肠道菌群与机体免疫功能和健康密切相关，其能够通过与肠黏膜紧密结合构成肠道的生物屏障，从而有效抵御病原菌、病毒等的入侵[1]。肠道菌群还具有为机体提供营养、调节代谢、调控肠道上皮发育和诱导先天性免疫等作用[2]。此外，研究发现包括消化系统、神经系统、内分泌系统及心血管系统在内的许多疾病与肠道菌群失调相关。因此，维持肠道微生态平衡对于维持机体健康具有非常重要的意义[3]。近年来，已有许多研究者在积极寻找可调节肠道菌群的“益生元”。益生元是一类在肠道中能够选择性地刺激肠道益生菌生长的活性物质，可对宿主健康产生有益的影响。目前益生元的种类很多，例如功能性低聚糖类、多糖类、多元醇及蛋白质水解物等[4]。与其他益生元物质相比，蛋白水解物除了可为肠道菌群提供氨基酸类必需营养物质，其中的多肽类活性物质还可直接作用于肠道菌群，对其生理活性产生影响[5]。有研究指出，以昆虫蛋白经水解后形成的小分子肽和氨基酸作为氮源，对于微生物而言，是极具价值的营养源[6]，尤其是对于依赖外源性氨基酸的细菌比如双歧杆菌等起着重要的生长促进作用。
竹虫（Chilo frusciden-talis Hampson）是螟蛾科（Pyralidae）禾草螟属（Chilo）的一类昆虫，主要寄生在巨竹属的竹筒内，其作为可食用昆虫在我国有着悠久的历史。竹虫是一种优质的天然蛋白质来源，经分析，竹虫的粗蛋白含量为30%～40%，氨基酸含量为29%，其含有的8种必需氨基酸，占氨基酸总量的35.4%[7]，且其必需氨基酸与非必需氨基酸的比值达到世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出的理想蛋白质的要求[8]。目前，竹虫蛋白的益生活性尚未见报道。这表明竹虫作为一种高蛋白质、高氨基酸含量的昆虫，探究其蛋白质水解物的益生活性对开发利用竹虫资源具有非常重要的意义。
研究发现，蛋白质酶解物的活性易受到酶解条件变化的影响。不同的蛋白酶具有不同的酶切位点，使酶解后得到的多肽以及氨基酸比例不同，从而导致水解产物的作用也存在差异。因此，需要考虑到竹虫蛋白的酶解条件，例如蛋白酶种类以及酶解时间等，对其益生活性的影响。因此，本研究考察了碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶3种常用的水解酶在不同酶解时间下制备的竹虫酶解液对植物乳杆菌LP45（Lactobacillus plantarum LP45，LP45）、鼠李糖乳杆菌 GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）、乳双歧杆菌 Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8，M8） 及两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidobacteria）4株肠道益生菌的促增殖作用，以期为竹虫的开发利用及潜在的益生活性研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
益生菌植物乳杆菌LP45（LP45，编号YMC1005）、乳双歧杆菌 Probio-M8（M8）、鼠李糖乳杆菌 GG（LGG）及两歧双歧杆菌：中国工业微生物菌种保藏中心；竹虫：市售；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶：沧州夏盛酶生物技术有限公司；胰蛋白酶：浙江中牧药业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
打浆机（JYL-C022E）：九阳电器有限公司；水浴恒温振荡器（THZ-82A）：常州澳华仪器有限公司；八孔消化炉（型号 HYP-308）、自动定氮仪（KND-103F）：上海纤检仪器有限公司；冷冻离心机（SCIENTZ-12N）：宁波
1.3.3 竹虫蛋白酶解液对益生菌生长增殖的影响
1.3.3.1 益生菌的培养
将益生菌LP45、M8、LGG及两歧双歧杆菌菌种冻干粉接入到无菌的乳酸细菌培养基MRS的液体培养基中，于37℃活化24 h，继代培养3代，菌种活力恢复后用于后续试验。对菌液进行梯度稀释，得到10-1～10-7稀释梯度，分别吸取 200 μL 的 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体平板中，并在37℃厌氧培养箱中培养38 h～72 h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24 h，作为种子液，用于后续试验。
