桑葚，又名桑果、桑葚子等。桑葚营养丰富，富含黄酮类、萜类物质、维生素、有机酸和微量元素等，为我国规定的药食同源水果之一[1-2]，具有极高的保健价值和药用价值，用于保护肝脏、肾脏，预防高血压、糖尿病等，而且桑葚含有的糖类物质可以作为免疫调节剂[3-5]。
桑葚季节性强，不易于保存，容易造成桑葚资源的大量浪费。随着食品科研的进步和食品产业的发展，为了提高桑葚资源的利用率，减少资源浪费，桑葚深加工产品也越来越多。目前，孙方丹[6]进行了桑葚果醋的发酵工艺条件及生理活性研究，研制出具有独特香气的桑葚果醋；吴均等[7]进行了响应面试验优化桑葚果酒发酵工艺及其品质分析，酿造出了酒香馥郁的桑葚果酒；刘於[8]进行了桑葚成分分析及低糖果酱的工艺参数优化，研制出营养丰富的低糖果酱。这些桑葚深加工食品得到了广大群众的喜爱和认可[9]。
桑葚果酒作为桑葚主要深加工产品之一，具有独特的风味，营养价值高，为果酒中的佳品[10]。Tao等[11]研究了不同酿酒酵母菌株发酵桑葚酒的化学成分和感官特征；胡永正[12]进行了桑葚酒发酵工艺动力学研究。关于桑葚果酒的研究多集中在桑葚果酒的发酵工艺优化、风味物质分析、混合发酵应用等，对于桑葚白兰地的研究鲜有报道。为了提高桑葚的利用率，本试验采用干桑葚作为发酵原材料进行果酒发酵，优化其发酵工艺，以期酿造出优质的桑葚白兰地原料酒，提升与拓展桑葚食品产业的市场发展空间和潜力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干桑葚：采于四川阆中桑蚕基地；果酒专用酵母RW：安琪酵母有限公司；白砂糖（食品级）：滇鹏糖业有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸（食品级）：河南万邦实业有限公司；焦亚硫酸钾（食品级）：烟台帝伯仕酵母有限公司；对二氨基苯甲醛（分析纯）：上海易恩化学技术有限公司；盐酸间苯二胺（分析纯）：上海阿拉丁生化股份有限公司；甲醇、异戊醇、异丁醇（色谱纯）：上海安普实验科技股份有限公司。
1.2 主要仪器设备
BJ-800A粉碎机：德清拜杰电器有限公司；DZKW-4水浴锅：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；OHAUS-ST2C pH计：奥豪斯仪器有限公司；ZWYRD2403恒温培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；T6分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LB50T ATC糖度折光仪：广州市铭睿电子科技有限公司；三支组酒精计（0%vol～100%vol）：四川省申联生物科技有限责任公司。
1.3 试验及检测方法
1.3.1 桑葚白兰地原料酒工艺流程
干桑葚筛选→破碎→复水→灭菌→酶解→调节初始糖度→酵母活化接菌→控温发酵→过滤→桑葚白兰地原料酒。
工艺要点如下。
筛选、破碎：选取优质的干桑葚，通过粉碎机破碎成粉粒状。
复水：称取80 g干桑葚果粉粒加入发酵瓶，按料水比1∶4（g/mL）加水，制备成干桑葚果浆。
酸度调节：使用柠檬酸调节干桑葚果浆的pH值为3.5。
酶解：加入0.1%的果胶酶，并在50℃条件下酶解2h。
糖度调节：将干桑葚果浆使用白砂糖调节为不同的初始糖度（16、20、24、28、32、36 °Bé）。
灭菌：向干桑葚果浆中加入0.1%焦亚硫酸钾，灭菌2 h～8 h。
酵母菌活化：将酵母菌加入糖度为2°Bé的无菌水中，于35℃下活化15 min～30 min。
发酵：向干桑葚果浆中添加适量的活化酵母菌进行恒温发酵。
1.3.2 单因素试验
发酵温度：固定酵母添加量为0.1%、初始糖度为28 °Bé、发酵时间为 15 d，测定不同发酵温度（18、21、24、27、30、33℃）对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响。
初始糖度：固定酵母添加量为0.1%、发酵温度为21℃、发酵时间为 15 d，测定不同初始糖度（16、20、24、28、32、36°Bé）对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响。
酵母接种量：固定初始糖度为28°Bé、发酵温度为21℃、发酵时间为15 d，测定不同酵母接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响。
1.3.3 响应面优化试验
基于单因素试验结果，以发酵温度（A）、初始糖度（B）、酵母接种量（C）为考察因素，利用 Design-Expert8.06软件以酒精度、甲醇含量为响应值，进行Box-Behnken响应面试验设计，对试验所得的结果进行分析，获得最优预测发酵条件参数，并进行验证试验。响应面试验因素水平见表1。
