功能性胃肠疾病包括肠易激综合征、功能性消化不良、慢传输性便秘等多种消化疾病，主要体现为胃肠的运动与分泌机能失调、无组织学器质性病理改变的胃肠道功能紊乱[1-2]。目前已有众多相关研究表明，功能性胃肠疾病与肠道菌群的失调密切相关[3-4]，该类疾病的肠道菌群紊乱主要体现在瘤胃球菌属（Ruminococcus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、多尔氏菌属（Dorea）、大肠杆菌（Escherichia coli）、链球菌（Streptococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）以及乳杆菌属（Lactobacillus）等的丰度异常改变[5-6]，其中发生变化的多数菌属均属于产芽孢菌（spore-forming microbes，Sp.）。产芽孢菌作为肠道菌群的重要组成部分在近年来的研究中受到了广泛关注，出现了越来越多关于产芽孢菌的研究与应用，其中包括食物与药品领域的相关研究。在益生菌发酵豆奶酸奶的研究中发现，产芽孢菌中部分益生菌如凝结芽孢杆菌等被用于酸奶的发酵以提高酸奶品质[7-8]。而在临床药品应用上发现地衣芽孢杆菌活菌胶囊配合莫沙必利可以有效治疗功能性便秘[9]，凝结芽孢杆菌也被证实对于胃肠道疾病有治疗作用，已被制成凝结芽孢杆菌活菌片应用于临床[10]。通过前期文献调研结果推测产芽孢菌可能与功能性胃肠疾病的胃肠运动功能失调密切相关。本研究选择以伪无菌（pseudo-germfree，PGF）小鼠为研究对象，通过体外提取产芽孢菌进行小鼠体内定殖，探讨产芽孢菌能否调节小鼠胃肠动力及运动功能，并进一步研究其潜在的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康C57BL/6J雄性小鼠[（20±2）g，SPF级]：珠海百试通生物科技有限公司，动物合格证号SCXK（粤）2020-0051。实验动物饲养在广州中医药大学中药学院实验动物中心SPF级动物房，实验获得了广州中医药大学中药学院实验动物伦理审查委员会批准。动物饲养在恒温环境（23±1）℃，12 h明暗交替下，自由饮食饮水，定时更换小鼠垫料，适应性喂养1周。实验前，根据体质量和随机数字表进行完全随机化分组，分为伪无菌小鼠组（PGF组）和产芽孢菌定殖鼠组（PGF+Sp.组），每组 6只。
1.2 试剂
TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）试剂盒：TaKaRa公司；粪便基因组DNA提取试剂盒D2700：北京索莱宝科技有限公司；氨苄青霉素（98%）、硫酸新霉素（美国药典级）、甲硝唑（99%）、万古霉素（≥900μg/mg，V2002）：上海麦克林生化科技有限公司；2×TransTaqR-T PCR SuperMix（-dye）、Trans2KRDNA Marker：北京全式金生物技术有限公司；氯仿：天津市大茂化学试剂厂；苯酚红：天津市致远化学试剂有限公司；厌氧培养基（gifu anaerobic medium，GAM，HB8518）、胰酪大豆胨琼脂培养基（HB0177-1）：青岛海博生物技术有限公司。
1.3 仪器与设备
Sub-Cell GT1704484水平式核酸电泳仪：美国BIO-RAD公司；6460三重四极杆质谱仪、1260液相色谱仪：美国Agilent公司；ABI7500荧光定量PCR仪：美国Applied Biosystems公司；JXFSTPRP-CL全自动样品冷冻研磨仪：上海净信实业发展有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪：赛默飞世尔科技公司；HYQX-I厌氧培养箱：上海跃进仪器有限公司；TGL-16R冷冻高速离心机：黑马医学仪器有限公司。
1.4 方法
1.4.1 PGF小鼠模型建立及评价
1.4.1.1 混合抗生素溶液的配制
取抗生素适量，配制成含0.5 g/L万古霉素及氨苄青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑各1 g/L的混合水溶液。
1.4.1.2 PGF小鼠模型的建立
实验动物适应性饲养1周后，设定小鼠单位给药剂量为0.2 mL/10 g，每天灌胃混合抗生素溶液两次，连续给药12 d，期间将饮用水换成混合抗生素溶液，以无菌饲料饲养，自由饮食、饮水。
1.4.1.3 PGF小鼠模型评价
每日定时收集小鼠粪便，置于-80℃保存。参照文献[11-12]，选择粪便悬液涂板法和肠杆菌基因间保守重复序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）法对PGF小鼠模型进行评价。
涂板法：取0.1 g小鼠粪便于0.9 mL生理盐水中振荡混匀，用三层纱布过滤，得粪便菌悬液，稀释为10-4浓度，分别涂布于GAM固体培养基和胰酪大豆胨琼脂培养基上，前者置于厌氧培养箱，后者置于37℃培养箱，分别倒置培养2 d后，进行菌落计数。
