目前我国是世界上最大的小麦生产和消费国，根据《2014-2018年联合国粮食与农业组织报告》，我国小麦年产量稳定在1.2亿t以上。随着国民营养健康水平的提高，小麦面制品品质要求越来越高，提高面筋蛋白交联强度与面筋强度，探寻天然、安全、有效的小麦粉添加剂，成为小麦粉加工品质改良的重要方向。
天然植物酚类具有绿色、安全、抗氧化、抑菌等优良特点[1]，有些已被证实能够起到面筋蛋白交联增筋作用。例如，添加阿魏酸和咖啡酸能使面筋蛋白改性，从而增加面筋蛋白延展性[2-3]；添加0.3%单宁酸后，面筋蛋白中游离巯基含量增加，游离氨基含量下降，表明单宁酸能够将二硫键还原为游离巯基，促使其他氨基酸残基间形成新的交联[4]。此外，没食子酸、茶多酚、生育酚等也被发现能够引起蛋白之间交联作用[5-8]。
葡萄籽低聚原花青素（oligomeric procyanidins，OPC）是迄今为止发现的植物来源最高效的抗氧化剂之一，具有清除体内自由基、免疫调节、预防心脑血管疾病等重要生理功能[9-12]。因其天然、安全、生物兼容性好，已作为食品功能成分和添加剂广泛用于食品领域。OPC作为一种天然植物酚类，已有研究表明其对面筋蛋白具有交联作用[13]，但OPC调控面筋蛋白交联作用机制尚不清楚，可借鉴抗坏血酸以及其他天然植物提取物对面筋蛋白交联作用影响的相关研究。目前，普遍认为抗坏血酸是通过巯基/二硫键交换反应促进面筋网络形成[14-15]；也有研究发现氧化酚酸可通过醌羰基与蛋白游离氨基发生反应，促进蛋白质分子交联[16]；在面筋网络结构形成过程还发现存在二酪氨酸和异二酪氨酸，因而提出酪氨酸交联机制[17-18]。
综上，本研究以高筋小麦粉为研究对象，测定不同OPC添加量和不同醒发时间条件下，面筋蛋白粒径、游离巯基与二硫键含量、游离氨基含量、二级结构以及氨基酸变化，旨在从二硫键/巯基交换、游离氨基交联、酪氨酸交联等方面探索OPC对面筋蛋白交联作用的影响。研究结果可为天然植物提取物对小麦粉加工过程品质调控提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高筋小麦粉：内蒙古恒丰食品工业（集团）股份有限公司；葡萄籽低聚原花青素：西安昌岳植物化工有限公司；氯化钠、盐酸（均为分析纯）：天津市化学试剂一厂；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：赛默飞世尔科技公司；甘氨酸（分析纯）：北京鼎国昌盛生物技术有限公司；5，5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸[5，5'-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]（分析纯）：美国sigma公司；尿素、十二烷基磺酸钠、95%乙醇（均为分析纯）：天津市江天化工技术有限公司；邻苯二甲醛（化学纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（分析纯）、冰乙酸（色谱纯）：天津康科德科技有限公司；硼砂、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
面筋洗涤仪（JJJM54S）：上海嘉定粮油股份有限公司；离心机（TDZ5-WS）：长沙湘仪离心机仪器有限公司；全自动粉质分析仪（doughLAB）：澳大利亚波通公司；激光粒度分布仪（BT-9300S）：丹东市百特仪器有限公司；紫外分光光度计（UV-1800）、高效液相色谱仪（LC-20A）：日本岛津公司；傅里叶变换红外光谱仪（IS50）：美国 Nicolet公司；扫描电子显微镜（XL-3）：荷兰Philips公司。
1.3 方法
1.3.1 面粉粉质的测定
准确称取300 g高筋小麦粉，分别加入不同比例OPC（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），预混 1 min，在面团揉制过程中逐滴加入超纯水，采用全自动粉质分析仪测定不同OPC添加量下小麦粉粉质特性曲线，分析得到吸水率、形成时间、稳定时间、弱化度、带宽等粉质参数。
1.3.2 面筋蛋白样品的制备
