菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）又称花蛤、杂色蛤等，北方俗称蛤蜊，隶属于双壳纲、蛤蜊科，广泛分布于辽宁、山东、福建等南北海区，是我国近海四大养殖贝类之一[1]，其产量大、价格不高，且肉味鲜美，营养丰富，已成沿海地区百姓餐桌常见的一种水产品。目前，菲律宾蛤仔主要以生鲜形式销售，少部分加工成罐头等形式，产品附加值低。传统中医认为菲律宾蛤仔可入药，《中华本草》中也记载其药效。现今已有大量研究报道，菲律宾蛤仔富含多肽、多糖、糖胺聚糖、糖蛋白等生物活性物质[2-4]，具有抗氧化[5-6]、降血糖[7]、降血脂[8]、抗肿瘤[9-10]、抑菌[11]、抗凝血[12]、促进铁吸收[13]等活性。
糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），属于一种杂多糖，是一类由重复的二糖结构单一组成的带有负电荷的长链大分子，具有羧基和硫酸基团[14]。学者认为，多糖的生物活性与它的分支度、溶解性、空间结构、取代基种类等因素密切相关[15-16]。GAGs结构特殊，其二糖单位为己糖醛酸和己糖胺，具有较强的生物活性[17]，成为生物高分子中的研究热点。近年来，国内外已从海参[18]、牡蛎[19]、扇贝[20]、合浦珠母贝[21]等海洋生物中分离到了GAGs。因此，本文以养殖菲律宾蛤仔为原料，采用水酶法提取GAGs，并通过离子色谱、紫外光谱、傅里叶红外光谱及核磁共振技术对提取到的GAGs进行分离纯化与结构表征，为该GAGs的结构研究奠定基础，也为菲律宾蛤仔等海洋贝类的高值化应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菲律宾蛤仔：福建省莆田市海源实业有限公司；DEAE-650M纤维素：日本TOSOH公司；硫酸软骨素、阿利新蓝8GX：阿拉丁试剂（上海）有限公司；中性蛋白酶（5×104U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
旋涡混合仪（XW-80A）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；台式高速冷冻离心机（5810R）：德国Eppendorf公司；紫外-可见分光光度计（UV-3200）：上海美谱达仪器公司；程控全自动部分收集器（CBS-B）：上海沪西分析仪器厂有限公司；电子分析天平（BSA8201）：赛多利斯科学仪器有限公司；蠕动泵驱动器（BT100J-1A）：慧宇伟业流体设备有限公司；旋转蒸发器（R系列）：上海申生科技有限公司；冷冻干燥机（SCIENTZ-10N）：宁波新芝生物科技公司；傅里叶红外光谱仪（380FT-IR）：美国 Nicolet公司；核磁共振仪（Bruker-AVANCE600）：德国 Bruker公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菲律宾蛤仔GAGs的制备
称取50 g菲律宾蛤仔匀浆后，添加9 800 U/g中性蛋白酶，按料液比1∶1（g/mL）加入去离子水，50℃下酶解5 h，所得酶解液煮沸10 min灭酶。冷却至室温（24℃～26℃）后，10 000 r/min离心 10 min，收集上清液。调节上清液的pH值为7.0，加入95%乙醇（3倍体积），混匀，置于4℃下24h。后 4000r/min，离心15min，取沉淀。冷冻干燥得到菲律宾蛤仔GAGs粗品，得率为1.04%。用阿利新蓝法[22]测定糖胺聚糖含量为7.13%（以干基计）。
1.3.2 DEAE-650M离子交换色谱分离纯化菲律宾蛤仔GAGs
用去离子水清洗去除DEAE-650M中的细小颗粒，配制成凝胶，脱气，装柱，以去离子水为溶剂，以流速1 mL/min平衡24 h。
将GAGs粗品用去离子水配制浓度为90 mg/mL的溶液，过0.45 μm滤膜除杂、上柱。依次用去离子水和 0.25、0.50、0.75、1.00 mol/L NaCl溶液进行洗脱，以1 mL/min的流速收集，每管收集5 mL，用阿利新蓝比色法[22]检测各管GAGs含量，每一浓度梯度洗脱至无洗脱峰出现。合并相同组分的洗脱峰、透析、浓缩、真空冷冻干燥得GAGs纯化品。
