硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于人们的日常生活中，如在蔬菜、水及食品当中[1-3]。亚硝酸盐在肉制品加工中具有良好的发色、抗氧化和抑菌作用[4]，在保护人体心血管系统和胃黏膜以及代谢疾病中起着重要作用[5-7]。亚硝酸盐可以与血液中的血红蛋白结合，使血红蛋白失去运输氧气的能力，导致组织吸收氧气困难，出现典型的青紫和中毒症状[8]。当外界的亚硝酸盐进入胃后，会与蛋白质分解产生的仲胺合成亚硝胺，从而使人患癌[9]。亚硝酸盐可随着孕妇的乳汁和胎盘进入胎儿体内，导致胎儿缺氧、皮肤青紫斑和先天性畸形[10]。此外，当人体一次性摄入0.3 g～0.5 g的亚硝酸盐时就会中毒，超过3.0 g可致死亡[11]。因此寻找有效降解亚硝酸盐的方法已成为近年来的研究热点。
亚硝酸还原酶（nitrite reductase，NiRs）是催化亚硝酸盐（nitrite，NIT）还原的一类酶，可降解NIT为NO或NH3，是自然界氮循环过程的关键酶[12]。按照反应物和辅助因子的不同，亚硝酸还原酶分为铜型亚硝酸还原酶（CuNiRs）、细胞色素cd1型亚硝酸还原酶（cd1NiRs）、多聚血红素c亚硝酸还原酶（ccNiRs）和铁氧化还原蛋白依赖的亚硝酸还原酶（FdNiRs）等类型[13]。在植物细胞内，NiRs在叶绿体或非绿色组织的质体中，存在于竹子、水稻等高等植物中的NiRs可以促进植物再生，提高愈伤组织的愈伤率[14]。在微生物蜡状芽孢杆菌、胃幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌中均发现了NiRs，含有NiRs的反硝化细菌能降解环境中的NIT，可用于污水处理[15-17]。多数乳酸菌是人体益生菌，可产亚硝酸还原酶，该酶可以应用于控制食品和饮用水中的亚硝酸盐。当前国外研究者已从大麦叶片[18]、木糖氧化产碱菌[19]、蓝细菌[20]和巨大芽孢杆菌[21]等中分离得到NiRs，并对其酶学性质进行了研究，而从植物乳杆菌中分离提纯NiRs的研究还鲜有报道。借鉴于此，本研究以乳酸菌为研究对象，从中筛选出降解亚硝酸盐能力最强的菌株，并对其NiRs进行分离纯化和酶学性质研究，以期为今后进一步研究其降解亚硝酸盐机理及NiRs应用研究提供良好的菌种资源和试验数据。
1 材料、试剂与仪器
1.1 材料
197株供试菌株均分离自市售传统发酵乳制品。
MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、结晶硫酸镁0.6 g、无水乙酸钠5.0 g、硫酸锰0.2 g、牛肉浸粉10.0 g，蒸馏水 1 000.0 mL。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上加入1.5%琼脂。
1.2 试剂
DEAE-52、葡聚糖凝胶 G-150、透析袋（8 000～14 000）：北京Solarbio公司；亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。HBI乳酸菌生化鉴定条：青岛海博生物技术有限公司。
1.3 仪器
JH1102电子精密天平：深圳市三利化学品有限公司；DHP-908电热鼓风恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；YXQ-LS-100SⅡ高蒸汽压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；YC-1数控层析实验冷柜：上海青浦沪西仪器厂；Qsonica Q500超声波细胞破碎仪：美国Misonix公司。
2 方法
2.1 供试菌液的制备
将保存的乳酸菌接种于脱脂乳培养基中，凝固后，取一环接种于MRS液体培养基中，37℃培养12 h～24 h，传代3次，保藏备用。
2.2 亚硝酸盐标准曲线的制作
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》制作亚硝酸盐标准曲线[22]。
2.3 降解亚硝酸盐菌株的筛选
将供试菌株接种于含100 mg/L亚硝酸盐的MRS液体培养基中，接种量为2%，37℃培养24 h，按GB 5009.33—2016进行亚硝酸盐含量的测定。
2.4降解亚硝酸盐乳酸菌的鉴定
2.4.1 菌株的形态观察
将筛选出的目的菌株在MRS固体培养基上划线，37℃培养1 d～2 d，观察菌落形态，挑选单个菌落进行革兰氏染色，参照《常见细菌系统鉴定手册》[23]做菌株形态镜检。
2.4.2 菌株的糖类发酵试验
将目的菌株的供试菌液接种于分别含11种不同糖类的培养基中，37℃培养24 h～48 h，观察目的菌株对11种糖类的利用情况，结果按照HBI乳酸菌生化鉴定条的说明进行判定。
2.4.3 菌株的分子生物学鉴定