将添加不同OPC含量的高筋小麦粉揉制成面团，控制面团醒发时间为30 min；在OPC添加量为0.3%条件下，设置不同面团醒发时间（0、10、20、30、40 min）。称取10 g不同OPC添加量和不同醒发时间处理得到的面团，置于面筋洗涤杯中，用2%氯化钠溶液进行洗涤后使用去离子水洗涤除去多余氯化钠和淀粉，面团洗涤时间8 min～10 min。将洗涤后的面筋蛋白于3 500 r/min条件下离心5 min，经冷冻干燥后磨粉过120目筛，干燥环境下储存待测[19]。
1.3.3 面筋蛋白粒径的测定
准确称取0.50 g面筋蛋白样品，与49.50 g蒸馏水充分混合成面筋蛋白悬浮液，采用激光粒度分布仪测定不同OPC添加量和不同醒发时间条件下面筋蛋白的粒径分布。
1.3.4 游离巯基和二硫键含量的测定
准确称取50 mg面筋蛋白样品，溶于5 mL三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-8mol/L尿素溶液中，搅拌过夜；然后在1 mL面筋蛋白溶液中迅速加入0.1 mL埃尔曼试剂（4 mg/mL DTNB溶液）和2 mL三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液（pH8.0），混匀后于25℃下避光恒温反应30 min。采用紫外分光光度计测定412 nm波长下样品的吸光值（A412），分析面筋蛋白样品中游离巯基和二硫键含量。三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-8 mol/L尿素溶液和埃尔曼试剂作为空白，游离巯基含量计算公式如下。
式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104为Ellman试剂摩尔消光系数；D为稀释系数，5.04；C为蛋白浓度，mg/mL。
于1 mL面筋蛋白样品溶液中加入4 mL三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-8 mol/L尿素溶液和0.05 mL β-巯基乙醇，室温下振荡4 h，加入10 mL三氯乙酸（12%）继续反应1 h，试样于2 800 r/min下离心10 min，重复两次。所得沉淀使用10 mL尿素溶液（8 mol/L）再次溶解清洗后，加入0.04 mL埃尔曼试剂，摇匀后避光静置30 min，于412 nm波长处测定其吸光值，计算得到总巯基含量和二硫键含量。
1.3.5 游离氨基含量的测定
面筋蛋白样品中游离氨基含量测定采用邻苯二甲醛（O-phthaldialdehyde，OPA）法。准确称取0.50g面筋蛋白样品，充分溶解在50 mL乙酸溶液（500 mmol/L）中，置于5℃水浴中磁力搅拌4 h后超声15 s；然后在5℃下，4 400 r/min离心5 min，上清液备用。移取0.4 mL面筋蛋白样品溶液（1 mg/mL），加入8 mL OPA溶液（含β-巯基乙醇），充分混匀后，以OPA溶液（含β-巯基乙醇）为空白，在340 nm波长下测定试样的吸光值，并根据标准曲线方程计算其游离氨基含量。标准曲线方程采用赖氨酸为标准品，得到吸光值与氨基酸浓度的关系曲线 y=0.010 7x-0.046 4（R2=0.994 7）。
1.3.6 氨基酸变化分析
1.3.6.1 面筋蛋白样品的水解
准确称取3 mg面筋蛋白样品，置于水解管中，加入12 mL盐酸（6 mol/L）后向水解管中充入氮气，维持30 s，待空气完全排出，立即拧紧管塞。试样于110℃水解22 h后，在65℃下旋蒸至原有体积1/6；加入5 mL去离子水再次旋蒸，重复3次～4次，将水解液中苯酚和盐酸完全去除，最后溶于2 mL去离子水中，得到面筋蛋白水解液。
1.3.6.2 氨基酸衍生化
首先配制衍生溶液，包括衍生剂溶液：将2，4-二硝基氟苯溶于乙腈溶液中，制得1%的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液；衍生缓冲液：称取4.2 g碳酸氢钠，用去离子水定容至1 L；定容缓冲液：称取3.4 g磷酸二氢钾，加入14.5 mL氢氧化钠溶液（0.1 mol/L），然后用去离子水定容至500 mL。然后，移取10 μL蛋白水解液，依次加入100 μL衍生缓冲液，50 μL衍生剂溶液和790 μL定容缓冲液，使用封口膜密封后，立即包裹锡箔纸，振荡均匀并于65℃下避光1 h，过0.2 μm滤膜，得到衍生化试样。
