银耳（Tremella fuciformis）又称白木耳、雪耳，为担子菌门真菌银耳的子实体，是一种药食兼用真菌，享有“菌中之冠”的美誉[1]。银耳中含有丰富的营养物质，如多糖、蛋白质、膳食纤维、维生素和矿物质等[2]。银耳多糖是银耳中最主要的生物活性成分，具有免疫调节、抗氧化、补水保湿、美容润肤等功效，因其本身无毒副作用，在近年来引起国内外的广泛关注[3-5]。Jiang等[6]的研究发现银耳多糖可以诱导单核细胞产生免疫因子，通过提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞水平来调节免疫作用。张黎君[7]的研究通过单因素和正交试验确定了复合酶-鞣酸法提取银耳多糖的最佳工艺，并对纯化后多糖的吸湿保湿性进行了研究，将其应用于保湿性口红。吴依娜[8]的研究发现采用闪式提取法从银耳中获得银耳多糖，将其添加到橄榄油精华液中，可以用来改善受损发束的保湿性和弹性。由此可知，银耳多糖具有市场价值，正逐渐应用于食品、医药、化妆品等各个领域，而银耳多糖的提取优化和生物活性仍是当前研究的前提与关键。本试验以银耳多糖为原料，采用单因素和响应面试验，优化得到银耳多糖的最佳提取工艺，对纯化后银耳多糖的抗氧化和吸湿保湿性能进行探究，旨在为银耳多糖的开发利用提供理论和实践基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干银耳：福建省古田县大丰工贸有限公司，于80℃烘干备用。
透明质酸钠：华西福瑞达生物医药有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘油、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、正丁醇、三氯甲烷、无水碳酸钠、无水硫酸铵、变色硅胶、抗坏血酸（vitamin C，VC）、硫酸亚铁、过硫酸钾：天津科密欧试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TDL-5A台式离心机：上海菲怡尔分析仪器有限公司；ALC-2103电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅、DHG-9246A电热鼓风干燥机、DZF-6050真空冷冻干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；S3打浆机：东莞市阿道夫电器有限公司；透析袋（截留分子量3 500 Da）：北京经科宏达生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 银耳多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[9]测定银耳多糖含量。准确配制1 mg/mL葡萄糖标准溶液，移取葡萄糖标准溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 于 6 个试管中，分别加水补至2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀后迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置于沸水浴中10 min，冷却至室温（25℃），于波长490 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[10]。曲线回归方程：y=12.270 0x+0.036 7，相关系数R2=0.999 1。按下式计算银耳多糖提取率。
式中：C为稀释后多糖浓度，mg/mL；V0为多糖提取液体积，mL；N为稀释倍数，mL；V1为供试样品体积，mL；M 为干银耳质量，mg。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 液料比对银耳多糖提取率的影响
分别称取干银耳2 g于不同的锥形瓶中，按照液料比 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1（mL/g）加入蒸馏水，于打浆机中打浆5 min后取出，置于80℃水浴锅中浸提4 h，然后在4℃条件下，5 000 r/min离心10 min得上清液，即银耳多糖提取液，计算提取率。
1.3.2.2 提取温度对银耳多糖提取率的影响
分别称取干银耳2 g于不同的锥形瓶中，各加入120 mL蒸馏水，于打浆机中打浆5 min后取出，分别置于 60、70、80、90、100 ℃水浴锅中浸提 4 h，然后在 4 ℃条件下，5 000 r/min离心10 min得上清液，即银耳多糖提取液，计算提取率。
1.3.2.3 提取时间对银耳多糖提取率的影响
分别称取干银耳2 g于不同的锥形瓶中，各加入120 mL蒸馏水，于打浆机中打浆5 min后取出，分别置于 80℃水浴锅中浸提 2、3、4、5、6 h，然后在 4 ℃条件下，5 000 r/min离心10 min得上清液，即银耳多糖提取液，计算提取率[11-14]。