1.3.3.2 竹虫蛋白酶解液促益生菌生长增殖的试验
采用凯氏定氮法测定蛋白胨中的蛋白质含量，以竹虫蛋白酶解液中蛋白质等量替换原MRS培养基中蛋白胨的蛋白质为原则，配制含竹虫蛋白酶解液的益生菌培养基。同时，设置两种对照培养基（空白对照组：无蛋白胨的MRS培养基；MRS对照组：含蛋白胨的MRS培养基），以无菌水等量代替竹虫酶解液做空白对照。培养基均经0.22 μm的水系无菌滤头过滤，置于4℃冷藏备用，试验前于37℃预热10 min。
竹虫蛋白酶解液对益生菌的增殖试验参考文新芝生物科技股份有限公司；全功能微孔板检测酶标仪（Synergy H1）：美国伯腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 竹虫蛋白酶解液的制备
新鲜的竹虫原料打浆成肉糜，在50℃烘箱中烘干。再利用蒸馏水配制0.1 g/mL的竹虫肉糜水溶液，超声预处理10 min，50℃水浴30 min。酶解条件为酶与底物质量比1∶100、pH7.0、温度55℃，分别添加碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶并分别酶解2 h和4 h。其中，各种蛋白酶预先于50℃水浴中活化5 min，添加为竹虫肉糜底物蛋白含量的1%，在酶解过程中监测pH值的变化。酶解结束后，样品在100℃下沸水浴灭酶10 min。将样品在4℃、8 000 r/min的条件下离心20 min，除去油层收集上清酶解液，获得6种不同酶解条件下的竹虫蛋白酶解液（碱性蛋白酶2-h、胰蛋白酶2-h、木瓜蛋白酶2-h、碱性蛋白酶4-h、胰蛋白酶4-h、木瓜蛋白酶4-h），于4℃冷藏备用。
1.3.2 竹虫蛋白酶解液的蛋白回收率测定
采用凯氏定氮法[9]测定竹虫在不同酶解条件下制备的酶解液中蛋白质含量。并按照以下公式计算蛋白回收率。献[10]的方法，并稍作修改。37℃过夜培养的4种益生菌种子液以1%的比例接种于上述培养基中，充分混合均匀后以150 μL/孔的量转移至无菌的96孔板中，每个样品设置4个复孔，转移完毕后加盖并用封口膜密封盖板连接处，放置于酶标仪中，在37℃、208 r/min条件下以双轨道连续振板方式，动力学监测20 h各培养基益生菌的生长情况，每15 min读数菌悬液在600 nm处的吸光度（OD600）。检测完毕后，作出益生菌在各个培养基中的生长曲线，依次选取起始时间点与终止时间点，以lnOD600与时间T拟合直线，取所拟合R2值最接近于1的时间段作为益生菌的对数期，按照公式计算代时（generation time，GT），即益生菌数量倍增所需的时间。
式中：K为lnOD600与时间T拟合直线的斜率。
1.4 数据统计与分析
每组试验独立重复3次，结果均以平均值±标准差的形式表示。采用IBM SPSS Statistics（Version 20）统计学软件进行单因素（One way-ANOVA）方差分析，并以不同字母代表数据之间有显著性差异（p＜0.05）。使用GraphPad Prism软件进行数据作图，并用Adobe Illustrator CC2019软件进行排版展示。
2 结果与讨论
2.1 不同酶解工艺对竹虫蛋白酶解液pH值的变化及蛋白回收率的影响
竹虫原料经凯氏定氮法测得其蛋白质含量为（30±1.42）%，该结果与文献[11]研究结果一致，表明其可作为食源性活性多肽的良好来源。已有研究表明pH值对蛋白酶的酶解活性影响较大[12]。因此，在本研究的酶解过程中，每隔1 h测定酶解液的pH值，其变化如图1所示。
图1 不同酶解工艺制备竹虫蛋白酶解液过程中pH值的变化
Fig.1 Changes of pH value of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson under different preparation conditions
在不同的酶解工艺条件下，随着酶解反应的有序进行，酶解液的pH值在酶解过程中随着酶解时间的增加而逐渐下降。酶解过程中pH值下降的原因之一在于：在蛋白酶的作用下，竹虫蛋白的肽键断裂，分解形成—COOH及—NH2，而—COOH在溶液中发生解离产生H+。由图1可知，酶解过程中pH值的下降幅度不大，对蛋白酶活性影响较小。因此，在酶解过程中可不调节各组酶解液的pH值。
不同工艺条件下的竹虫蛋白酶解液蛋白质回收率如图2所示。
图2 不同酶解工艺制备竹虫蛋白酶解液过程中的蛋白回收率
