单细胞蛋白（single cell protein，SCP）大部分来自于细菌和酵母，其不但与鱼粉具有相似的赖氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸含量，还具有较高比例的色氨酸和苏氨酸[1]。SCP是一种高品质蛋白质的替代来源，在畜产和水产养殖中已经得到了广泛应用[2]，并且它可以作为富含蛋白质食物的替代品[3]，可以替代传统（植物和动物）蛋白质来源，而不会产生有害影响[4]。
乙醇梭菌蛋白就是一种新型单细胞蛋白源，是以乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）为发酵菌种生产的一种新型菌体蛋白[5]，代谢快、生产率高、成本较低且蛋白质含量高，蛋白质含量可达80%，超过了进口鱼粉，并含有丰富的必需氨基酸[6]。尹秀娟等[1]用3%的单细胞蛋白和蛋白肽替代鱼粉，发现可以使断奶仔猪获得与使用鱼粉时相似的生长性能、养分消化和肠道形态。吴雨珊[7]对乙醇梭菌蛋白与传统蛋白源豆粕、棉粕、菜粕和酒糟蛋白（distillers dried grains with solubles，DDGS）进行对比分析，发现乙醇梭菌蛋白的蛋白含量高、蛋白溶解度高、吸水性强，其制粒性能优于其他4种蛋白源。陈颖[8]用乙醇梭菌蛋白替代饲料中不同比例的鱼粉，发现其对生长性能、抗氧化能力和消化酶活性等未见明显的不良影响，并且可以明显降低氮磷排放量。
乙醇梭菌蛋白与传统植物源性蛋白质相比，其不含抗营养因子，而相对于动物源性蛋白质来说，其生产具有绿色、节能、环保的特性，没有致病性，因此具有广阔的开发前景。目前我国广泛使用的动物蛋白源主要是豆粕、花生粕、鱼粉等，每年依靠进口大量的大豆来做饲料，成本很高[9]，而且近年来鱼粉供求关系紧张，因此解决该困境的重要途径之一就是合理地开发和利用动植物蛋白源[10]。
蛋白质的提取分离对于研究蛋白质非常重要，提取分离方法主要包括咪唑法、电泳法、苯酚提取法等[11]，其中超声技术可以通过声波的影响来提高提取效率，也可用于增强蛋白质功能性质，是一种安全、低成本、可靠、可复制、无创性而又不会污染环境的提取方法，与传统的萃取方法相比有着很大的优势[12-13]。Osborne分级法是根据蛋白质的溶解性进行分级提取的一种方法，简单便捷易于操作，并且可以有效分离不同溶解性的蛋白质，孙媛[14]通过改良Osborne分级法为小麦麸皮的高值利用提供了新路径；姜燕蓉等[15]也曾用此方法成功提取牡蛎蛋白，该方法可以根据溶解性质的不同将蛋白质分级成水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶蛋白（溶于50%～90%的乙醇溶液）和碱溶性蛋白[16]，对蛋白质可以进行较好地分离。
乙醇梭菌蛋白价值很大、前景广阔，但国内外的各种研究报道较少，因此本研究拟通过Osborne分级法对乙醇梭菌蛋白进行分级分离，并对其含量最高的蛋白质种类进行提取条件的优化，探究超声温度、超声时间、料液比以及溶液浓度对其提取率的影响，为乙醇梭菌蛋白的后续开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
乙醇梭菌蛋白：北京首钢朗泽新能源科技有限公司；蒸馏水：上海康力士分析仪器有限公司；硫酸钠、乙醇、氢氧化钠、氯化钠：国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白标准液：碧云天生物技术有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
CP413精密天平：上海奥豪斯仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；2-16KL台式高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；ALPHA 1-4 LD Plus冷冻干燥机：德国CHRIST公司；MULTISKAN Sky全波长酶标仪：美国Thermo scientific公司，Heal Force净水系统：上海康力士分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 Osborne分级法提取乙醇梭菌蛋白