1.3.3 紫外光谱分析
将所得的GAGs纯化品用蒸馏水配制成1 mg/mL溶液，在波长190 nm～600 nm进行紫外光谱扫描，以蒸馏水作空白对照。
1.3.4 傅里叶红外光谱分析
称取GAGs纯化品2 mg，加入干燥的KBr晶体200 mg，于玛瑙研钵中研磨均匀，取适量压片成透明状，在4 000 cm-1～400 cm-1进行傅里叶红外光谱仪扫描分析。
1.3.5 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析
称取100 mg的菲律宾蛤仔GAGs纯化品，溶解于600 μL的重水（D2O），在试验温度为 25℃条件下，应用Bruker-AVANCE 600核磁共振仪进行13C-NMR和1H-NMR图谱分析。
2 结果与分析
2.1 菲律宾蛤仔GAGs的分离纯化结果
菲律宾蛤仔GAGs粗品洗脱曲线见图1。
图1 菲律宾蛤仔GAGs粗品洗脱曲线
Fig.1 The elution curve of crude GAGs from Ruditapes philippinarum
如图1所示，菲律宾蛤仔GAGs粗品经DEAE-650M离子交换柱层析分离得到2个峰，GAG-1和GAG-2，分别为 0.50、0.75 mol/L NaCl溶液洗脱部分。经检测，GAG-1的糖胺聚糖含量较高，为89.56%，是粗品的1.82倍，而GAG-2含量很低。收集峰GAG-1，经透析、冻干后得浅黄色的菲律宾蛤仔GAGs纯化品，颜色较粗品的浅褐色淡，说明DEAE-650M离子交换柱层析可以起到脱除色素的作用。
2.2 菲律宾蛤仔GAGs紫外光谱分析
利用紫外光谱对菲律宾蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2分别进行全波长扫描，结果如图2所示。
图2 菲律宾蛤仔GAGs粗品、纯化品紫外光谱分析
Fig.2 The UV spectrum of crude GAGs，GAG-1 and GAG-2 from Ruditapes philippinarum
由图2可知，菲律宾蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2 3个样品的紫外光谱曲线基本重叠，在200 nm左右波长处有强吸收峰出现，说明其含有羧基；在250 nm～280 nm波长处有小吸收峰，说明可能含有少量的核酸或蛋白质杂质[23]。而GAG-1和GAG-2在260 nm和280 nm处的吸收与GAGs粗品相比有所降低，说明经过DEAE-650M柱层析后除去了少量的杂质，起到了纯化的效果。
2.3 菲律宾蛤仔GAG-1红外光谱分析
红外光谱图上的每个特征吸收峰，都是由相对应的分子或原子或官能团振动引起的。对菲律宾蛤仔GAG-1在4 000 cm-1～400 cm-1进行红外光谱扫描，其结构分析结果如图3所示。
图3 GAG-1的红外光谱图
Fig.3 The infrared spectrum of GAG-1
由图3可知，GAG-1在3426.62cm-1和1071.27cm-1处有强吸收，是因为糖分子内或分子间氢键的O-H伸缩振动和O-H变角振动（一级），说明有糖环醇羟基的存在[23]；在波数2 922.15 cm-1附近的吸收，说明是糖类的特征峰，存在糖环上亚甲基C-H伸缩振动[23]；在波数1 645.99 cm-1附近有C=O键伸缩振动的特征吸收峰，说明结构中存在乙酰氨基[24]；而在波数1 549.49、1 383.17、1 233.75 cm-1处均为羧基的吸收峰，分别是由C=O非对称伸缩振动、C=O对称伸缩振动以及OH变角振动引起；在波数927.03 cm-1处有吡喃环吸收峰，说明存在非对称环伸缩振动；在波数848.32 cm-1附近的吸收峰，说明结构中存在硫酸基[25]。以上现象均说明GAG-1具备糖胺聚糖的基本特征[26]。由图3分析可知，菲律宾蛤仔GAG-1含有羧基、乙酰氨基、硫酸基等。