表1 Box-Behnken设计试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test
水平 因素A发酵温度/℃ B初始糖度/°Bé C酵母接种量/%-1 18 24 0.1 0 21 28 0.2 1 24 32 0.3
1.3.4 测定方法
总酸含量、总酯含量、总糖含量、酒精度均采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的检测方法进行测定[13]；pH值测定采用酸度计法；糖度测定采用折光计检测法；甲醇含量测定采用品红亚硫酸比色法[14]。甲醇标准曲线回归方程：y=0.735x-0.015 7，R2=0.997 9；高级醇含量测定采用对二甲氨基苯甲醛比色法[14]，高级醇标准曲线回归方程：y=174.65x+0.084 2，R2=0.998 9。
挥发性风味物质采用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 相结合的方法进行检测[12]。
样品萃取：取5 mL样品加入15 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl，40℃条件平衡30 min，将以活化好的萃取针插入顶空瓶，在距离液面1 cm处吸附30 min，取出萃取针迅速插入GC-MS进样口，解吸附5 min。
色谱条件：高纯氦气（载气），6 mL/min（吹扫流速），升温条件：42℃（初始柱温、恒温8 min），升温至130℃（速度5℃/min），再升至 220℃（速度10℃/min，恒温10 min），最后升至230℃（速度10℃/min，恒温 5 min）。
质谱条件：电子离子源；电子能量：70 eV；采集模式：全扫描，质量扫描范围20 amu～550 amu，溶剂延迟2.5 min；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃，接口温度：230℃。
2 结果与分析
2.1 桑葚白兰地原料酒发酵工艺单因素试验结果
2.1.1 发酵温度对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响
发酵温度对桑葚白兰地原料酒总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质的含量及酒精度的影响见表2。
表2 发酵温度对总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质的含量及酒精度的影响
Table 2 Effects of fermentation temperature on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
发酵温度/℃指标总酸含量/（g/L）总酯含量/（g/L）总糖含量/（g/L）酒精度/%vol甲醇含量/（mg/L）高级醇含量/（mg/L）挥发性风味物质含量/（g/L）18 1.98±0.14a 3.33±0.13c 5.33±0.13e 12.9±0.3b 126.9±2.1c 176.1±6.5e 0.94±0.06b 21 2.06±0.09a 3.22±0.04c 4.23±0.24f 13.8±0.4a 120.5±3.5d 205.6±4.8d 1.44±0.04a 24 1.52±0.06b 3.32±0.12c 6.12±0.17d 12.5±0.3bc 125.9±1.8cd 220.7±5.5c 0.90±0.05b 27 1.60±0.12b 3.51±0.06b 7.65±0.15c 12.3±0.2c 133.6±2.5b 248.7±6.0b 0.84±0.06b 30 1.68±0.10b 3.42±0.09b 11.25±0.35b 12.9±0.3b 137.3±3.5b 255.3±5.2b 0.46±0.06c 33 1.98±0.13a 4.27±0.12a 28.76±0.25a 11.4±0.3d 146.8±3.0a 279.7±4.6a 0.22±0.04d
由表2可知，随着发酵温度升高，总酸含量整体呈先升高后下降再升高趋势；总酯含量整体呈波动升高趋势；总糖含量整体呈先下降后升高趋势，当发酵温度为21℃时，其总糖含量达到最低，为（4.23±0.24）g/L，原因是温度升高会抑制酵母菌的生长，导致糖代谢减少，从而影响酒体品质[15]；酒精度整体呈先升高后下降趋势，21℃时，酒精度达到最大值，为（13.8±0.4）%vol；甲醇含量整体呈先下降后升高趋势，在21℃时达到最小值，为（120.5±3.5）mg/L；高级醇含量随温度升高呈上升趋势，温度升高使酵母菌由生长对数期过早进入稳定期，从而发酵速度变快，发酵结束的时间早，导致酒精浓度下降，高级醇含量反而增加；挥发性风味物质含量呈先升高后下降趋势，21℃时达到最大值，为（1.44±0.04）g/L，低温发酵有利于形成更好的果酒品质，这与Tian等[16]研究的结果相一致。综上，选取18、21、24℃的发酵温度作为响应面优化试验的3个水平。