Fig.2 Protein recovery rates of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson under different preparation conditions
字母不同表示差异显著，p＜0.05。
由图2可知，经碱性蛋白酶酶解制备的酶解液蛋白回收率显著高于其余两种蛋白酶，而且经碱性蛋白酶酶解制备的酶解液竹虫蛋白回收率随酶解时间的延长显著增加（p＜0.05）；经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制备的酶解液蛋白回收率无显著性差异（p＞0.05），且与酶解时间无关。
2.2 竹虫蛋白酶解液对益生菌体外促增殖作用的研究
2.2.1 竹虫蛋白酶解液对LGG的促增殖作用
竹虫蛋白酶解液对LGG的促增殖作用如图3所示。
图3 竹虫蛋白酶解液对LGG的促增殖作用
Fig.3 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Lactobacillus rhamnosus
A.根据动力学检测所得LGG在不同培养条件下的生长曲线；B.LGG在不同培养条件下培养20 h后测得OD600值；C.根据LGG生长曲线对数期计算所得代时（h）；字母不同表示差异显著，p＜0.05。
由图3A、B可知，在培养过程中，MRS对照组菌悬液OD600值与空白对照组之间无显著性差异，但各试验组的OD600值显著高于MRS对照组和空白对照组，其中胰蛋白酶-2h试验组OD600值最高，表示LGG数量最多。竹虫蛋白酶解液的促LGG增殖作用，可能与竹虫中高谷氨酸含量密切相关。此外，经3种蛋白酶酶解的竹虫蛋白酶解液试验组随着酶解时间的增加其菌悬液OD600值无显著性变化。上述结果表明，竹虫蛋白酶解液促LGG增殖作用与酶种类密切相关，而酶解时间对其影响不大。由图3C可知，各试验组的竹虫蛋白酶解液可显著地缩短LGG增殖一倍所需要的时间，其中竹虫蛋白胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液效果较好。
2.2.2 竹虫蛋白酶解液对LP45的促增殖作用
竹虫蛋白酶解液对LP45的促增殖作用见图4。
图4 竹虫蛋白酶解液对LP45的促增殖作用
Fig.4 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Lactobacillus plantarum LP45
A.根据动力学检测所得LP45在不同培养条件下的生长曲线；B.LP45在不同培养条件下培养20 h后测得OD600值；C.根据LP45生长曲线对数期计算所得代时；字母不同表示差异显著，p＜0.05。
从图4A的生长曲线可看出，从培养2 h开始，各试验组菌悬液的OD600值明显高于对照组；进一步分析培养20 h后（图4B），各试验组的OD600值显著高于MRS对照组和空白对照组，其中相同酶解时间竹虫蛋白的碱性蛋白酶水解液组的OD600值最高，表示LP45的数量最多。这是由于竹虫蛋白经碱性蛋白酶酶解后，酶解液中的氮含量最高，可为LP45生长提供丰富的氮源。由图4C可知，与对照组相比，各竹虫蛋白酶解液试验组益生菌的代时显著减小。上述结果表明，与蛋白胨相比，竹虫蛋白酶解液可显著促进LP45增殖，其中竹虫蛋白碱性蛋白酶水解液效果最佳。
2.2.3 竹虫蛋白酶解液对M8的促增殖作用
竹虫蛋白酶解液对M8的促增殖作用结果如图5所示。
图5 竹虫蛋白酶解液对M8的促增殖作用
Fig.5 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Bifidobacterium lactis Probio-M8
A.根据动力学检测所得M8在不同培养条件下的生长曲线；B.M8在不同培养条件下培养20 h后测得OD600值；C.根据M8生长曲线对数期计算所得代时（h）；字母不同表示差异显著，p＜0.05。
由图5A、5B可知，与空白对照组和MRS对照组相比，各试验组无明显促进M8增殖的作用。但是，根据代时计算结果发现（图5C），各试验组可显著缩短M8复制一代所需要的时间。上述结果表明，竹虫蛋白酶解液可缩短M8的增殖时间，但未增加其数量。由图5A可看出，4 h～12 h，试验组M8数量明显高于MRS对照组，但在20 h时结果显示其数量未增加，推测是由于菌落密度较大以及培养皿环境导致后期菌落生长受限造成。代时减小促进增殖的机理可能与竹虫中含有丰富的维生素以及钾、钙、铁、锰等矿物元素相关[7]，其中锰等金属离子不仅可促进双歧杆菌细胞壁的合成，还是激活双歧杆菌糖苷酶的主要成分[13]。