1.3.3 响应面优化试验
在单因素试验基础上，运用Box Behnken中心组合设计原理，以液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）作为自变量，多糖提取率作为响应值，设计三因素三水平试验进行响应面分析，从而获得银耳多糖的最佳提取条件，响应面水平如表1所示。
表1 响应面因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface
水平A液料比/（mL/g）B提取温度/℃C提取时间/h-1 01 60∶1 70∶1 80∶1 80 90 100 456
1.3.4 银耳多糖的纯化
将多糖提取液加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜12 h，8 000 r/min离心10 min，收集沉淀，并加入适量蒸馏水溶解，之后再加入1/2体积比Sevage试剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1），振荡30 min后，于4℃条件下，8 000 r/min离心10 min，得上层清液，重复多次直至无明显蛋白质层出现为止。将去蛋白后的银耳多糖溶液放入3 500 Da的透析袋中透析72 h，收集多糖溶液于真空冷冻干燥箱冻干得到银耳多糖干品[15]。
1.3.5 银耳多糖抗氧化活性的测定
根据刘瑞馨等[16]的方法，稍作修改，分别配制浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 银耳多糖溶液，以VC作为对照组，计算银耳多糖对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的清除率来探究银耳多糖的抗氧化活性。
1.3.6 多糖吸湿保湿性能的测定
以银耳多糖干品、透明质酸钠、甘油为样品，比较各组样品的吸湿保湿性能。
分别称取0.100 g的银耳多糖、透明质酸钠、甘油于玻璃培养皿中，25℃条件下将培养皿置于饱和碳酸钠溶液（相对湿度43%）和饱和硫酸铵溶液（相对湿度81%）的干燥器中，分别在 1、3、6、12、24、36、48 h 称量样品和培养皿质量[17]。按下式计算吸湿率。
式中：W2为初始样品和培养皿的质量，g；W1为特定时间吸湿后样品和培养皿的质量，g；W0为初始样品质量，g。
分别称取0.500 g的银耳多糖、透明质酸钠、甘油于玻璃培养皿中，并均匀加入0.200 g蒸馏水，25℃条件下将玻璃培养皿置于变色硅胶（相对湿度0%）的干燥器中，分别在 1、3、6、12、24、36、48 h 称量培养皿和样品质量[18-19]。按下式计算保湿率。
式中：W0为初始水的质量，g；W1为特定时间后的水分质量，g。
1.3.7 数据分析
试验均设置3组平行，数据采用Origin软件作图，结果以平均值±标准差表示，在“响应面方法”中，使用Design Expert 8.0.6软件进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 液料比对多糖提取率的影响
不同液料比对多糖提取率的影响见图1。
图1 液料比对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of liquidto-material ratio on the extraction rate of polysaccharides
由图 1 可知，当液料比在40∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）内，多糖提取率呈上升趋势，在70∶1（mL/g）时达到最大，为（17.70±0.23）%，之后多糖提取率逐渐下降，可能是由于增加溶剂体积有利于增大其与浸提物的接触面积，促进多糖的溶出，当溶剂达到一定体积时多糖溶出达到饱和，提取率会趋于平稳或者缓慢下降[20]，综合考虑响应面优化试验的液料比选择60∶1、70∶1、80 ∶1（mL/g）。
2.1.2 提取温度对多糖提取率的影响
不同提取温度对多糖提取率的影响见图2。
图2 提取温度对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides
如图2所示，随着提取温度的升高，多糖提取率呈先上升后下降趋势，当提取温度为90℃时，多糖提取率达到（17.45±0.19）%，这说明提取温度的升高会增加溶剂分子和溶质分子的运动，从而促进扩散作用，有利于提高多糖提取率。但提取温度过高，可能会使多糖降解从而导致提取率降低[21]，因此，响应面试验的提取温度选择 80、90、100℃。
2.1.3 提取时间对多糖提取率的影响
不同提取时间对多糖提取率的影响见图3。
图3 提取时间对多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides
由图3可知，随着提取时间的延长，多糖提取率持续升高，提取时间为2 h～4 h时，多糖提取率变化明显，说明多糖溶出需要一定时间，在5 h时多糖提取率达到（15.31±0.18）%，之后多糖提取率变化较小，因此，响应面试验的提取时间选择4、5、6 h。
2.2 响应面优化结果
响应面试验设计及试验结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface test design and results
试验号 A液料比 B提取温度 C提取时间 Y多糖提取率/%1 1 0 -1 18.32±0.22 2 0 0 0 21.09±0.19 3 0 1 -1 18.68±0.24 4 0 0 0 21.22±0.12 5 0 -1 1 17.89±0.17 6 0 0 0 21.15±0.21 7 1 -1 0 17.99±0.15 8 -1 1 0 18.58±0.09 9 0 -1 -1 17.71±0.11 10 1 1 0 19.81±0.26 11 0 0 0 21.11±0.14 12 1 0 1 17.88±0.22 13 0 1 1 17.32±0.25 14 0 0 0 20.29±0.07 15 -1 0 1 16.16±0.13 16 -1 0 -1 17.50±0.13 17 -1 -1 0 15.41±0.11
利用Design Expert 8.0.6软件对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到的二次方程如下。
方差分析结果如表3所示。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Regression model analysis of variance
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 47.75 9 5.31 10.70 0.002 5 **A 5.04 1 5.04 10.16 0.015 3 *B 3.63 1 3.63 7.32 0.030 4 *C 1.10 1 1.10 2.21 0.180 8 AB 0.46 1 0.46 0.92 0.369 7 AC 0.20 1 0.20 0.41 0.543 2 BC 0.59 1 0.59 1.20 0.310 4 A2 12.60 1 12.60 25.40 0.001 5 **B2 7.06 1 7.06 14.23 0.007 0 **C2 13.30 1 13.30 26.82 0.001 3 **残差 3.47 7 0.50失拟项 2.88 3 0.96 6.49 0.051 2纯误差 0.59 4 0.15总变异 51.22 16
对二次模型进行方差分析，从表3中可以看出，该模型P＜0.01，具有极显著性，失拟项P＞0.05，意味着失拟项相对于纯误差不显著，决定系数R2=0.932 2＞90%，说明该模型拟合程度良好，误差较小，该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系[22]。一次项中A液料比与B提取温度对多糖提取率的影响具有显著性，C提取时间的影响不显著；交互项AB、AC、BC均不显著；二次项均达到极显著水平。由回归模型显著性分析可知3个因素的主次顺序为液料比＞提取温度＞提取时间。
2.3 响应面分析
根据回归分析得到的结果，作出相应的响应面图和等高线图，见图4～图6。
图4 液料比与提取温度对多糖提取率的响应面与等高线图
Fig.4 Response surface and contour plots of the effect of liquid-to-material ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides
图5 液料比与提取时间对多糖提取率的响应面与等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of liquid-to-material ratio and extraction time on the extraction rate of polysaccharides
图6 提取温度与提取时间对多糖提取率的响应面与等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of extraction temperature and time on the extraction rate of polysaccharides
如图4～图6所示，提取温度和液料比对多糖提取率的影响曲线较陡，说明其影响作用较为显著，而提取时间的影响曲线较为平滑，说明影响不显著，因素间的相互作用影响不显著。