1.3.6.3 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析
采用HPLC对面筋蛋白样品中氨基酸变化进行分析。色谱测定参数为流动相A水相为醋酸铵水溶液（0.05 mol/L，pH6.4），流动相B有机相为乙腈水溶液（乙腈∶水=1∶1，体积比），流动相梯度设置如表1所示。色谱柱为Gemini-C18柱，流速1 mL/min，进样量 10 μL，柱温30℃，检测波长360 nm。
表1 HPLC流动相梯度设置
Table 1 HPLC elution gradient
洗脱时间/m i n 流动相A/% 流动相B/%0 8 4 1 6 4 7 0 3 0 7 6 6 3 4 1 2 5 7 4 3 2 1 4 7 5 3 2 2 4 5 5 5 2 5 4 5 5 5 3 4 2 9 8 3 8 8 4 1 6 4 2 8 4 1 6
1.3.7 蛋白质二级结构的测定
称取1 mg～2 mg面筋蛋白样品，与200 mg溴酸钾混匀研磨后压片制样，蛋白质二级结构采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）进行分析。测定参数：波长400 cm-1～4 000 cm-1，室温下扫描32次，分辨率4 cm-1；使用Omnic软件对红外光谱数据进行校正、归一化处理，并通过傅里叶去卷积分析面筋蛋白样品中二级结构含量的变化[20]。
1.3.8 面筋网络微观结构的观测
面筋蛋白样品经喷金处理后，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观测其微观网络结构，放大倍数为1 000倍。
1.4 统计与分析
数据表示为平均值±标准差，在0.05显著性水平上进行单因素方差分析（ANOVA）。
2 结果与分析
2.1 OPC添加量对高筋小麦粉粉质特性的影响
面团是典型的黏弹性流体，同时具有黏性和弹性特征[21]。粉质特性曲线是评价面团特性的重要指标之一，能够给出面粉吸水率、形成时间、稳定时间、弱化度、带宽等面团流变学特性，反映面粉粉质品质[22]。其中，面团的形成时间和吸水率可以表征面筋蛋白的强弱，且呈正相关关系；稳定时间和弱化度可以反映面团机械搅拌过程中耐受程度和面筋筋度的强弱，稳定时间越长，弱化度越小，面筋强度越大；带宽参数即曲线的垂直距离，带宽越宽说明面团的弹性越好[23]。不同OPC添加量（0%～0.5%）对高筋小麦粉（湿面筋含量32.34%）粉质特性的影响如表2所示。
表2 不同OPC添加量对高筋小麦粉粉质特性的影响
Table 2 Effects of OPC addition amounts on farinograph properties of high gluten wheat flour
注：同列中不同小写字母表示在0.05水平上具有显著性差异。
OPC添加量/% 吸水率/% 形成时间/min 稳定时间/min 弱化度/FU 带宽/FU 0 64.20±0.22f 1.58±0.03c 7.27±0.15f 100.40±3.51a 79.20±1.23c 0.1 65.06±0.19e 1.72±0.03b 10.15±0.13e 95.24±2.57a 85.98±1.12b 0.2 66.21±0.10d 1.72±0.04b 11.30±0.06d 73.89±3.39b 88.23±0.23b 0.3 67.17±0.13c 1.92±0.05a 14.89±0.91a 55.00±3.46d 93.01±2.32a 0.4 69.25±0.09b 1.51±0.04c 14.23±0.10b 66.80±3.11c 92.34±2.12a 0.5 70.32±0.11a 1.34±0.05d 13.18±0.06c 65.33±1.74c 92.01±1.98a
由表2可知，随OPC添加量的增加，面团吸水率增大，形成时间、稳定时间、带宽均先增加后减少，而弱化度先减小后增大。虽然面团吸水率在OPC添加量为0.5%时最大，但当OPC添加量为0.3%时，面团形成时间和稳定时间均最长，弱化度最小，带宽最大。结果表明，添加OPC可以适当提高面团的筋度，改善小麦粉粉质特性，提高面筋蛋白的强度，初步选定OPC添加量为0.3%为最佳。