ERIC-PCR法：取小鼠粪便，按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书，提取细菌总DNA。以Versalovic等[13]设计的 ERIC-PCR 引物（上游 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，下游 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）对粪便中的细菌进行扩增。反应体系：细菌总 DNA 2 μL（50 ng）、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 8.5 μL，总体积 25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94℃变性 1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸3 min（35个循环）；72℃终延伸10 min。取扩增产物5 μL加入1 μL上样缓冲液，经1%琼脂糖凝胶电泳（100 V、40 min；75 V、100 min）后，取胶块于凝胶成像仪进行成像分析。条带识别由天能凝胶成像系统自带软件进行处理。
1.4.2 产芽孢菌的提取、验证及定殖
参照文献[14]，本实验采用氯仿提取法提取产芽孢菌菌液。收集3名健康志愿者的新鲜粪便，志愿者3个月内未接受抗生素治疗，取样前未摄入益生元或益生素，并且无肠道疾病史，收集过程尽量保持无菌状态，样本于-80℃保存。提取前在4℃下解冻粪便样本，将不同志愿者的粪便混合均匀，称取粪便样本3 g于50 mL离心管内，在超净台中加入30 mL无菌的L-半胱氨酸盐酸盐预还原磷酸缓冲盐溶液，涡旋混合后加入3%氯仿，混合均匀，并在厌氧培养箱内37℃孵育2 h。孵育结束后，用三层纱布过滤，将滤液转移至新试管中，通入二氧化碳气体以去除氯仿，得产芽孢菌菌液。取产芽孢菌菌液和粪便菌悬液各3 mL，4 000 r/min离心10 min，保留沉淀菌体，按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书，提取细菌总DNA。
根据产芽孢菌常见菌属（Clostridium、Ruminococcus、扭链瘤胃球菌属（Ruminococcus_torques_group）、Dorea）设计引物，并选择非产芽孢菌菌属（Lactobacillus和Bacteroides）作为阴性对照，取产芽孢菌菌液及粪便菌悬液DNA进行菌属聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）验证鉴定。反应体系：菌液DNA 1 μL、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 9.5 μL，总体积25 μL。PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应程序设置：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 10 s，30个循环；72℃保持 10 min。取5 μL PCR扩增产物加入1 μL的上样缓冲液，经2%琼脂糖凝胶电泳（110 V，45 min）后，取胶块于凝胶成像仪进行成像分析。
PGF造模后的实验动物随机分为2组，伪无菌小鼠组（PGF组）和产芽孢菌定殖组（PGF+Sp.组），每组6只，PGF+Sp.组按照0.1 mL/10 g的剂量灌胃给予产芽孢菌菌液，持续给菌两周，PGF组灌胃同体积磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）。收集小鼠粪便，提取细菌总DNA，通过荧光定量核酸扩增检测方法（quantitative polymerase chain reaction detecting system，qPCR）检测产芽孢菌定殖情况。按照SYBR GreenRPro Taq HS预混型qPCR试剂盒操作说明，在7500 Real Time PCR System进行qPCR反应，并按照仪器默认程序进行熔解曲线的绘制，评价反应产物的特异性。
取测量平均扩增循环数（cycle threshold，CT）值做数据分析。常用管家基因16S rRNA用作内参基因来标定目标mRNA的相对表达。目标mRNA相对表达采用2-ΔΔCT法。测定的目标基因和内参基因的引物序列见表1。
表1 测定菌属表达所用基因引物序列
Table 1 Gene primers used to determine the expression of bacteria