2.1.2 初始糖度对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响
初始糖度对桑葚白兰地原料酒总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质的含量及酒精度的影响见表3。
表3 初始糖度对总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质的含量及酒精度的影响
Table 3 Effects of initial sugar content on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol content，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
初始糖度/°Bé指标总酸含量/（g/L）总酯含量/（g/L）总糖含量/（g/L）酒精度/%vol甲醇含量/（mg/L）高级醇含量/（mg/L）挥发性风味物质含量/（g/L）16 2.43±0.15a 3.23±0.26c 3.54±0.15e 6.3±0.3d 200.3±4.6a 390.9±5.5a 0.28±0.01e 20 2.40±0.22a 3.23±0.26c 3.84±0.13d 8.3±0.5c 169.9±4.5b 271.9±3.6d 0.52±0.03d 24 2.34±0.12a 3.04±0.30c 4.12±0.15cd 12.3±0.4ab 130.9±5.5c 244.8±7.2e 1.00±0.04b 28 2.10±0.25a 3.33±0.15c 4.47±0.26c 13.6±0.6a 121.4±6.1c 216.9±6.0f 1.44±0.03a 32 2.02±0.15a 4.35±0.16b 30.03±0.24b 12.9±0.3a 130.0±5.8c 350.6±5.8b 0.60±0.02c 36 2.06±0.15a 5.08±0.10a 56.19±0.33a 11.2±0.5b 126.3±4.7c 299.3±4.4c 0.68±0.04c
由表3可知，随着初始糖度的升高，总酸含量整体呈下降趋势；总酯含量呈先下降后升高趋势；总糖含量呈升高趋势，当初始糖度为36°Bé时，其总糖含量达到最高，为（56.19±0.33）g/L，由于初始糖度的升高，导致发酵液的渗透压升高，抑制酵母菌代谢生长，使糖分利用不充分，导致总糖含量升高[17]；酒精度呈先升高后下降趋势，当初始糖度为28°Bé时，其酒精度达到最高，为（13.6±0.6）%vol；甲醇含量呈先下降后升高再下降趋势，当初始糖度为28°Bé时，其甲醇含量达到最低，为（121.4±6.1）mg/L，当发酵初始糖度低于 28 °Bé时，由于糖分含量不足，酵母菌代谢途径为糖类物质代谢和其他物质代谢，其他类物质代谢产生甲醇，从而导致甲醇含量相对较高[18]；高级醇含量呈先下降后升高再下降趋势；挥发性风味物质含量整体呈先升高后下降趋势，当初始糖度为28°Bé时，挥发性风味物质含量达到最高，为（1.44±0.03）g/L，由于低初始糖度的糖含量不足与高初始糖度的糖含量过高对酵母菌代谢生长产生的抑制作用，从而导致挥发性风味物质在低初始糖度与高初始糖度时的含量减少。综上，选取24、28、32°Bé的初始糖度作为响应面优化试验的3个水平。
2.1.3 酵母接种量对桑葚白兰地原料酒发酵工艺的影响
酵母接种量对桑葚白兰地原料酒总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质含量及酒精度的影响见表4。
表4 酵母接种量对总酸、总酯、总糖、甲醇、高级醇、挥发性风味物质含量及酒精度的影响
Table 4 Effects of yeast inoculation amount on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
酵母接种量/%指标总酸含量/（g/L）总酯含量/（g/L）总糖含量/（g/L）酒精度/%vol甲醇含量/（mg/L）高级醇含量/（mg/L）挥发性风味物质含量/（g/L）0.1 1.87±0.12d 3.33±0.17a 4.53±0.21a 13.7±0.3c 122.6±4.5b 220.7±4.6c 1.36±0.04b 0.2 1.96±0.15cd 3.36±0.08a 3.44±0.18b 14.6±0.2a 104.5±5.9c 193.5±3.6d 1.64±0.05a 0.3 2.06±0.16bcd 3.33±0.15a 3.32±0.22bc 14.3±0.3ab 125.4±3.5ab 211.3±7.2cd 1.58±0.05ab 0.4 2.16±0.15abc 3.36±0.12a 3.23±0.15bc 14.2±0.2abc 127.7±2.8bc 270.4±6.0b 1.47±0.03b 0.5 2.25±0.11ab 3.33±0.15a 3.16±0.20bc 14.4±0.2a 132.5±4.0ab 333.5±5.4a 1.41±0.05b 0.6 2.34±0.09a 3.29±0.11a 3.08±0.13c 14.0±0.1b 136.3±3.5c 325.9±6.0a 1.38±0.04b