2.2.4 竹虫蛋白酶解液对两歧双歧杆菌的促增殖作用
竹虫蛋白酶解液对两歧双歧杆菌的促增殖作用结果见图6。
图6 竹虫蛋白酶解液对两歧双歧杆菌的促增殖作用
Fig.6 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on the replication and proliferation of Bifidobacterium bifidum
A.根据动力学检测所得两歧双歧杆菌在不同培养条件下的生长曲线；B.两歧双歧杆菌在不同培养条件下培养20 h后测得OD600值；C.根据两歧双歧杆菌生长曲线对数期计算所得代时（h）；字母不同表示差异显著，p＜0.05。
从图6A的两歧双歧杆菌生长曲线可看出，在两歧双歧杆菌生长过程中各试验组的菌悬液OD600值明显高于MRS对照组和空白对照组，表明其可促进两歧双歧杆菌快速增殖。在替代培养20 h后，各试验组的益生菌数量（OD600值）显著高于MRS对照组和空白对照组。根据代时的结果（图5C）可发现各试验组可显著缩短两歧双歧杆菌增殖一代所需的时间，但各试验组之间无显著性差异。综上，竹虫蛋白各酶解液均可显著促进两歧双歧杆菌的增殖（包括增殖速度和数量）。双歧杆菌最适宜的氮源是蛋白质水解产物如氨基酸、多肽等，其生长还需要多种矿物元素以及维生素等促生长因子[14]，竹虫中丰富的氮源、碳源提供了大量的营养成分，同时竹虫中部分矿物元素等促生长因子，可促进双歧杆菌的新陈代谢[15]，这可能是竹虫酶解液促进两歧双歧杆菌增殖的原因之一。
2.2.5 竹虫蛋白酶解液对4种肠道菌群代时增加率的影响
代时作为菌增殖速度的一个指标，其数值越小代表增殖速度越快，而代时增加率越小表示对该菌增殖效果越明显。竹虫蛋白酶解液对肠道菌群的代时增加率是由4种试验组益生菌代时比各组对应MRS对照组所得值，结果见图7。
图7 竹虫蛋白酶解液对肠道菌群代时的影响
Fig.7 Effect of protease hydrolysates of Chilo frusciden-talis Hampson on generation time of intestinal flora
无相同字母表示差异显著，p＜0.05。
如图7所示，LP45代时增加率普遍很小，而两歧双歧杆菌相对较高，表明竹虫酶解液对LP45促增殖作用最明显，对两歧双歧杆菌的促增殖作用相对较差。由图7还可发现，酶解时间对增殖效果无影响，但酶的种类对增殖效果产生了明显的差异。竹虫的碱性蛋白酶水解液试验组益生菌代时增加率高于其胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液试验组，表明竹虫的碱性蛋白酶水解液促增殖效果相对较差，而另外两种酶相对更好。研究发现，动物蛋白经酶解后会形成一些多肽类活性物质，例如鹿茸多肽就是一类促增殖的多肽类活性物质[16]。相比于胰蛋白酶（酶解位点为Lys和Arg[17]）和木瓜蛋白酶（酶解位点为L-lys、L-Arg、Gly和L-瓜氨酸[18]），碱性蛋白酶（酶解位点为Arg、His、Lys、Ala、Phe、Leu、Val和Tyr等[19]）是一种位点特异性较弱的蛋白酶，其酶切位点较多[20]，因此在竹虫的碱性蛋白酶水解液中，部分多肽类活性物质可能被碱性蛋白酶酶解从而失去特定的生物活性，这可能是竹虫的碱性蛋白酶水解液对菌的增殖效果略弱于竹虫胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的原因之一。但这些多肽物质对益生菌的生理功能，以及益生菌的具体吸收利用机制，尚有待进一步研究。
3 结论
本研究考察了3种不同蛋白酶（碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）在一定工艺条件下制备的竹虫蛋白酶解液对 4种肠道益生菌（LGG、LP45、M8、两歧双歧杆菌）的促增殖作用。研究发现，竹虫蛋白酶解液对4种益生菌均有显著的促增殖作用，其活性与所用酶的种类密切相关，而酶解时间对其活性影响较小。竹虫蛋白酶解液增加了LGG、LP45、两歧双歧杆菌的数量、提升了其生长速度，而仅减小了M8代时，促进M8的快速复制。同时，研究还发现竹虫蛋白酶解液对LP45的促增殖效果最明显，而经碱性蛋白酶水解制备的竹虫酶解液对肠道益生菌的促增殖效果相对较差。本研究结果为竹虫的开发利用及其益生活性研究提供了一定的参考依据。
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