称取一定质量的乙醇梭菌蛋白粉末，将蒸馏水按料液比1∶15（g/mL）加入其中，在30℃、100 W的条件下超声辅助提取20 min，在4℃、8 000 r/min的条件下离心20 min，对得到的上清液进行旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到水溶性蛋白，离心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入2%硫酸钠溶液，在相同条件下进行超声离心，所得上清液进行冷冻干燥得到盐溶性蛋白，之后在离心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入70%乙醇溶液，在相同条件下进行超声离心，所得上清液进行浓缩、冷冻干燥后得到醇溶性蛋白，向离心得到的沉淀中按照料液比1∶15（g/mL）加入2%氢氧化钠溶液，超声离心，所得上清液浓缩、冷冻干燥得碱溶性蛋白[17-18]，具体工艺流程见图1。记录分类后进行各蛋白组分含量[19]的计算，之后再对含量最多的蛋白质种类进行进一步研究。
图1 乙醇梭菌蛋白分级提取工艺流程图
Fig.1 Process flow chart of fractionated extraction of Clostridium autoethanogenum protein
1.3.2 标准曲线制作
采用牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）作为蛋白质标准品[20]制作标准曲线。具体方法为准确吸收5.00 mg/mL牛血清蛋白标准液于试管中，分别以蒸馏水稀释，配成 0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500mg/mL的牛血清蛋白标准液，空白对照组以蒸馏水代替，之后各吸取5 μL于96孔板中，再于各孔中加入250 μL考马斯亮蓝G-250试剂，2 min后在酶标仪上于595 nm处测吸光值，制作蛋白标准曲线。
1.3.3 单因素试验
针对Osborne分级法分离出的蛋白质含量最高的碱溶性蛋白进行单因素试验，研究超声时间、氢氧化钠溶液质量分数、超声温度和料液比对蛋白得率的影响。
1.3.3.1 超声时间对蛋白得率的影响
准确称取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末7份，在2%氢氧化钠溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超声温度35℃、超声功率100W的条件下，探究超声时间15、20、25、30、35、40、45 min 对碱溶性蛋白的蛋白得率的影响。
1.3.3.2 氢氧化钠溶液质量分数对蛋白得率的影响
准确称取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在料液比1∶20（g/mL）、超声温度35℃、超声功率100 W、超声时间20 min的条件下，探究氢氧化钠溶液质量分数为0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%对碱溶性蛋白的蛋白得率的影响。
1.3.3.3 超声温度对蛋白得率的影响
准确称取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氢氧化钠溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超声时间20 min、超声功率100 W的条件下，探究超声温度25、30、35、40、45、50 ℃对碱溶性蛋白的蛋白得率的影响。
1.3.3.4 料液比对蛋白得率的影响
准确称取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氢氧化钠溶液中以超声温度35℃、超声功率100 W、超声时间20min条件下，探究料液比 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）对碱溶性蛋白的蛋白得率的影响。
1.3.4 正交试验
在单因素试验结果基础上，采用L9（34）正交设计对乙醇梭菌蛋白中碱溶性蛋白的提取条件进行优化，正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factor level table of orthogonal test
水平 A超声温度/℃B料液比/（g/mL）C超声时间/min D NaOH溶液质量分数/%1 40 1∶30 30 0.3 2 45 1∶35 35 0.5 3 50 1∶40 40 1.0
1.3.5 蛋白得率的计算