目标菌属名称 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′）Clostridium[15] CGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT CGTCATCCCCACCTTCCTCC Ruminococcus[16] GGTGGCAAAGCCATTCGGT GTTACGGGACGGTCAGAG Ruminococcus_torques_group ATGGTGCGGGGGTAAAAACT CAGGTCGGCTACTGATCGTC Dorea AATTCATCTATGGTGTATTAGAGAAACCT CTTTGTATCTTGGWGAGYTYTTYTTAG Lactobacillus TGGAAGAACACCAGTGGCG TGCTGGCAACTAGTAACAAGG Bacteroides[15] GGGGTTCTGAGAGGAAG GCTACTTGGCTGGTTCAG 16S rRNA ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA
1.4.3 小肠推进率与胃残留率测定
小鼠末次给菌定殖后需禁食不禁水24 h，解剖前20 min，以0.1 mL/10 g灌胃体积给小鼠灌胃0.002 g/mL苯酚红溶液。
1.4.3.1 小肠推进率测定
沿腹部中线剪开皮肤，用棉签将腹部肠道脂肪清理干净以免影响观测，暴露胃组织后剪取胃及小肠。取幽门至回盲部的完整小肠轻轻平铺于解剖板上，测量全长。观察苯酚红推进的最终位置，测量其到幽门的距离。可借助滴加适量的0.1 mol/L NaOH溶液是否变为紫色来判断苯酚红推进位置，测量最终位置到胃幽门的长度，作为苯酚红推进的距离。小肠推进率的计算公式如下。
1.4.3.2 胃残留率测定
吸取0.75mL苯酚红溶液（0.002g/mL）加入0.1mol/L NaOH溶液定容至25 mL，上下颠倒混匀后，精密量取0.050、0.225、0.500、0.725、0.950、1.175 mL 混合溶液并分别加入纯水定容至10 mL，即得各系列梯度的标准溶液。采用紫外可见分光光度计测定标准溶液于560 nm处吸光度，并绘制标准曲线。
精密量取NaOH溶液（0.1 mol/L）10 mL置于表面皿中，将胃组织浸于NaOH溶液中并沿胃大弯剪开，将胃组织内容物充分洗涤，收集洗涤溶液并上下颠倒混匀，室温下5 000 r/min离心15 min，吸取上清液2 mL并用纯水定容至10 mL，充分混匀后，利用紫外可见分光光度计测定其吸光度（测定波长为560 nm），即为测定液OD值。胃残留率的计算公式如下。
1.4.4 液相色谱-质谱法检测结肠和血浆中五羟色胺、色氨酸（tryptophan，TRP）的含量
采用液相色谱-质谱法（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS）[17]检测 5-HT、TRP的含量。取50μL血浆加入5μL9μg/mL茶碱溶液和200μL预冷乙腈，称取约20mg结肠组织加入9倍量生理盐水匀浆，匀浆液加入5μL内标和800μL预冷乙腈。涡旋1min后，离心（4℃，14000r/min，15min），取上清液氮吹干燥，以100 μL流动相（0.1%甲酸-水）复溶。
色谱条件：Waters XSelect HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；温度 30℃；流动相 A 为 0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.2 mL/min；梯度洗脱条件如表2所示。
表2 LC-MS/MS梯度洗脱条件
Table 2 LC-MS/MS Gradient elution condition
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 95 5 0.5 95 5 5 85 15 7 50 50 10 10 90 11 10 90 12 95 5 17 95 5
质谱条件：电喷雾离子源；离子源温度300℃；锥孔气为氮气，流速为5 L/min，去溶剂气为氮气，流速为11 L/min。其中去溶剂气温度为300℃；质量扫描范围m/z 100～1 000；正离子模式下毛细管电压为3 500 V，喷嘴电压为500 V。
1.4.5 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-qPCR）测定结肠色氨酸羟化酶 1（tryptophan Hydroxylase 1，TPH1）mRNA 表达
取20 mg结肠组织提取总RNA，以磁珠研磨法在全自动匀浆机中匀浆（60 Hz，120 s），离心抽提结肠组织中总RNA，用无酶水复溶。采用Evo M-MLV反转录试剂盒进行去gDNA反应后，进行逆转录反应。逆转录成功后的cDNA置于-20℃冰箱保存待测。
