硒是人和动物体内必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗炎、防止心脑血管疾病等广泛的生物学功能，并且可以通过产生活性甲状腺激素有效预防轻度浸润性突眼病（graves' ophthalmopathy，GO）的恶化、发挥抗艾滋病等作用[1-5]。硒元素还具有拮抗重金属毒性、延缓衰老、提高生殖机能的作用。在人体内硒元素主要以硒蛋白的形式发挥生理学功能，包括谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶和甲状腺激素脱碘酶等[6]。研究表明，人体吸收硒元素的主要形式为有机硒，少量是以无机硒的形式吸收[7]。根据中国营养学会发布的《中国居民膳食营养素参考摄入量（2013版）》，成人硒元素推荐摄入量为60 μg/d，平均需要量为50 μg/d[8]，而中国居民日常饮食中硒摄入量平均值为43.3 μg/d，部分区域居民摄入量严重低于中国居民平均需要量标准[9]。
茶叶为中国最普遍的饮料，含有多种与人体健康密切相关的有机物质和无机元素。茶叶中对人体健康有益的无机元素包括钙、镁、锌、铁、铜、锰、硒等。茶树可通过生物富集和转化作用，把非生物活性和毒性较高的无机硒转化为安全有效、毒性低的有机硒[10-12]。据报道，茶水中浸出的硒绝大部分是有机硒[13]，因此通过饮茶的方式补充硒元素是一种有效的补硒途径。而现有含硒茶叶的相关研究大部分集中在茶叶产地、种植方式与硒含量的关系、茶叶对土壤或肥料中的硒元素吸收方式和程度等，而缺乏茶叶浸泡时间、饮茶日常习惯对硒溶出和摄入量影响的相关研究。人们通常饮用的是茶汤而少见直接食用茶叶，因此浸泡时间、饮茶习惯和茶叶处理方式直接影响硒元素的溶出度，而茶汤中硒元素的浓度进一步影响人体对硒元素的摄入程度。据此，本文以3种不同种类茶叶（红茶、青茶和绿茶）作为研究对象，建立一种可靠、稳定、简便的检测茶叶中硒元素含量的方法，分别测定3类茶叶中硒元素含量，并进一步模拟人们日常饮茶方式，采用室温（25±2）℃下沸水泡制茶叶的方法，揭示茶汤中硒元素溶出量随浸泡时间的变化趋势，为人们提供不同种类高含硒茶的正确饮用方式，并为富硒茶和高含硒茶叶的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青茶（乌龙茶）、红茶：诏安市月之港茶业有限公司；绿茶（Ⅰ）：湖北宣恩维民实业有限公司；绿茶（Ⅱ）：市售恩施高山绿茶。
硒标准溶液（1 000 μg/mL）：国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；硝酸、盐酸、氢氧化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硼氢化钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；30%过氧化氢（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。
硒标准使用液（1 μg/mL）：精密量取 1 000 μg/mL硒标准溶液100 μL于100 mL容量瓶中，用10%盐酸溶液定容至刻度，混匀，过滤，备用。
另配制10%盐酸溶液、6 mol/L盐酸溶液、0.5%氢氧化钾+1.0%硼氢化钾溶液（还原剂）等备用。
1.2 仪器与设备
SK-2003氢化物原子荧光光谱仪：北京金索坤技术开发有限公司；MARS6微波消解仪：美国CEM仪器公司；HI-1000恒温电热板：亚速旺（上海）商贸有限公司；TG16G型低速台式离心机：上海赵迪生物科技有限公司；FA1004N型电子天平：上海菁华科技仪器有限公司；XMTD-8222型电热鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；Direct-Q3超纯水系统：美国密理博公司；JOYN-30AL型智能超声波清洗机：上海乔跃电子有限公司。