通过考马斯亮蓝染色法[21]，测定595 nm处的吸光值，根据标准曲线计算出相应的蛋白浓度，根据不同提取条件下的提取液，计算得到相应的蛋白得率[22]，具体计算方法如下。
式中：c为乙醇梭菌蛋白碱溶性蛋白浓度，g/mL；v为溶液体积，mL；m为乙醇梭菌蛋白质量，g。
1.3.6 数据处理
试验设置3个重复，每个单因素试验进行3次平行试验。试验数据采用Microsoft Excel软件进行制图，利用SPSS 17.0进行数据分析，通过单因素分析、F检验对各因素水平进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 乙醇梭菌蛋白的Osborne分级法分类结果
通过Osborne分级法对乙醇梭菌蛋白进行分级提取后，得到的各类蛋白含量见图2。
图2 Osborne分级法提取后各类蛋白含量
Fig.2 Content of various proteins after Osborne classification
由图2可知，按照Osborne分级提取的方法提取得到的4种蛋白中，水溶性蛋白占蛋白质总含量的3.43%、盐溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、碱溶性蛋白占76.80%。其中含量最多的为碱溶性蛋白，因此后续对碱溶性蛋白进行进一步的研究，研究碱溶性蛋白的最佳提取条件。
2.2 标准曲线的制作
牛血清蛋白标准曲线见图3。
由图3可知，以牛血清蛋白浓度为横坐标，以595 nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.751 7x+0.692 7（R2=0.996 7），线性关系良好。
图3 牛血清蛋白标准曲线
Fig.3 Bovine serum protein standard curve
2.3 单因素试验结果
2.3.1 超声时间对提取结果的影响
超声时间对碱溶性蛋白的蛋白得率影响见图4。
由图4可知，在15 min～30 min时，蛋白得率随着超声时间的延长逐渐上升，但趋势较为缓慢，到35 min时蛋白得率达到最高，之后开始下降，这可能是因为适宜的超声时间可以一定程度上促进蛋白质的提取，但随着超声时间的延长容易导致蛋白质变性，从而导致得率在一定程度上下降[23]。通过单因素分析可看出15min与35min有明显差异，因此选择30、35、40 min 3个水平进行正交试验。
图4 超声时间对蛋白得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield
2.3.2 氢氧化钠溶液质量分数对提取结果的影响
氢氧化钠溶液质量分数对碱溶性蛋白的蛋白得率影响见图5。
图5 氢氧化钠溶液质量分数对蛋白得率的影响
Fig.5 Effect of mass fraction of sodium hydroxide solution on extraction yield
由图5可知，氢氧化钠溶液质量分数在0.3%～0.5%时，蛋白得率随着质量分数的增加逐渐升高，0.5%时蛋白得率达到最大，之后整体呈下降趋势，由此可见，随着氢氧化钠溶液质量分数的增加，碱溶性蛋白得率也升高，但继续增加得率反而下降，分析可能是随着氢氧化钠溶液质量分数的上升，改变了蛋白质对水的亲和性和表面带电荷状况等[24]，在低浓度的碱溶液中，由于效应离子强度增加，增强了蛋白质分子与水分子之间的相互作用，进而使蛋白质的溶解度增加[25]，但增长有一定的限度，再增加氢氧化钠浓度可能会导致此蛋白质变性，从而使提取率下降。因此选择0.3%、0.5%、1.0%3个水平进行正交试验。
2.3.3 料液比对提取结果的影响
料液比对碱溶性蛋白的蛋白得率影响见图6。
图6 料液比对蛋白得率的影响
Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield
由图6可知，料液比在1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）时蛋白得率随着溶液体积的增加逐渐升高，但增长缓慢，到1∶35（g/mL）时达到最大，之后稍微有所下降，这可能是因为溶液体积较小时，溶液较黏稠，溶出率较小，因此得率不高，之后随着溶液体积的增大，蛋白质在更多溶剂中的分散作用使蛋白质的提取量有所增加[26]，但随着溶液体积增大，分散度已经达到最大，再增加已经不会有更好的提取效果，反而有可能受到一定的抑制作用。因此选择1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）3个水平进行正交试验。