RT-qPCR反应参照SYBR GreenRPro Taq HS预混型qPCR试剂盒操作说明书进行。反应结束后，进行熔解曲线的绘制，评价反应产物的特异性。目标mRNA相对表达采用2-ΔΔCT法计算，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。目的基因引物序列见表3。
表3 目的基因引物序列
Table 3 Primers of target genes
目的基因 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′）TPH1[18] GACACCTGCCACGAACTCTT TGAACCGTCTCCTCTGAAGC GAPDH GGTTGTCTCCTGCGACTTCA TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC
1.5 数据分析
运用Graphpad Prism 6.0统计软件进行数据分析，2组数据间进行单因素方差分析（独立样本t检验），检验标准为P＜0.05认为有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 PGF小鼠模型评价
2.1.1 涂板培养验证
PGF小鼠粪便悬液平板涂板见图1。
图1 PGF小鼠粪便悬液平板涂板
Fig.1 Pseudo-germfree mice’s fecal suspension coated plate
B.胰酪大豆胨琼脂培养基平板验证需氧菌
小鼠口服抗生素饮用水后，GAM培养基平板及胰酪大豆胨琼脂培养基平板上菌落数目随给药时间的延长逐渐减少，造模第11天时，基本达到无菌落状态，证明小鼠粪便中厌氧菌及需氧菌在造模后含量下降，达到伪无菌状态，造模成功。
2.1.2 ERIC-PCR验证
PGF小鼠粪便悬液肠道菌总DNA ERIC-PCR指纹图谱见图2。
图2 PGF小鼠粪便悬液肠道菌总DNA ERIC-PCR指纹图谱
Fig.2 ERIC-PCR fingerprinting of intestinal bacteria obtained from pseudo-germfree mice
A.原始ERIC-PCR指纹图谱；B.系统识别ERIC-PCR指纹图谱。M.marker；1.0 d；2.1 d ；3.3 d；4.5 d ；5.7 d；6.9 d ；7.11 d。
如图2所示，通过天能凝胶成像系统自带软件标记条带，随抗生素给药时间的延长，粪便细菌DNA的ERIC-PCR条带亮度变暗，条带数目减少，证明随造模时间变化，小鼠粪便细菌丰度及数目减少。抗生素给药第11天，ERIC-PCR条带数目减少至1条且条带亮度较暗，证明小鼠已达到伪无菌状态，造模成功。
2.2 产芽孢菌液菌属PCR验证
根据文献[14]产芽孢菌菌液16S rRNA测序结果，本实验选择其中最为常见的4个产芽孢菌菌属：Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea，对提取得到的产芽孢菌菌液DNA进行PCR鉴定，并选择肠道菌群中常见的非产芽孢菌菌属Lactobacillus和Bacteroides作为阴性对照，结果如图3所示。
图3 产芽孢菌液菌属PCR验证
Fig.3 PCR verification of spore-forming microbes
1.粪便菌悬液；2.产芽孢菌菌液；M.marker；C.Clostridium；R.Ruminococcus；Rt.Ruminococcus_torques_group；D.Dorea；L.Lactobacillus；B.Bacteroides。
由图3可知，电泳可见有不同长度的特异条带，与粪便菌悬液PCR电泳条带相比，产芽孢菌菌液仍保留有属产芽孢菌的 Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea的菌属条带，而并未扩增出非产芽孢菌Lactobacillus和Bacteroides条带。电泳结果与文献报道的16S rRNA测序结果相一致，表明此方法成功提取出了粪便菌悬液中的产芽孢菌。
2.3 qPCR验证产芽孢菌定殖情况
用 Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 和Dorea的特异性引物，以各组小鼠粪便细菌DNA为模板进行qPCR扩增有单峰的熔解曲线及特异荧光曲线生成，并给出了定量结果，见图4。
图4 qPCR验证产芽孢菌定殖情况
Fig.4 Real-time quantitative PCR analysis of colonization of spore-forming microbes
A.Ruminococcus；B.Dorea；C.Ruminococcus_torques_group；** 表示差异显著（P＜0.01），**** 表示差异极显著（P＜0.000 1）。
