目前，真空冷冻干燥技术广泛应用于食品、药品及生物制品的保存。食品包括肉类、鱼类及果蔬等，相比于传统干燥技术，通过真空冷冻干燥技术冻干后的果蔬在外观、颜色、抗氧化活性、植物化学成分及风味等方面都有明显的优势[1-4]。肉类和鱼类方面的应用[5-6]优势在其货架寿命和食用价值[7]。在药品方面的应用优势主要是针对一些热敏性以及一些难溶或不溶于水的药物，使其能够更好地保留原有的微观结构，提高药物稳定性，延长保存时间等[8]。但该技术面临诸多的技术难题，如能耗大、效率低和样品损伤等问题。
在真空冷冻干燥过程中，塌陷温度Tc 与玻璃化转变温度Tg′有着密切的关系，Tg′是冻干过程中最大的冻结浓缩液温度。对于一些高要求的药品，以Tg′作为冻干过程升华的临界温度时可防止冻结浓缩液塌陷破坏原有结构。研究表明不同样品测定的Tc 与Tg′存在一定的差值。温度高于Tg′时冻结基质黏度降低，而塌陷温度Tc 通常比Tg′高出1 ℃～3 ℃[9]，因固体刚性不足以支撑多孔海绵干燥层质量而发生结构塌陷[10]。干燥升华过程中Tg′是重要的参考依据，温度高于浓缩液的Tg′时黏度降低，当黏度低于10 Pa·s 时，材料出现实质性变化[11-12]，由于表面张力的存在使升华通道进行合并，干燥层机械强度降低，出现塌陷现象[13-14]，且不同浓度的蔗糖作为保护蛋白质的制剂冻干后会发生不同程度的塌陷[15]。左建国等[16]在对叔丁醇/蔗糖水三元溶液的研究中发现，Tc 比对应溶液的Tg′高出1.5 ℃。杨智等[17]研究果糖、蔗糖、海藻糖和氯化钠水的二元溶液发现，Tc 比对应溶液的Tg′高5 ℃左右。
Tg′在生物低温保存领域日益被重视[18]，真空冷冻干燥技术通过采用高的降温速率和添加保护剂使溶液降温至Tg′以下，细胞达到休眠状态，为细胞营造了玻璃态环境，减少了晶体的生成，避免晶体对细胞造成机械损伤，提升了细胞存活率，延长了物品保存时间[19-20]。样品种类的不同或同一样品的不同降温、升温速率均会对Tg′产生一定的影响，其中降温速率对Tg′的影响较小[21]。Yazdi 等[22]测定发现升温速率对Tg′能够产生一定的影响，由于热阻存在，升温速率越大热滞后越大，Tg′随之上升。Knopp 等[23]研究蔗糖溶液的热分析和冻干显微图中低温转变和高温转变的关系，通过与塌陷温度作对比，确定低温转变为玻璃化转变温度Tg′，高温转变为延迟溶解温度。
国内对于保护剂特性和冻干过程影响因素的研究较少，多数是通过Tg′来粗略地判定塌陷温度Tc。由于对玻璃化转变的研究不够深入，常会混淆溶液的延迟溶解和玻璃化转变过程。本文以冻干保护剂乳糖为研究对象，分析不同降温速率下Tg′与Tc 的相关性，为了解冻干保护剂特性和升华临界温度提供参考。
1 材料与仪器
1.1 试剂与材料
乳糖：国药集团化学试剂有限公司；液氮（纯度＞99.99%）、氮气（纯度＞99.9%）：天津市永熙气体有限公司；定性滤纸（孔径15 μm～20 μm）：郑州中天实验仪器有限公司。试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
差示扫描量热仪（DSC Q-1000）、坩埚压片机（TP-1）：美国TA 公司；电子天平（FA2204C）：上海越平科学仪器制造有限公司；冷干台（Linkam FDSC196）：英国林克曼科学仪器公司；光学显微镜（OLYMPUS BX-43）：日本奥林巴斯公司；真空泵（PFEIFFER D-35614）：德国普发技术有限公司；单道可调移液器（TopPeTTer）：北京大龙兴创实验仪器有限公司；磁力搅拌器（LCDMS-ProN1）：上海科兴仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 溶液制备
试验所用溶液均按照质量浓度配制，以10%乳糖/水二元溶液为例。称取乳糖10.000 0 g，加入超纯水定容至100 mL。
1.3.2 试验步骤
玻璃化转化温度测定：取12 μL 样品溶液注入标准液体坩埚中，利用压片机对坩埚密封处理。采用TA Universal Analysis 软件分析热流-温度曲线中的过冷点、冰点、潜热、玻璃化转变温度Tg′和冰的延迟溶解区间。