2.3.4 超声温度对提取结果的影响
超声温度对碱溶性蛋白的蛋白得率影响见图7。
图7 超声温度对蛋白得率的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield
由图7可知，在25℃～45℃时，蛋白得率随着超声温度的升高而升高，在50℃有所下降，在45℃，时蛋白得率达到最高，之后蛋白得率开始下降，这可能是因为维持蛋白质各亚基之间的空间构象的各类次级键因分子剧烈运动而破坏[27]，温度达到一定程度会导致蛋白质变性或热降解从而使蛋白得率不再增加[28]。因此选择40、45、50℃3个水平进行正交试验。
2.3.5 正交试验结果
正交设计结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 正交设计结果
Table 2 Orthogonal design results
试验号 A超声温度 B料液比 C超声时间D NaOH溶液质量分数蛋白得率/%1 1 1 1 1 63.60 2 1 2 2 2 38.13 3 1 3 3 3 35.40 4 2 1 2 3 27.90 5 2 2 3 1 57.22 6 2 3 1 2 71.65 7 3 1 3 2 37.99 8 3 2 1 3 67.00 9 3 3 2 1 52.64 k1 45.71 43.16 67.42 57.82 k2 52.26 54.12 39.56 49.26 k3 52.54 53.23 43.54 43.43 R 6.83 10.96 27.86 14.38因素主次 CDBA最优组合条件 A3B2C1D1
表3 正交设计方差分析
Table 3 Analysis of variance of orthogonal design
注：**为极显著，p＜0.01；*为显著，p＜0.05。
方差来源 平方和自由度 均方 F值 p值 显著性A 268.829 2 134.415 1.396 0.273 1 B 666.966 2 333.483 3.464 0.053 4 C 4 086.470 2 2 043.235 21.224 0.000 1 **D 942.380 2 471.190 4.894 0.020 1 *误差 1 732.861 18 96.270总和7 697.507 26
由表2可知，通过极值R大小得出各因素对蛋白得率影响大小为超声时间＞氢氧化钠溶液质量分数＞料液比＞超声温度。由表3可知，本试验超声时间对碱溶性蛋白的蛋白得率影响为极显著（p＜0.01），氢氧化钠溶液质量分数对得率的影响显著（p＜0.05），提取温度和料液比对得率有一定影响（p＜0.25），结果不显著[29]。综合分析得到碱溶性蛋白的最佳提取工艺参数为A3B2C1D1。
2.4 验证试验
准确称取一定量乙醇梭菌蛋白粉末3份，按最佳工艺参数A3B2C1D1进行超声辅助提取，测量其吸光值，算出其蛋白得率为75.75%。蛋白得率大于其他提取工艺参数，因此选择A3B2C1D1为最佳工艺参数，此时得率75.75%。
3 结论
本研究通过Osborne分级法提取乙醇梭菌蛋白并进行了提取分类，最终分级为水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白以及碱溶性蛋白4种蛋白，水溶性蛋白占蛋白质总含量的3.43%、盐溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、碱溶性蛋白占76.80%。由此可知，碱溶性蛋白含量最多，具有研究价值，因此后续的条件优化以碱溶性蛋白作为研究对象。
根据单因素试验结果以及正交试验对乙醇梭菌蛋白中的碱溶性蛋白进行了提取优化，探究超声温度、料液比、超声时间以及氢氧化钠溶液质量分数对碱溶性蛋白的蛋白得率的影响，最终得到最佳工艺参数为超声温度50℃、料液比1∶35（g/mL）、超声时间为30 min、氢氧化钠溶液质量分数为0.3%，此时蛋白得率为75.75%。
乙醇梭菌蛋白拥有广阔的开发前景，是一种可以代替植物和动物蛋白源的优质蛋白源，但目前国内外对于乙醇梭菌蛋白的研究都非常少，乙醇梭菌蛋白的结构及活性探究方面还需要进一步的研究，因此该试验可以为乙醇梭菌蛋白在饲料及功能性食品等方面的开发利用提供一定的试验依据，给后续研究以一定的参考，有利于其进一步的研究与开发。
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