1.3 茶叶和茶汤中硒含量测定的前处理方法
消解：将准备好的青茶（乌龙茶）、红茶、绿茶（Ⅰ）、绿茶（Ⅱ）的茶叶样品进行烘干、称量、粉碎，过80目尼龙筛，分别装袋，放置干燥器中，备用。分别称取已粉碎好的茶叶样品0.500 0 g（茶汤中硒含量检测时，取浸泡后的茶汤10 mL。其后续处理与茶叶样品相同），置于清洗干净且干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸10 mL，使样品充分浸没，轻轻振摇混合均匀，在室温（25±2）℃下敞口静置10 min，再加入1 mL过氧化氢，预消解30 min，放置于微波消解仪内，按照设定程序（见表1）进行消解。
表1 微波消解仪的设定参数
Table 1 Parameters of microwave digestion
步骤 功率/W 升温时间/min 温度/℃ 恒温时间/min 1 1 400 5 120 8 2 1 400 3 150 10 3 1 400 6 180 20
赶酸：消解完毕后冷却至室温（25±2）℃，将消解液转入50 mL锥形烧瓶中，在电热板上设定120℃，加热赶酸至近干，取下冷却，再加入6 mol/L盐酸溶液5.0 mL，在90℃继续加热至溶液澄清、无色或略带黄色的状态，将溶液体积加热至约1 mL，冷却，转移至100 mL容量瓶中，用10%盐酸溶液定容，混匀，将定容好的样品溶液用针筒式滤膜（孔径0.45 μm）过滤器过滤，滤液装于干净的容量瓶中摇匀，待测。每个样品平行处理3份，每份平行测定3次。
消解和赶酸时，以相应质量或体积的超纯水作为茶叶和茶汤的空白对照。
1.4 茶叶中硒含量和茶汤中硒溶出率测定
茶叶中硒含量测定：茶叶按照1.3的样品处理方法消解、赶酸、过滤，用SK-2003氢化物原子荧光光谱仪测定。
茶汤中硒溶出率测定：预先将实验室温度调节为恒温（25±2）℃，分别称取红茶、绿茶（Ⅰ）和青茶（乌龙茶）0.500 0 g各10份，分别加入沸腾纯净水50 mL，每组茶汤分别浸泡 0、5、10、15、20、40、60、120、180 min和300 min，过滤并记录过滤时滤液的温度。分别按照1.3的样品处理方法消解、赶酸、过滤，用SK-2003氢化物原子荧光光谱仪，在最佳条件下测定茶汤中的硒元素含量。硒溶出率计算公式如下。
式中：C为茶汤中硒质量浓度，μg/L；V为茶汤总体积，L；M为冲泡茶叶中所含硒质量，μg（M=茶叶中硒质量浓度×茶叶质量）。
1.5 定量分析方法学验证
1.5.1 标准曲线的绘制
准确量取硒标准使用液 0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL，用10%盐酸溶液分别定容至100 mL，混匀，使得硒标准系列溶液浓度梯度为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、15.00 μg/L。用氢化物原子荧光光谱仪在最佳工作条件下（以上述标准系列溶液中的0 μg/L浓度溶液作为空白对照），由稀到浓依次测量标准系列溶液荧光值，以荧光值作为纵坐标，浓度作为横坐标绘制标准曲线。
1.5.2 检出限的确定
取1.5.1中标准系列溶液中的0 μg/L浓度溶液，按照1.3的样品制备方法处理，共测定硒含量11次。计算公式为检出限=平均数+常数×标准偏差（所取指数为 3）。
1.5.3 准确度与精密度的测定