冻干过程观察：在银台上涂一层导热硅油，增强导热效果。取2 μL 样品溶液注射到载玻片上，用镊子将载玻片放置在银台对应位置，然后封闭其腔体。将样品从室温（23 ℃～28 ℃）以特定速率降温至Tg′以下，保持5 min，然后将冷热台腔体抽真空至设定压力（在升温中保持），将冻结的样品以一定的升温速率升温至20 ℃后，进入脱水干燥阶段。整个过程采用录屏软件和电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相机拍摄相结合，确定图片对应的温度变化，记录样品从冻结到干燥的整个过程。使用自带的软件对图片进行处理。
2 结果与分析
2.1 降温速率对乳糖/水溶液冻结特性的影响
降温速率对冰晶的形态、数量均有一定的影响。对于同一个样品，当降温速率增大时，晶体的成核率随之增大[21]，但冰晶生长速率下降。
本研究以10%乳糖水二元溶液作为研究对象，冷冻过程的降温速率分别设置为5、10、20、30、40 ℃/min将样本从40 ℃降温至-60 ℃，维持5 min 保证样品充分冻结，然后以1 ℃/min 的升温速率升至20 ℃，得到样品的差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）曲线。通过放大升温过程中的热流-温度曲线，分析转变过程，并找到玻璃化转变阶段，确定玻璃化转变温度。
10%乳糖溶液在不同降温速率下的热流-温度曲线如图1 所示。通过放大和分析热流曲线可得到表1。
图1 10%乳糖溶液不同降温速率下的热流-温度曲线
Fig.1 Heat flow-temperature curves at different cooling rates of 10% lactose solution
表1 降温速率对过冷度的影响
Table 1 The effect of cooling rate on the degree of subcooling
降温速率/（℃/min） 过冷温度/℃ 冻结温度/℃ 过冷度/℃5-16.89 -11.60 5.29 10 -16.77 -12.48 4.29 20 -18.79 -15.09 3.70 30 -18.20 -15.22 2.98 40 -18.92 -15.52 3.40
由表1 可以看出，降温速率在30 ℃/min 时过冷度最低。当降温速率小于30 ℃/min 时，过冷度随着降温速率的增大而减小，则表明晶核的成核率降低。降温速率大于30 ℃/min 时，过冷度随着降温速率的增大而增大，晶核成核率增大但是晶体小而密集。
在冻结样品升温过程中分析得到低温和高温转变的温度区间，低温转变温度区间为-55 ℃～-38 ℃、高温转变温度区间为-35 ℃～-20 ℃，低温转变温度区间为玻璃化转变过程。
图2 为10%乳糖溶液在不同冻结速率情况下的DSC 汇总曲线。
图2 10%乳糖溶液不同冻结速率的DSC 汇总曲线
Fig.2 DSC summary curve of different freezing rates of 10% lactose solution
由图2 可知，5 ℃/min～40 ℃/min 冻结时的热流曲线变化趋势相同，两转变区间基本保持不变，表明降温速率对玻璃化转变和冻结物的延迟溶解过程影响较小，间接证明了玻璃态的形成主要受到样品本身的特性影响[21]；由于未发现明显的反玻璃化现象，表明降温速率对反玻璃化影响较小。图3 为冻结速率对10%乳糖溶液转变的影响。
图3 冻结速率对10%乳糖溶液转变的影响
Fig.3 The effect of freezing rates on the transformation of 10% lactose solution
TL0 为玻璃化转变开始温度；Tg′为玻璃化转变温度；TLe 为玻璃化转变结束温度；TH0 为高温转变开始温度；THg 为高温转变温度；THe 为高温转变结束温度。
由图3 可知，30 ℃/min 和40 ℃/min 的降温曲线中，发现低温转变后热流出现微弱反玻璃化趋势，可能是由于降温速率过高导致结晶不充分，从而升温过程出现重结晶。