由表4可知，随着酵母接种量的增加，总酸含量呈上升趋势；总酯含量变化不显著（P＞0.05）；总糖含量呈下降趋势，由于酵母接种量增加，糖分消耗也随之增加，导致总糖含量下降；酵母接种量由0.1%增加至0.2%时，酒精度升高，当酵母接种量为0.2%～0.5%时，酒精度变化不显著（P＞0.05），当酵母接种量过高，酵母菌利用糖类物质和其它养分，主要产生呼吸作用，产酒底物减少，导致产酒量少[19-20]；甲醇含量呈先下降后升高趋势，当酵母接种量为0.2%时，其甲醇含量达到最低，为（104.5±5.9）mg/L；高级醇含量整体呈先下降后升高趋势，当酵母接种量为0.2%时，其高级醇含量达到最低，为（193.5±3.6）mg/L；挥发性风味物质含量呈先升高后下降趋势，当酵母接种量为0.2%时，其挥发性风味物质含量达到最高，为（1.64±0.05）g/L；酵母接种量过少易使发酵不充分，酵母接种量过多易使发酵过快，从而导致酒精度、挥发性风味物质含量下降，甲醇、高级醇含量升高，直接影响果酒品质的好坏[21-22]，综上，选取0.1%、0.2%、0.3%的酵母接种量作为响应面优化试验的3个水平。
2.2 桑葚白兰地原料酒发酵工艺响应面试验结果
2.2.1 Box-Behnken响应面试验结果
利用Box-Behnken中心组合设计原理，通过单因素试验结果结合响应面试验，建立17组桑葚白兰地原料酒发酵工艺试验，试验结果见表5。
表5 Box-Behnken试验设计方案及结果
Table 5 Design scheme and results of Box-Behnken test
试验号 A发酵温度/℃ 接种量/%酒精度/%vol甲醇含量/（mg/L）1 18 24 0.2 10.7 134.66 2 24 24 0.2 10.4 134.35 3 18 32 0.2 10.2 138.18 4 24 32 0.2 13.5 125.01 5 18 28 0.1 12.9 127.65 6 24 28 0.1 13.1 125.94 7 18 28 0.3 11.6 131.38 8 24 28 0.3 13.8 123.75 9 21 24 0.1 10.2 136.84 10 21 32 0.1 11.6 130.92 11 21 24 0.3 10.2 141.30 12 21 32 0.3 13.1 126.95 13 21 28 0.2 14.0 116.23 14 21 28 0.2 14.5 113.59 15 21 28 0.2 14.6 114.14 16 21 28 0.2 14.5 115.05 17 21 28 0.2 14.2 116.68 B初始糖度/°Bé C酵母
2.2.2 以酒精度为指标的响应面试验方差分析
以酒精度为指标的响应面试验方差分析结果见表6。
表6 以酒精度为指标的响应面试验方差分析
Table 6 Variance analysis of response surface test with alcohol content as the indicator
注：** 为差异极显著 P＜0.01；* 为差异显著 P＜0.05。
参数 平方和 自由度 均方模型 45.03 9 5.00 A发酵温度 3.65 1 3.65 B初始糖度 5.95 1 5.95 C酵母接种量 0.10 1 0.10 AB 3.24 1 3.24 AC 1.00 1 1.00 BC 0.56 1 0.56 A2 2.64 1 2.64 B2 23.60 1 23.60 C2 2.17 1 2.17残差 1.21 7 0.17失拟项 0.96 3 0.32误差项 0.25 4 0.063总和 46.24 16 F值28.96 21.10 34.44 0.59 18.75 5.79 3.26 15.30 136.59 12.55 P值0.000 1 0.002 5 0.000 6 0.469 0 0.003 4 0.047 1 0.114 2 0.005 8＜0.000 1 0.009 4显著性***************5.070.075 5
二次多项回归方程：Y=14.36＋0.68×A＋0.86×B＋0.11×C＋0.9×AB＋0.5×AC＋0.38×BC－0.79×A2－2.37×B2－0.72×C2。