向绿茶（Ⅱ）茶叶中加入适量硒标准溶液，使茶叶中硒元素的低、中、高浓度分别为60、180 μg/kg和540 μg/kg；另向浸泡30 min并过滤后的绿茶（Ⅱ）茶汤中加入适量硒标准溶液，使茶汤中的硒元素低、中、高浓度分别为0.3、0.9 μg/L和2.7 μg/L。采用1.3中的方法制备，用原子荧光光谱仪在最佳条件下分别检测不同浓度硒元素加标的茶叶和茶汤，回收率采用单点校正法计算。同一天内每个质量浓度测5个平行，计算日内相对标准偏差，每种样品重复5 d，计算日间相对标准偏差。检测时未加标样品作为空白对照，减除背景值，计算其回收率与精密度。计算公式为回收率/%=[加标浓度（μg/kg或μg/L）-空白样品浓度（μg/kg或μg/L）]/加标浓度（μg/kg或μg/L）×100。
2 结果与分析
2.1 仪器最佳工作条件的确定
参考仪器对硒元素测定的推荐值，通过加标回收率试验优化验证后确定。通过1.5中的准确度与精密度试验验证后确定的氢化物原子荧光光谱仪最佳参数为主泵转速100 r/min、负高压270 V、灯电流70 mA、炉高8mm、采样延时10s、泵停延时10s、稀释延时10s、载气流量600 mL/min、辅气流量800 mL/min。
2.2 标准曲线、线性范围及检出限的确定
在氢化物原子荧光光谱仪最佳条件下，对硒标准系列溶液进行测定，每个试样平行重复3次，取其平均值，并绘制标准曲线。结果表明，线性回归方程为y=105.171x+5.667，线性相关系数＝0.999 1。在设定浓度0～15.00 μg/L范围内有良好的线性关系和相关性，符合本文定量分析要求。光学分析方法公式计算得到的茶汤和固体茶叶中检出限分别为0.003 26 μg/L和0.006 50 μg/kg。
2.3 加标回收率与精密度测定结果
为减少背景值数，降低仪器检测灵敏度对加标回收率数据的干扰，选取硒含量较低的绿茶（Ⅱ）作为加标回收率试验对象进行检测，其加标回收率与相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果见表2。
表2 茶叶和茶汤中硒元素加标平均回收率（n=3）
Table 2 Average recovery rate of selenium in tea and tea infusions（n=3）
茶叶 茶汤硒加标量/（μg/kg） 回收率/% RSD/% 硒加标量/（μg/L） 回收率/% RSD/%images/BZ_65_1780_2889_1801_2915.png60 87.37 3.33 0.30 106.90 5.67 180 83.87 1.85 0.90 115.56 2.00 540 87.26 0.46 2.70 88.88 0.17
由表2可知，茶叶和浸泡茶汤中硒加标回收率分别在83.87%～87.37%和88.88%～115.56%之间，RSD在0.17%～5.67%，均可满足定量分析方法学要求和实际测样需求。
2.4 茶叶中硒元素含量分析
采用氢化物原子荧光光谱仪-微波消解方法，测定红茶、绿茶（Ⅰ）和青茶（乌龙茶）中硒元素含量，平行3 次，结果分别为 104.27、179.93 μg/kg和 149.48 μg/kg，RSD分别为0.75%、0.45%和0.38%。根据NY/T 600-2002《富硒茶》[14]，富硒茶定义为富硒区土壤上生长的茶树新梢的芽、叶、嫩茎，经过加工制成，可供直接饮用，含硒量在 250 μg/kg～400 μg/kg内的茶叶。本文选取的3种茶叶中硒元素含量相对较高，但均低于行业标准规定的富硒茶标准含量。
2.5 茶汤中硒元素动态溶出特性
选择含硒量较高的红茶、青茶（乌龙茶）和绿茶（Ⅰ）3种茶叶作为研究材料，模拟人们平时喝茶习惯，采用沸水浸泡茶叶的方法，室温（25±2）℃下分别浸泡5、10、15、20、40、60、120、180 min 和 300 min 后取样检测茶汤中溶出的硒元素含量，研究茶汤中硒元素含量随浸泡时间的变化规律。室温（25±2）℃下茶叶浸泡过程中茶汤温度随时间变化规律见图1。