由图4可知，PGF+Sp.组小鼠体内属产芽孢菌的Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 及 Dorea显著富集，相对含量显著上升，证明小鼠体内产芽孢菌定殖成功。
2.4 产芽孢菌对小鼠胃肠动力的影响
2.4.1 小肠推进率测定
产芽孢菌对小鼠胃肠动力的影响见图5。
图5 小肠推进率测定
Fig.5 Determination of intestinal thrust rate
**表示差异显著（P＜0.01）。
由图5可知，将产芽孢菌定殖体内后，小鼠小肠中的苯酚红溶液推进距离更远，小肠推进率显著提高，与PGF小鼠相比差异显著（P＜0.01）。结果表明，产芽孢菌的定殖可以有效推进小肠运动，增强肠道蠕动功能。
2.4.2 胃残留率测定
小鼠胃残留率测定结果见图6。
图6 胃残留率测定
Fig.6 Determination of gastric residual rate
*表示差异有统计学意义（P＜0.05）。
由图6可知，与PGF小鼠相比，产芽孢菌定殖后小鼠胃组织中残留的苯酚红溶液较少，胃残留率下降，具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，产芽孢菌可以增强胃动力，减少胃残留率。
2.5 产芽孢菌对5-HT含量的影响
结肠及血浆中5-HT浓度及5-HT/TRP比值见图7。
图7 产芽孢菌对5-HT含量的影响
Fig.7 Effect of spore-forming microbes on 5-HT
A.结肠中5-HT含量；B.结肠中5-HT/TRP比值；C.血浆中5-HT含量；D.血浆中5-HT/TRP比值；*表示差异有统计学意义（P＜0.05），**表示差异显著（P＜0.01），***表示差异极显著（P＜0.001）。
5-HT作为一种神经递质，不仅分布于大脑中可以调节大脑皮层活动，还可以在肠道内合成以增强胃肠道蠕动功能[19]，近年来在功能性胃肠疾病中广受关注，并且有相关研究表明部分肠道微生物可以有效调节或参与到体内5-HT代谢通路[20]。如图7所示，与PGF小鼠相比，产芽孢菌的定殖可以提高结肠及血浆中5-HT含量以及5-HT/TRP比值，其中在结肠中的变化差异更为显著。结果表明产芽孢菌可以有效调节机体内结肠及血浆中5-HT的含量，这与胃肠道蠕动功能的增强有密切联系。
2.6 产芽孢菌对小鼠结肠中TPH1酶mRNA表达水平的影响
各组小鼠结肠组织中TPH1酶mRNA表达情况见图8。
图8 产芽孢菌对小鼠结肠中TPH1酶mRNA表达水平的影响
Fig.8 Effects of spore-forming microbes on TPH1 mRNA expression in colon
***表示差异极显著（P＜0.001）。
TPH1是机体外周系统合成5-HT的关键限速酶，可以介导机体内色氨酸分解成为5-羟色氨酸，进而脱羧生成5-HT，通过此途径产生的5-HT占体内总量的90%以上。因此，TPH1的表达与5-HT含量有密切联系[21]。由图8可知，通过RT-qPCR测定结肠中TPH1酶mRNA表达情况，结果表明与PGF组相比，产芽孢菌定殖导致TPH1酶mRNA表达极显著下调（P＜0.001）。这种下调可能是机体在暴露于微生物负担后对5-HT过度释放的适应性反应，从而调节肠道5-HT系统的超敏性[22]。在胃肠蠕动亢进的腹泻型肠易激综合征患者肠道中5-HT含量升高、TPH1表达下降[23]，将正常小鼠的粪便定殖至无菌小鼠体内可以有效提高肠道内5-HT含量，并降低TPH1表达[22]。同时在体外培养实验中发现有些产芽孢菌（如Bacillus cereus）可以直接代谢生成5-HT[24]。因此推测产芽孢菌可通过代谢生成5-HT，使血浆、结肠中5-HT含量上升，负反馈调节TPH1表达下调。
3 讨论与结论
本研究通过抗生素鸡尾酒法建立伪无菌小鼠模型，并采用氯仿提取法体外提取产芽孢菌菌液，通过口服灌胃的方式在伪无菌小鼠体内定殖产芽孢菌，检测小鼠的胃肠运动功能及5-HT的含量变化情况。结果表明，产芽孢菌定殖后小鼠的小肠推进率、胃残留率有明显差异，胃肠蠕动能力增强。此外，产芽孢菌还可以提高小鼠结肠及血浆中5-HT的含量，其中结肠的变化情况更为显著。结合文献调研及实验结果，得出以下结论：产芽孢菌的定殖可通过提高肠道和血浆中5-HT含量水平以促进胃肠运动。胃肠蠕动过慢会导致消化液分泌减少，出现食欲下降、腹胀、恶心、便秘等消化不良的症状，而产芽孢菌的定殖可以有效增强胃肠运动功能，这为功能性消化不良、便秘型肠易激综合征等疾病的治疗提供了一个新思路，可以通过选择性增加有益于胃肠运动的产芽孢菌以促进相关疾病的治疗。然而，为了能在肠道菌群干预措施中获得最佳效益，还需要进一步阐明产芽孢菌的定殖对机体是否会产生其他未知的影响以及产芽孢菌中具体菌种的调节作用，相关研究内容有待后期实验做进一步探讨。
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