2.2 OPC添加量对面筋蛋白粒径的影响
选取醒发时间30 min，考察不同OPC添加量对面筋蛋白粒径的影响如图1A所示；选定OPC添加量为0.3%时，不同醒发时间对面筋蛋白粒径的影响如图1B所示。
图1 面筋蛋白样品的粒径测定结果
Fig.1 Particle sizes of gluten protein samples
A.不同OPC添加量（醒发时间30 min）；B.不同醒发时间（OPC添加量0.3%）；不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，面筋蛋白粒径随着OPC添加量的增加和醒发时间的延长均呈现先减小后增大的趋势；固定醒发时间为30 min时，不同OPC添加量的面筋蛋白粒径大小介于 26.7 μm～132.1 μm，当 OPC 添加量为0.3%时，粒径最小；固定OPC添加量为0.3%时，不同醒发时间的面筋蛋白粒径大小介于26.7 μm～63.9 μm，当醒发时间为30 min时，粒径最小。这可能是由于OPC促进面筋蛋白中麦谷蛋白相互作用和交联而导致可溶解的面筋蛋白含量和粒径减小[13]。当OPC添加量为0.3%，醒发时间为30 min时，面筋蛋白粒径最小，说明当添加OPC时，醒发时间对OPC促进面筋蛋白交联作用也存在一定影响。
2.3 OPC添加对面筋蛋白中游离巯基和二硫键含量的影响
在面团揉制过程中形成的二硫键是维持面筋蛋白结构和功能的重要因素，其调控对面制品品质至关重要[24]。面筋蛋白中麦谷蛋白主要参与分子间二硫键的形成，而麦醇蛋白则主要参与分子内二硫键的形成[25]。不同OPC添加量和不同醒发时间对面筋蛋白中游离巯基和二硫键含量的影响结果如图2所示。
图2 面筋蛋白样品中游离巯基和二硫键含量测定结果
Fig.2 Content of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in gluten protein samples
A.不同OPC添加量（醒发时间30 min）；B.不同醒发时间（OPC添加量0.3%）；不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，面筋蛋白样品中游离巯基含量随着OPC添加量的增加和醒发时间的延长均呈现先减小后增大的趋势，而二硫键含量则先增大后减小，二者呈现相反的变化趋势；固定醒发时间为30 min时，面筋蛋白中游离巯基含量在OPC添加量为0.3%时最小；固定OPC添加量为0.3%时，在醒发时间30 min时游离巯基含量最小，二硫键含量最大，说明OPC添加可能通过二硫键/巯基交换机制影响面筋蛋白交联作用。选取OPC添加量为0.3%时，在醒发时间为30 min时游离巯基含量最小，二硫键含量最大，说明醒发时间也会干预OPC促进面筋蛋白交联的二硫键/巯基交换过程，进而调控面筋网络的形成。
2.4 游离氨基含量的测定
OPC作为一种多酚类物质，其结构中存在大量的酚羟基，在面团揉制过程中通过氧化醌基很容易与蛋白质上的游离氨基发生反应，进而促进面筋蛋白交联作用[26-28]。为了研究OPC酚羟基是否与面筋蛋白中游离氨基发生了反应，在不同OPC添加量和不同醒发时间条件下，对面筋蛋白样品中游离氨基含量进行了测定，结果如图3所示。
图3 面筋蛋白样品中游离氨基含量测定结果
Fig.3 Content of free amino groups in gluten protein samples
A.不同OPC添加量（醒发时间30 min）；B.不同醒发时间（OPC添加量0.3%）；不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，面筋蛋白样品中游离氨基含量随着OPC添加量的增加和醒发时间的延长均呈现先减小后增大的趋势；醒发时间为30 min时，在OPC添加量超过0.3%时，游离氨基含量显著降低，表明OPC酚羟基可能与面筋蛋白中游离氨基基团发生反应，通过游离氨基交联机制促进面筋筋力的提高。OPC添加量为0.3%时，面筋蛋白粒径在醒发时间30 min时最小，说明醒发时间也会干预OPC促进面筋蛋白交联的游离氨基反应过程，进而调控面筋网络的形成。