对目的菌株的16S rDNA基因的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增参考段晓霞等[24]的方法，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行测定，最后送至上海生工有限公司进行16S rDNA基因序列测序，将所测得的序列与NCBI中的BLAST分析进行比较，用MEGA-X软件构建发育树。
2.5 亚硝酸还原酶的分离纯化
2.5.1 酶的纯化
将目的菌株用MRS液体培养基活化3代后，以4%的接种量接种于含100 mg/L NaNO2的MRS液体培养基中，37℃培养12h，于4℃、5 000 r/min离心20 min后收集菌泥，取10 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.5，0.1 mol/L）使菌体悬浮，再次离心、洗涤2次，使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，于4℃、8 000 r/min离心20 min，上清液即粗酶液。将粗酶液先后用硫酸铵分级沉淀法，DEAE-52阴离子交换层析、Sephadex G-150柱层析进行酶的纯化，冷冻干燥的酶纯化制品于-4℃保存备用。
2.5.2 测定酶活力及酶蛋白质含量
参照文献[25]测定酶活力，体系共250 μL：125 μL 0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 6.5）、15 μL 0.1 mol/L NaCl、12.5 μL 0.1 mol/L NaNO2、0.1 mol/L 甲基紫晶 7.5 μL、50 μL 酶液、40 μL 0.1 mol/L Na2S2O4，混匀后于50 ℃反应20 min，剧烈振荡至无色终止反应。酶活力单位定义：每分钟还原1 μg亚硝酸盐所需的酶量为一个酶活力单位。
酶蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[26]测定。
2.5.3 酶的纯度及相对分子量测定
参照文献[27]对酶的纯度及相对分子量进行测定。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）条件：浓缩胶 5%，分离胶 12%；浓缩胶选用80 V固定直流电压，待进入分离胶时改用120 V直流电压。电泳结束后将胶取出，用考马斯亮蓝进行染色，脱色至电泳带清晰可见。
2.6 亚硝酸还原酶的酶学性质研究
2.6.1 pH值对NiRs酶活及稳定性的影响
在pH值为5.0～8.0的条件下按照2.5.2的方法于50℃反应20 min，测定相对酶活力。将pH5.0～8.0的PBS缓冲液与酶液按体积比1∶1混匀，于4℃下放置2 h后测定相对酶活力。
2.6.2 温度对NiRs酶活及稳定性的影响
在温度为35℃～60℃条件下按照2.5.2的方法反应20 min，测定相对酶活力。将酶液于35℃～60℃条件下保温6 h后，测定相对酶活力。
2.6.3 金属离子与乙二胺四乙酸对NiRs酶活的影响
根据 2.5.2 中的方法，分别加入 Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Fe3+、K+和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），使金属离子和EDTA的最终浓度分别为1、5、10 mmol/L，于50℃、pH 6.5条件下测定酶活，并和不添加任何金属离子的酶活进行比较，计算相对酶活力。
2.6.4 米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）的测定
配制不同浓度（1 mmol/L～5 mmol/L）的NaNO2溶液，在pH 6.5、50℃的条件下测定不同浓度下的酶促反应速度，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算NiRs的Km值和Vmax。
2.7 数据处理
每个样本均进行3次平行试验，结果以均值±标准差表示；组间比较采用单因素ANOVA分析，部分数据采用SPSS 19.0软件中的Duncan法进行显著性分析。
3 结果与分析
3.1 亚硝酸盐标准曲线
参照GB 5009.33—2016制作的亚硝酸盐标准曲线回归方程为y=0.779x-0.005，相关系数为R2=0.995，拟合度良好，可用于样品中亚硝酸盐含量的测定。
3.2 降解亚硝酸盐菌株的筛选结果
将197株乳酸菌按2%接种量接种于含100mg/L亚硝酸盐的MRS液体培养基中，培养24 h后测定其发酵液中的亚硝酸盐含量，其中亚硝酸盐降解率在90%以上的32株乳酸菌的结果见表1。
表1中32株乳酸菌的亚硝酸盐降解率均在90%以上，其中菌株36的亚硝酸盐降解率最高，且降解率为（96.36±0.37）%，因此将菌株36确定为目的菌株。张兴吉等[28]从传统发酵乳制品中分离出275株乳酸菌，其中50%的菌株表现出较好的亚硝酸盐降解能力，平均在91.3%以上；程方方等[29]从传统酸马乳中分离出183株乳酸菌，共有28株乳酸菌具有亚硝酸盐降解能力，其中菌株C27亚硝酸盐降解率达88.91%。可见，从传统发酵乳制品中分离的乳酸菌具有较高的亚硝酸盐降解能力且具有较好的研究价值。