由表6可知，相关系数分别为R2=0.973 8、R2adj=0.940 2，且模型P值小于0.01（表明模型极显著），失拟项P值为0.075 5＞0.05（失拟项不显著），证明该回归模型方程拟合度较好，误差小。可见该模型准确，可行性高，能用于本试验的预测分析[23]。一次项A、B极显著（P＜0.01），交互项 AB 极显著（P＜0.01），AC 显著（P＜0.05），二次项 A2、B2、C2极显著（P＜0.01），C、BC 均不显著（P＞0.05），由F值可知，3个因素对酒精度影响的大小顺序为B>A>C。
A、B、C两两因素交互作用的响应面图和等高线图见图1。
图1 各因素交互作用的响应面图和等高线图（酒精度）
Fig.1 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（alcohol content）
由图1可知，发酵温度和初始糖度（AB）、发酵温度和酵母接种量（AC）的响应面图坡度趋势陡峭，AB、AC等高线趋于椭圆形，表明这两组交互作用对酒精度影响较大，AB、AC交互作用显著，与方差分析结果一致。
2.2.3 以甲醇含量为指标的响应面试验方差分析
以甲醇含量为指标的响应面试验方差分析结果见表7。
表7 以甲醇含量为指标的响应面试验方差分析
Table 7 Variance analysis of response surface test with methanol content as the indicator
注：** 为差异极显著 P＜0.01；*为差异显著 P＜0.05。
参数 平方和 自由度 均方模型 1 262.39 9 140.27 A发酵温度 65.09 1 65.09 B初始糖度 85.09 1 85.09 C酵母接种量 0.52 1 0.52 AB 41.34 1 41.34 AC 8.76 1 8.76 BC 17.77 1 17.77 A2 129.45 1 129.45 B2 644.00 1 644.00 C2 177.74 1 177.74残差 35.35 7 5.05失拟项 28.38 3 9.46误差项 6.97 4 1.74总和 1 297.74 16 F值27.77 12.89 16.85 0.10 8.19 1.73 3.52 25.63 127.52 35.20 P值0.000 1 0.008 9 0.004 5 0.758 8 0.024 3 0.229 3 0.102 8 0.001 5＜0.000 1 0.000 6显著性*************5.430.067 9
二次多项回归方程：Y=115.14－2.85×A－3.26×B+0.25×C－3.21×AB－1.48×AC－2.11×BC＋5.54×A2＋12.37×B2＋6.5×C2。
由表7可知，相关系数分别为R2=0.972 8、R2adj=0.937 7，且试验结果中P值小于0.01（模型极显著），失拟项P值为0.067 9＞0.05（失拟项不显著），证明该回归模型方程拟合度较好，误差小，该模型准确，可行性高，能用于本试验预测分析。A、B项影响极显著（P＜0.01），AB 项影响显著（P＜0.05），A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），C、AC、BC 影响均不显著（P＞0.05），由 F 值可知，3个因素对甲醇含量影响的大小顺序为B>A>C。
A、B、C两两因素交互作用的响应面图和等高线图见图2。
图2 各因素交互作用的响应面图和等高线图（甲醇含量）
Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（methanol content）
由图2可知，AB交互作用的响应面坡度趋势陡峭、等高线趋于椭圆形，表明AB交互作用对甲醇含量影响较大，AB交互作用显著，与方差分析结果一致。
2.3 桑葚白兰地原料酒发酵工艺验证试验
通过Design-Expert8.0.6软件对响应试验结果进行计算分析得到最优工艺参数：发酵温度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接种量0.2%，此时，酒精度为14.6%vol，甲醇含量为114.4 mg/L。根据最优工艺参数进行3次验证试验，实际测得酒精度为14.56%vol，甲醇含量为112.7 mg/L，与预测值接近，该参数准确可靠。
3 结论
本试验是以干桑葚为原料，在桑葚白兰地原料酒发酵单因素试验基础上，通过Box-Behnken响应面试验优化发酵工艺，得到最佳的发酵工艺参数为发酵温度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接种量0.2%，理论预测值为酒精度14.6%vol，甲醇含量114.4 mg/L。根据此发酵工艺参数进行验证试验，实际测得酒精度为14.56%vol，甲醇含量为112.7 mg/L，与预测值接近。
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