2.5 面筋蛋白中氨基酸的变化
已有研究表明，在面筋网络的形成过程中会产生二酪氨酸和异二酪氨酸，麦谷蛋白亚基之间通过酪氨酸侧链残基以二酪氨酸或异二酪氨酸的方式发生分子间交联形成麦谷蛋白交联聚集体[18]。因此，二酪氨酸含量减少能够说明蛋白交联作用增强。在不同OPC添加量和不同醒发时间条件下，对面筋蛋白氨基酸变化进行了测定，结果如图4所示。
图4 面筋蛋白中氨基酸变化HPLC测定结果
Fig.4 HPLC results of changes in amino acids
A.不同 OPC 添加量；B.不同醒发时间；1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.丝氨酸；4.赖氨酸；5.精氨酸；6.甘氨酸；7.苏氨酸；8.脯氨酸；9.丙氨酸；10.氯化铵；11.苯丙氨酸；12.缬氨酸；13.酪氨酸；14.半胱氨酸；15.异亮氨酸；16.亮氨酸；17.组氨酸；18.蛋氨酸。
由图4可知，在不同OPC添加量和醒发时间条件下，面筋蛋白中不同氨基酸含量均有所变化，其中酪氨酸变化最明显。酪氨酸含量随着OPC添加量的增加和醒发时间的延长均呈现先降低后升高的趋势；当OPC添加量为0.3%，醒发时间为30 min时，酪氨酸含量最低。虽然面筋蛋白中酪氨酸含量本身较低，相较于巯基/二硫键交换机制，酪氨酸交联机制在面筋网络形成过程中并不起主导作用；但OPC添加对面筋蛋白中酪氨酸也产生了一定的影响，且醒发时间也会对面筋网络的形成产生影响。
2.6 面筋蛋白二级结构变化
为了进一步探究不同OPC添加量和醒发时间对面筋蛋白非共价交联的作用，采用FTIR对面筋蛋白二级结构进行测定，并计算各二级结构含量，结果如图5所示。
图5 面筋蛋白二级结构含量测定结果
Fig.5 The secondary structural contents of gluten proteins
A.不同OPC添加量（醒发时间30 min）；B.不同醒发时间（OPC添加量0.3%）；不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，α-螺旋含量及β-转角含量与OPC添加量及醒发时间均成正相关趋势；β-折叠含量与OPC添加量及醒发时间均成负相关趋势。这可能是由于氢键作用导致α-螺旋、β-转角结构含量的增加，而氢键和疏水键作用导致面筋蛋白β-折叠结构含量减少[3]。因此，增加OPC添加量和延长醒发时间可以通过加强氢键和疏水相互作用，增强OPC与面筋蛋白的非共价交联。
2.7 面筋蛋白微观结构的SEM观察
为了考察OPC添加对面筋蛋白微观网络结构的影响，在不同OPC添加量条件下，采用扫描电子显微镜对面筋蛋白样品的微观形貌进行了测定，结果如图6所示。
图6 OPC添加量对面筋蛋白微观网络结构的影响
Fig.6 Effects of OPC addition amounts on the microstructure of the gluten samples
A.0%；B.0.1%；C.0.2%；D.0.3%；E.0.4%；F.0.5%
由图6可知，固定醒发时间30 min，面筋蛋白骨架间孔隙随着OPC添加量的增加呈现先减小后增大的趋势。未添加OPC的面筋蛋白截面呈现多孔隙、蜂窝状结构；随着OPC添加量的增加，面筋蛋白形成更加致密的微观网络结构，骨架间孔隙变小，内部连接紧密的区域增多；当OPC添加量为0.3%时，骨架间孔隙最小，具有明显成片、类似絮状的微观结构，面筋网络结构最为致密；当OPC添加量超过0.3%后，骨架间孔隙变大，面筋网络结构变得松散，但仍较未添加OPC时孔隙更小。因此，添加OPC对面筋蛋白微观网络结构存在一定影响。
3 结论
本文研究了葡萄籽低聚原花青素对面筋蛋白交联作用的影响。结果表明，添加OPC对面筋交联过程中二硫键-巯基交换反应、游离氨基交联、酪氨酸交联反应，以及氢键和疏水相互作用均存在一定影响，并且醒发时间也影响OPC对形成面筋网络的促进作用。通过调控OPC添加量和醒发时间，提高了面团的吸水率、形成时间、稳定时间和带宽，降低了弱化度；形成了均匀致密的面筋网络结构。上述试验结果为OPC及天然植物酚类作为面粉改良剂提供了前期的理论分析和试验依据。
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