图1 茶汤温度随时间的变化规律（n=3）
Fig.1 Temperature changes of tea infusions（n=3）
茶叶和茶汤中硒元素含量和溶出率动态变化规律结果见表3和图2。
表3 红茶、青茶和绿茶茶汤中硒溶出特性与浸泡时间的动态变化规律（n=3）
Table 3 Selenium dissolution in infusions of black tea，oolong tea and green tea（n=3）
浸泡时间/min红茶 青茶（乌龙茶） 绿茶（I）平均值/（μg/kg）RSD/%溶出率/%平均值/（μg/kg）RSD/%溶出率/%平均值/（μg/kg）RSD/%溶出率/%5 2.52 0.23 2.42 5.64 0.23 3.77 10.38 0.19 5.77 10 15.42 3.63 14.79 31.11 0.27 20.81 32.80 1.94 18.23 15 25.84 2.19 24.78 62.49 1.23 41.80 60.25 6.27 33.49 20 37.06 1.76 35.53 97.84 0.07 65.44 81.38 1.03 45.24 40 56.45 1.49 54.12 78.89 0.78 52.77 106.85 0.93 59.39 60 71.24 0.33 68.31 59.06 1.88 39.50 117.45 0.48 65.29 120 39.99 1.95 38.34 39.69 2.35 26.55 121.46 0.66 67.51 180 10.34 5.36 9.91 10.70 5.21 7.16 110.10 0.81 61.20 300 10.09 0.42 9.67 10.35 0.25 6.92 83.31 0.61 46.31
图2 室温下沸水浸泡茶叶中的硒元素溶出动态规律（n=3）
Fig.2 Dynamic law of selenium dissolution in tea infusions at room temperature（n=3）
由图1可知，室温（25±2）℃下茶汤温度40 min内从沸腾状态急速下降到40℃，冷却到30℃所需时间为60 min。之后直至300 min，茶汤温度下降速度相对趋缓。
由表3和图2可知，用沸水浸泡红茶、青茶（乌龙茶）和绿茶（Ⅰ）茶叶后，浸泡时间在20 min～120 min时，3种茶叶中硒元素溶出量均有高峰值出现。浸泡5 min～20 min时，绿茶茶汤中的硒含量急剧升高，浸泡40min～180min时，硒含量相对稳定，浸泡120 min时硒含量达到峰值，其硒质量浓度为121.46 μg/kg。红茶和青茶茶汤中硒溶出量达到峰值的时间分别为60 min和20 min，硒质量浓度分别为 71.24 μg/kg 和 97.84 μg/kg，之后缓慢下降至10.09 μg/kg和 10.35 μg/kg。
红茶、青茶（乌龙茶）和绿茶（Ⅰ）的硒元素最大溶出率分别达到68.31%、65.44%和67.51%。硒溶出量达到最高峰之后，绿茶（Ⅰ）与其它两种茶的溶出特性有较为明显的区别，硒含量下降趋势更缓慢，浸泡到300 min时的绿茶（Ⅰ）茶汤中的硒质量浓度为83.31 μg/kg（见表3），相应的溶出率却仅下降为46.31%。
3 讨论与结论
3.1 样品前处理