由图3 可知，10%乳糖溶液在5 ℃/min～20 ℃/min 冻结速率条件下，玻璃化转变温度Tg′波动较小，10 ℃/min时最低，不同降温速率时，玻璃化转变温度Tg′基本保持不变，与文献[24]中的蔗糖溶液测试过程得到的结果相吻合。高于20 ℃/min 时，低温转变温度呈下降趋势，且降温速率每高出10 ℃/min 时，Tg′降低1 ℃左右。5 ℃/min～30 ℃/min 速率降温时，10 ℃/min 时Tg′最低，结合表1 过冷度表述，降温速率小于30 ℃/min 时过冷度随着降温速率的增大而减小，且晶核的成核率降低，表明10 ℃/min 降温时未冻水含量较大，玻璃化转变程度较大，根据增塑作用，得出Tg′最低。
2.2 降温速率对乳糖/水溶液冻干过程的影响
将10%乳糖溶液样品从室温（23 ℃～28 ℃）分别以5、10、20、30、40 ℃/min 降温至-50 ℃，维持5 min 保证充分冻结，将冷热台腔体压力调至10 Pa，然后以1 ℃/min 升温干燥时，样品塌陷状况如图4 所示。
图4 10%乳糖溶液的不同降温速率的冻干显微图
Fig.4 Freeze-drying micrograph of a 10% lactose solution at different cooling rates
由图4 可知，对比冻结过程的图片无明显变化。且40 ℃/min 降温时的Tg′低于10 ℃/min 降温时的Tg′，结合表1 数据可知降温速率由30 ℃/min 增大至40 ℃/min时，过冷度变大，故成核率增大，不利于晶体生长，可见40 ℃/min 时的玻璃化程度更高。
分析干燥过程发现20 ℃/min 冻结时的干燥效果相对较好，塌陷和裂化现象都比较微弱；30 ℃/min 冻结时的冻干显微图未观察到塌陷，但裂化现象比20 ℃/min降温时严重，更好地证明了表1 结论中30 ℃/min 时过冷度最小、成核率低、晶体形态相对较大的结果，更有利于一次干燥过程中水分的升华，避免塌陷出现。对比图4A 组和图4B 组得出，降温速率为10 ℃/min 时塌陷现象较严重，表明10 ℃/min 降温时，玻璃化转变程度更高，也表明过冷度低时成核率低，而玻璃态占比高；对比图4B 组和图4C 组，证明了表1 结论中20 ℃/min冻结时冰晶形态大于10 ℃/min 降温时的研究结果，有利于水分升华，且玻璃化转变温度Tg′大；对比图4D 组和图4E 组，发现40 ℃/min 塌陷现象更严重，证明降温速率大于30 ℃/min 时，形成的冰晶成核率较大，但是冰晶形态小，不利于水分的升华，导致较早出现塌陷现象，随着温度升高塌陷越严重。
图5 为不同降温速率条件下的玻璃化转变温度Tg′、塌陷温度Tc 和高温转变温度THg 的影响。
图5 不同降温速率对塌陷温度的影响
Fig.5 The influence of different cooling rates on collapse temperature
由图5 可知，Tc 在Tg′和THg 之间，再次确定低温转变是玻璃化转变过程。在5 ℃/min～40 ℃/min 降温过程中，30 ℃/min 降温时Tc 与Tg′温差最大，40 ℃/min 降温时差值最小，表明在乳糖30 ℃/min 冻结时更有利于水分升华，在40 ℃/min 时玻璃化转变程度最高，在升温过程中会较早出现黏性流动产生的塌陷。
3 结论
本文通过差示扫描量热法研究了不同降温速率下乳糖/水二元溶液的坍塌现象和热历史的性质，研究发现：10%乳糖溶液在5 ℃/min～40 ℃/min 降温速率下对Tg′波动影响较小，过冷度随着降温速率呈V 型趋势，且在30 ℃/min 降温时过冷度最低，样品的结晶成核率最低，Tg′在5 ℃/min～20 ℃/min 降温时呈V 型趋势，10 ℃/min 最低，高于20 ℃/min 时Tg′呈下降趋势，且每高出10 ℃/min 时Tg′约降低1 ℃，降温速率对玻璃态的形成影响较小。乳糖/水二元溶液在冻干过程中，通过研究可知在20 ℃/min 和30 ℃/min 降温过程中干燥效果最好，仅出现裂化现象，其他降温速率条件下均有塌陷出现，表明在降温过程中溶液的成核率降低，但冰晶生成形态相对较大，可以有效促进水分升华。
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