表1 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选
Table 1 Screening of nitrite degrading lactic acid bacteria
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3.3 降解亚硝酸盐乳酸菌的鉴定结果
3.3.1 菌株的形态观察
菌株36的菌落形态及细胞形态见图1。
通过菌落形态观察（图1A）和菌株细胞形态（图1B）得知，菌株36在MRS固体培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，颜色为白色，是一株革兰氏阳性杆状菌。
图1 菌株36的菌落形态及细胞形态
Fig.1 Colony and cell morphology of strain 36
A.菌株36的菌落形态；B.普通光学显微镜下的菌株36细胞形态（100×）。
3.3.2 菌株的糖类发酵试验
菌株36的糖类发酵试验结果见表2。
表2 菌株36的糖类发酵试验
Table 2 Sugar fermentation test of strain 36
注：+表示阳性；-表示阴性。
序号 糖类名称 结果1七叶苷 +2纤维二糖 +3麦芽糖 +4甘露醇 +5水杨苷 +6山梨醇 +7蔗糖 +8棉子糖 +9菊糖 -10 乳糖 +11 1%马尿酸钠 +
由表2可知，菌株36可利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖和1%马尿酸钠，不能利用菊糖，菌株36的糖类发酵试验结果与植物乳杆菌一致[30]，因此将菌株36初步鉴定为植物乳杆菌。
3.3.3 菌株的分子生物学鉴定
菌株36的16S rDNA基因序列发育树见图2。
图2 菌株36的16S rDNA基因序列发育树
Fig.2 16S rDNA gene sequence development tree of strain 36
分支上的数字表示构建系统发育树时1 000次计算形成该节点的百分比；分支的长度代表进化距离，系数为0.01；括号中序号代表菌株序列号。
菌株36的16S rDNA基因序列长度为1 464 bp，在NCBI中登录号为MN611150。经BLAST在线分析得知，菌株36与L.plantarum JCM 1149的同源性达100%，并且进化距离最近（图2），而且菌株36的糖类发酵结果与植物乳杆菌一致，因此鉴定菌株36为植物乳杆菌。
3.4 亚硝酸还原酶的分离纯化结果
3.4.1 酶的纯化
NiRs的分离纯化见图3。
图3 NiRs的分离纯化
Fig.3 Separation and purification of NiRs
A.DEAE-52离子交换层析；B.Sephadex G-150凝胶过滤层析。
菌株36的NiRs粗酶液先后用硫酸铵分级沉淀法，DEAE-52阴离子交换层析（图3A）、Sephadex G-150柱层析（图3B）等进行酶的纯化，得到一个活力峰，将该活力峰下的酶液收集于同一管中，浓缩冻干后备用。
3.4.2 酶活力及酶蛋白质含量测定结果
酶活力及酶蛋白质含量测定结果见表3。
表3 酶活力及酶蛋白质含量
Table 3 Determination of enzyme activity and enzyme protein content
纯化步骤 体积/mL总酶活/U总蛋白/mg比酶活/（U/mg）回收率/%纯化倍数粗酶液 250 1 546.68 217.14 7.12 100 1.00硫酸铵沉淀 150 1 304.91 103.58 12.60 84.37 1.77 DEAE-52 50 283.13 5.86 48.35 18.31 6.79 Sephadex G-150 15 239.62 2.41 99.35 15.50 13.95
由表3可知，菌株36的NiRs比酶活为99.35U/mg，回收率为15.50%，纯化倍数为13.95。
3.4.3 酶的纯度及相对分子量测定结果
NiRs的SDS-PAGE凝胶电泳图见图4。
图4 NiRs的SDS-PAGE凝胶电泳图
Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoresis of NiRs
1.蛋白质Marker；2.Sephadex G-150层析后的酶液。
纯化后的NiRs经SDS-PAGE电泳结果（图4）显示为单一条带，表明纯化后的NiRs达到了电泳纯，经蛋白标准曲线 y=-1.453 1x+2.520 7（R2=0.981 4），可计算得出NiRs的亚基相对分子质量约为47.8 kD。
3.5 亚硝酸还原酶的酶学性质
3.5.1 pH值对NiRs酶活力及稳定性的影响
不同pH值对NiRs相对酶活力和稳定性的影响结果见图5。
图5 pH值对NiRs相对酶活力及稳定性的影响