微波消解-氢化物原子荧光光谱仪方法测定茶叶中的硒元素含量时，前处理方法的选择对测定结果可靠性的影响较大。目前常用前处理方法，包括干法消解、湿法消解、微波消解等。其中湿法消解方法具有消化完全、元素损失少等优点，但每次处理样品量少，且消化过程中易产生爆沸，有一定的安全隐患。干法消解方法一次可处理大批量样品，但存在茶叶消化处理不彻底的现象。而微波消解法结合了高压消解和微波快速加热两方面的性能，能直接穿透样品内部，具有加热速度快、均匀、无温度梯度、无滞后效应等特点。微波消解是在密闭条件下进行，因此易挥发元素的损失相对较少、消解效率高、速度快、化学试剂用量少、交叉污染小，尤其适合难溶样品和生物试样，可从整体上提高样品消解和测定的速度和质量[15-17]。考虑各种前处理方法的优、缺点和实测对比后，本研究采用微波消解法处理茶叶样品，进行详细的定量分析方法学研究。结果表明，固体茶叶和浸泡茶汤中硒元素加标回收率分别在83.87%～87.37%和88.88%～115.56%之间，RSD在0.17%～5.67%范围内，符合定量分析方法学要求。GB 5009.93—2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》[18]中的检测限相关表述为当样品用量为1 g时，最低检出浓度为0.001 mg/L。相较于上述国标方法，本方法茶汤和茶叶中检出限更低，分别为0.003 26 μg/L和0.006 50 μg/kg。但采用的前处理方法复杂，适合硒含量较低样品的精密检测。
3.2 茶汤中硒元素溶出规律
此前，关于茶叶中硒元素溶出率相关研究较少，有限的研究文献也主要集中在优化茶水比、浸泡温度、浸泡时间和茶叶粒径等单一因素对单一品牌茶叶在浸泡过程中硒溶出量的影响。如郑宏彬等[19]的研究发现，最优浸泡条件为浸泡温度100℃、浸泡时间6 min、茶水比2∶50（g/mL）。在最优浸泡条件下，硒的溶出量为385.57 ng/g，且一道茶汤中硒的浸出率约为12%，分别是二道茶汤和三道茶汤的3倍和6倍～7倍。黎梅雨等[20]研究了不同浸泡条件对紫阳富硒茶中硒溶出的影响。结果表明，当浸泡温度100℃、浸泡时间3 min、料液比为1∶100（g/mL）、浸泡次数为2次时紫阳富硒茶中的硒元素溶出较多。根据多数研究报道，最佳浸泡温度均为100℃或沸水，浸泡时间3 min～6 min之间，茶水比 1∶25（g/mL）～1∶100（g/mL）。导致不同研究结果的原因主要在于茶叶产地或茶叶品种不同。上述研究设计中缺乏考虑人们平时饮茶习惯和自然饮用状态下的硒元素溶出和摄入的综合因素。本研究结果表明，沸水浸泡红茶、青茶（乌龙茶）和绿茶（I）时，不同茶叶中的硒溶出率不同，其溶出率时间曲线也有着很大的差异。在室温（25±2）℃下，当茶水比为0.5∶100（g/mL）时，红茶、青茶（乌龙茶）和绿茶（I）中硒溶出率峰分别出现在20、60 min和120 min，溶出率分别达到68.31%、65.44%和67.51%。达到高峰后随着时间的推移和浸泡水温的下降，硒元素在水中的溶出率也缓慢下降。3种茶叶的共同特点是浸泡前20 min内硒元素溶出率急剧上升，达到高峰后绿茶中的硒溶出率比青茶和红茶下降更缓慢。当泡制时间达到300 min时，红茶和青茶中的硒质量浓度已下降到10.09 μg/kg和10.35 μg/kg，而绿茶中的硒质量浓度仅下降到83.31 μg/kg。因此，用红茶和青茶作为补硒饮品时浸泡时间不宜过长。茶汤中硒含量迅速下降的原因可能是红茶和青茶的加工程序繁杂，茶叶中物质成分较多，含有大量有机大分子物质。在浸泡过程中随着水温的下降，已经溶出的硒元素与茶汤中的大分子物质结合，进一步集聚生成颗粒物沉淀，在茶汤过滤时被去除。3种茶叶沸水浸泡的前期，茶汤中硒溶出率较高，其原因在于水溶性物质在水温较高时易于溶出。再结合本研究结果，可以总结为不同浸泡条件对不同种类茶叶中硒元素溶出率的影响不同。但红茶和青茶后期硒溶出率下降比绿茶更明显，因此在二道茶中的硒含量是否更高，还需进一步比较研究。
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