2.4 菲律宾蛤仔GAG-1核磁共振分析
一维核磁共振氢谱（1H-NMR）一般可用于分析糖苷键构型，大多数质子共振峰集中在化学位移δ 3.0～4.5，图谱峰重叠较严重[27]。一维核磁共振碳谱（13C-NMR）可用于测定糖残基数目、异头碳构型、糖链的连接位置等，但因其测定的化学位移值范围较大，致使其具有信号重叠少、分辨率高等特点，广泛应用于多糖结构的测定[28]。对菲律宾蛤仔GAG-1分别进行1H-NMR和13C-NMR图谱扫描检测，结果如图4和图5所示。
图4 菲律宾蛤仔GAG-1的1H-NMR图谱
Fig.4 The1H-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum
图5 菲律宾蛤仔GAG-1的13C-NMR图谱
Fig.5 The13C-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum
在1H-NMR谱（图4）中，化学位移1.99处的峰为GlcNAc的甲基信号[15]。化学位移3.5～4.5之间是糖环上各氢信号；化学位移3.93和3.73处分别为GlcNAc和Gal的H2吸收峰；化学位移4.27和4.14处分别为Gal的H3和GlcNAc的H4吸收峰；化学位移4.50处为Gal H1吸收峰。由于化学位移4.95是α吡喃糖H1质子和β构型吡喃糖H1质子化学位移的分界点[29]，图4中没有大于4.95的峰，说明菲律宾蛤仔GAG-1的糖环构型为β-构型[30]。
在13C-NMR谱图（图5）中，化学位移22.50处为GlcNAc-C2位上的乙酰基中甲基吸收峰。化学位移61.02和68.66处分别是6-硫酸化-GlcNAc-C6和6-硫酸化-Gal-C6的吸收峰。而非端基碳（C2、C3、C4和 C5）未发生取代的信号在化学位移70.92～74.58，且共振峰重叠严重；化学位移77.34处的峰取代质子信号，表示样品为1，4-糖苷键连接；化学位移104.30、103.71和103.56这3处峰比较强，分别是异头碳的化学位移，且均大于103，表明这可能存在3个单糖[31]，且都是β构型，这与1H-NMR分析结果一致。化学位移177.37、174.99、174.05处为己糖醛酸羧基或乙酰氨基的信号[32]。
因此，综合1H-NMR和13C-NMR图谱分析结果，说明菲律宾蛤仔GAG-1是以β-D-Glc（1→4）-为主要的连接方式。但是由于GAG-1的糖胺聚糖含量只有89.56%，纯度不高，1H-NMR和13C-NMR两种图谱杂峰较多，无法精确判断糖残基的类型和相对含量。
3 讨论与结论
本文采用水酶法从菲律宾蛤仔中提取了GAGs粗品，经DEAE-650M柱层析纯化后得到GAG-1和GAG-2等2个组分，其中GAG-1的糖胺聚糖含量为89.56%，比粗品提高了82.43%，而GAG-2含量很低。通过光谱检测可以判断分离纯化后的菲律宾蛤仔GAG-1的分子结构中存在羧基、乙酰氨基、硫酸基等基团，与王瑞芳等[33]的研究结果类似，她们分离的菲律宾蛤仔糖胺聚糖F-1-1主要含有氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖等。同时，通过NMR检测分析结果显示菲律宾蛤仔GAG-1的单体为吡喃型，并以β-D-Glc（1→4）-为主要连接方式，与范秀萍等[34]等分离出的菲律宾蛤仔糖胺聚糖RG-1相吻合，RG-1主要由葡萄糖、氨基半乳糖和半乳糖通过1→6、1→4或1→4、6键连接构成主链，在主链中还含有大量半乳糖醛酸。但是，本研究对于菲律宾蛤仔GAG-1的分离纯化及结构分析还不够，紫外光谱显示还存在着微量的核酸或蛋白质杂质，有待于今后结合凝胶色谱等其他手段进一步纯化，再采用二维核磁共振、高碘酸氧化、质谱、Smith降解等方法对其结构进行表征，以便为糖胺聚糖构效关系的研究提供参考依据。
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