Fig.5 The influence of pH value on the relative enzyme activity and stability of NiRs
A.pH值对NiRs相对酶活力的影响；B.pH值对NiRs稳定性的影响。
由图5A可知，当pH值在5.0～6.5内，随着pH值的提高，NiRs相对酶活力逐渐升高；当pH值达6.5时，NiRs相对酶活力最强；当pH值在6.5～8.0内，随着pH值的升高，NiRs相对酶活力逐渐降低，尤其pH值为7.5时，NiRs相对酶活力迅速降低至30.0%。由图5B可知，pH值对NiRs稳定性的影响与图5A变化趋势一致，因此NiRs的最适pH值为6.5。龚钢明等[31]对乳酸菌C2的NiRs进行酶学性质研究，结果发现乳酸菌C2的NiRs最适pH值为5.5，而菌株36的NiRs最适pH值要略高于乳酸菌C2，可能菌株差异所致，原因有待进一步研究。
3.5.2 温度对NiRs酶活力及稳定性的影响
不同温度对NiRs相对酶活力和稳定性的影响结果见图6。
图6 温度对NiRs相对酶活力及稳定性的影响
Fig.6 The influence of temperature on the relative enzyme activity and stability of NiRs
A.温度对NiRs相对酶活力的影响；B.温度对NiRs稳定性的影响。
由图6A可知，当温度在35℃～50℃时，随着温度的升高，NiRs相对酶活力逐渐升高；当温度达50℃时，NiRs相对酶活力最强；当温度在50℃～60℃时，随着温度的升高，NiRs相对酶活力逐渐降低，尤其温度达60℃时，NiRs相对酶活力迅速降低至9.37%。由图6B可知，随着温度的升高，NiRs相对酶活力稳定性整体呈下降趋势，当温度在35℃～50℃时，NiRs相对酶活力维持在70%～100%之间，当温度在50℃～60℃时，NiRs相对酶活力稳定性迅速降低。因此，将菌株36的NiRs最适温度确定为50℃。据丁少南[13]对L.plantarum DS31的NiRs酶学性质研究，NiRs最适温度为35℃，而菌株36的NiRs最适温度为50℃，所以菌株36的NiRs耐热性更好，有利于扩大其应用范围。
3.5.3 金属离子和EDTA对NiRs酶活的影响
金属离子和EDTA对NiRs相对酶活力的影响见图7。
由图7可知，当金属离子添加浓度在1 mmol/L～10 mmol/L 时，Fe2+、Fe3+和Ca2+对 NiRs酶活力有显著激活作用（P＜0.05），1 mmol/L 和10 mmol/L的Na+以及10 mmol/L的Ba2+也有显著激活作用（P＜0.05）；而1 mmol/L和5 mmol/L的Ba2+和K+对NiRs酶活力有显著抑制作用（P＜0.05），但EDTA对酶活无显著影响。
图7 金属离子和EDTA对NiRs相对酶活力的影响
Fig.7 The influence of met al ions and EDTA on the relative enzyme activity of NiRs
CK.未添加金属离子和EDTA的反应体系；不同字母代表不同离子间差异显著（P＜0.05）。
3.5.4 Km值和Vmax的测定结果
以不同浓度的NaNO2为底物，在pH 6.5、50℃条件下测定NiRs的动力学参数。根据试验数据求出不同底物浓度[S]下的反应速率[V]，以1/[S]为横坐标，1/[V]为纵坐标，根据双倒数作图法得到NiRs的双倒数曲线见图8。
图8 亚硝酸还原酶双倒数曲线
Fig.8 Nitrite reductase double reciprocal curve
由图8可知，菌株36的NiRs的Km值为7.79 mmol/L，Vmax为5.84 mg/（L·min）。
4 结论
亚硝酸盐含量过高一直是食品工业和消费者严重关注的问题之一。通过从197株乳酸菌中筛选出一株降解亚硝酸盐能力最强的菌株36，测得其亚硝酸盐降解率为（96.36±0.37）%。通过形态观察及分子生物学鉴定得知菌株36为植物乳杆菌（L.plantarum）。最后将菌株36发酵液离心收集菌体，经细胞破碎和分级纯化获得NiRs，其比酶活为99.35 U/mg，回收率为15.5%且亚基相对分子质量约为47.8 kD，经酶学性质研究得知，该酶最适pH值为6.5，最适温度为50℃，Km值为7.79 mmol/L，Vmax为5.84 mg/（L·min）；当金属离子添加浓度为1 mmol/L～10 mmol/L 时，Fe2+、Fe3+和Ca2+对NiRs酶活力有显著激活作用（P＜0.05），1 mmol/L和10 mmol/L的Na+以及10 mmol/L的Ba2+也有显著激活作用（P＜0.05）。而 1 mmol/L 和5 mmol/L的Ba2+与 K+对NiRs酶活力有显著抑制作用（P＜0.05），但EDTA对酶活无显著影响。总之，具有较强降解亚硝酸盐能力的植物乳杆菌36为今后降解亚硝酸盐应用和NiRs基因表达研究提供理论依据及试验材料。
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