通过响应面试验得到最佳提取条件为液料比79.33∶1（mL/g）、提取温度 91.48℃、提取时间 4.94 h，多糖提取率20.24%。为了验证工艺参数的可靠性，结合实际操作的方便性，将试验工艺参数调整为液料比79 ∶1（mL/g）、提取温度 91℃、提取时间 5 h，采取 3组试验进行验证，多糖提取率为（20.29±0.15）%，与预测结果接近。
2.4 银耳多糖的抗氧化性测定结果
采用3种方式评价银耳多糖的抗氧化能力，以VC作为阳性对照，测定不同浓度样品对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除率见图7～图9。
图7 银耳多糖对DPPH自由基清除率的影响
Fig.7 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on DPPH radical scavenging rate
图8 银耳多糖对羟基自由基清除率的影响
Fig.8 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on hydroxyl radical scavenging rate
图9 银耳多糖对ABTS+自由基清除率的影响
Fig.9 Effect of Tremella fuciformis polysaccharides on ABTS+radical scavenging rate
由图7～图9可知，DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除作用均随银耳多糖溶液浓度的升高而逐渐增强，表明银耳多糖质量浓度与清除率呈量效关系[23]。银耳多糖对DPPH自由基清除率随浓度上升变化较小，对羟基自由基和ABTS+自由基的清除率随浓度增加变化较大，5 mg/mL时，DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除率分别为47.31%、47.43%、52.14%，银耳多糖对3种自由基的清除率是VC的50%左右。说明银耳多糖具有一定的抗氧化能力，但与VC相比仍有一定的差距。
2.5 银耳多糖的吸湿保湿性能
在相对湿度43%和相对湿度81%环境下，分别探究了银耳多糖、透明质酸钠和甘油的吸湿性，结果见图10。
图10 不同相对湿度条件下样品的吸湿率变化情况
Fig.10 Comparison of the moistureabsorption rate of the samples under different relative humidity
a.相对湿度43%条件下样品的吸湿曲线；b.相对湿度81%条件下样品的吸湿曲线。
由图10可知，在相对湿度43%条件下，银耳多糖和透明质酸钠吸湿速度较慢，且在24 h左右几乎不再吸水，而甘油的吸湿效果最好。在48 h时，甘油、透明质酸钠、银耳多的吸湿率分别为83.03%、33.50%、25.15%。在相对湿度81%条件下，银耳多糖和透明质酸钠吸湿较低，在48 h时的吸湿率分别为53.50%、44.75%。而甘油具有极强的吸湿性，在48 h时吸湿率达到122.65%。3种样品的吸湿速率均随着时间的延长而逐渐减慢，且在相对湿度较大的环境中，相同时间内吸湿率普遍较高。由此可知，样品的吸水作用与水分的蒸腾作用是同时进行的，当两者达到动态平衡，吸湿率趋于不变，空气湿度越大，样品的吸湿率越大，这与孔合心等[24]的研究结果一致，符合二级吸附动力学模型[25]。
在干燥硅胶环境中，分别研究了银耳多糖、透明质酸钠和甘油的保湿性，如图11所示。
图11 在干燥硅胶条件下样品的保湿率
Fig.11 The moisture retention rate of the samples under dry silica gel condition
由图11可知，在干燥环境下，3种样品水分含量快速降低，随着时间的延长水分的散失开始变得缓慢，银耳多糖和透明质酸钠在各个时间点的保湿效果相差较小。在48 h时，透明质酸钠、银耳多糖、甘油的保湿率分别为49.50%、42.15%、23.25%，银耳多糖的保湿效果与透明质酸钠接近。与甘油相比，银耳多糖和透明质酸钠中的亲水基团能更好地降低水分有效扩散系数，导致水分扩散能力减弱，从而表现出良好的持水保湿作用[26]。
3 结论
本文分析了液料比、提取温度和提取时间3个因素对银耳多糖提取率的影响，此外，探究了银耳多糖的抗氧化和吸湿保湿性能。最终得到银耳多糖最佳提取工艺为液料比79∶1（mL/g）、提取温度91℃、提取时间5 h，在此条件下多糖提取率达到（20.29±0.15）%；对3种自由基均有不错的清除能力，且银耳多糖浓度越高，清除能力越强，表明了银耳多糖具有一定的抗氧化能力；在不同相对湿度环境中，银耳多糖的吸湿性较弱，低于甘油和透明质酸钠；但在干燥环境中具有良好的保湿性，远高于甘油，与透明质酸钠接近。银耳多糖无任何毒副作用，易于提取且成本较低，可作为天然的抗氧化剂和保湿剂应用于食品、化妆品等行业。
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