所示。
图6 试验因子交互作用对综合分值的影响
Fig.6 Influence of interaction of test factors on comprehensive indexes
响应曲面越陡峭表示因素之间的影响程度越大[22]。由图6可知，发酵时间与接种量交互的坡度很陡峭，说明两者交互作用对综合分值的影响极显著（p＜0.01），该结果与方差分析结果一致。此外，由Design Expert 8.0.6软件分析所得红茶菌发酵饮料的最优配方为蔗糖添加量7.97%、接种量5.92%、发酵时间7.04 d、发酵温度30.08℃，预测综合分值为98.61%。为了方便工业化生产最终将发酵工艺条件调整为蔗糖添加量8%、接种量6%、发酵时间7 d、发酵温度30℃，按最优工艺参数进行3次重复验证试验，结果取平均值，得到产品最终综合分值为98.12%，其中感官评分9.5分，总酸含量为8.61 mg/mL。优化后的产品比传统红茶菌发酵时间缩短了3 d～5 d[23]。
2.4 红茶菌发酵液理化指标的测定
对新型红茶菌、传统红茶菌、未发酵茶汤的理化指标对比分析，结果见表6。
表6 产品指标结果
Table 6 Products indicators results mg/mL
注：同列不同字母表示不同组间存在显著性差异（p＜0.05），ND表示未检出。
组别 总酸含量 总糖含量 总酚含量 甲酸含量 乙酸含量 丁酸含量 柠檬酸含量 乳酸含量新型红茶菌 8.61±0.87a 18.73±2.87c 1.39±0.15a 0.25±0.06b 3.13±0.81a 0.42±0.11a 0.67±0.21a 0.41±0.11a传统红茶菌 6.98±0.53b 26.78±3.77b 1.20±0.04b 0.32±0.04a 2.73±0.31b 0.31±0.05b 0.50±0.12b 0.33±0.05b未发酵茶汤 ND 158.00±3.67a 0.09±0.02c ND ND ND ND ND
由表6可知，新型红茶菌总酸、总酚含量高于传统红茶菌，而总糖含量低于传统红茶菌，表明新型红茶菌菌株产酸及代谢糖能力优于传统混合发酵剂。此外有机酸结果显示，除甲酸含量外，乙酸、丁酸、柠檬酸及乳酸含量在新型红茶菌中含量均优于传统红茶菌，差异显著（p＜0.05），乙酸、柠檬酸是一种酸味剂，不仅可改善产品的口感，也可防止杂菌的生长[24]，丁酸具有抗炎、降血糖、调节肠道菌群等功效[1]。
2.5 新型红茶菌与传统红茶菌感官评价结果
邀请10名专家及工作人员对新型红茶菌及传统红茶菌进行的感官品质分析，结果见表7。
表7 红茶菌感官评分
Table 7 Sensory score of kombucha
注：*表示差异极显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）。
组别 感官评分 口感风味 组织状态 色泽新型红茶菌 9.50±0.08 3.73±0.12 2.72±0.03 3.05±0.03传统红茶菌 8.96±0.06** 3.30±0.05** 2.66±0.02* 3.00±0.04
由表7可知，新型红茶菌感官评分高于传统红茶菌，新型红茶菌感官评分为9.50，传统红茶菌为8.96，差异极显著（p＜0.01），且主要差异表现在口感风味，新型红茶菌口感风味值为3.73，而传统红茶菌值为3.30。分析原因为传统红茶菌发酵菌种复杂，含有风味不佳的菌种，如鲸杆菌（Cetobacterium）、亚栖热菌（Meiothermus）等影响了产品的口感风味[23]，此外工艺优化后的新型红茶菌酸甜可口、口感纯正，因此新型红茶菌口感更佳。
3 结论
通过对发酵菌株的复配比例研究及发酵工艺条件的优化，最终得出新型红茶菌最佳配方为木糖驹形氏杆菌1512∶拜耳接合酵母菌1484∶植物乳杆菌1298体积比2∶1∶1、接种量6%、茶叶添加量1.0%、蔗糖添加量8%、发酵时间7 d、发酵温度30℃，在此条件下制备的红茶菌感官评分、总酸、总糖、总酚含量分别为 9.5 分、8.61、18.73、1.39 mg/mL，该产品较传统红茶菌发酵时间短、总酸、总酚含量高、总糖含量低、口感更加和谐。以上结果为红茶菌饮料实现标准化、工业化提供了一定的理论基础，但具体风味成分的分析及饮料功效的作用等方面还需进一步探索。
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