核桃又名胡桃，作为我国的一种优良经济作物，在2017年其产量就高达385万吨，产值达933.4亿元[1-2]。核桃除可以鲜食外，主要是被用来榨油，核桃油以其丰富的不饱和脂肪酸被世人所推崇[3-4]。就在核桃油畅销的同时，也面临着核桃粕的处理与应用的问题。核桃粕中的蛋白质含量丰富，占其干重的43%以上，含有的18种氨基酸中有8种必需氨基酸与联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）推荐的人体氨基酸模式相近，被认为是优质蛋白[5-6]。但目前核桃粕整体利用率低下，基本被用作动物饲料或直接丢弃，不仅造成环境污染，还导致大量蛋白资源的浪费[7-9]。所以对核桃蛋白进行发酵降解，进一步提高核桃粕的综合利用价值，对核桃资源的开发与利用具有重要意义。蛋白酶是原料降解过程中的重要酶类，决定着生成氨基酸、短肽、多肽的多寡，关系着原料的充分利用与否[10]。而米曲霉是目前微生物发酵产蛋白酶最重要的菌株，其生长迅速，使用方便，对营养环境要求低，是表达外源蛋白的理想宿主[11]。米曲霉的基因组中含有135个胞外蛋白酶基因，其胞外蛋白酶系非常复杂，主要是通过顶端分泌的方式分泌到胞外，并且在发酵过程中不产生毒素，是分解各类蛋白的最佳选择[12]。其产生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，由于在发酵期间不同蛋白酶之间交替发生作用，往往能够赋予产品独特的风味[13]。蛋白酶的酶活性高低是米曲霉菌种的衡量指标，蛋白酶活性的高低决定着蛋白质的利用率，高的酶活力不仅可以更好地分解原料，提高原料利用率，而且还可以减少酿造工业的污染，对于实际生产具有十分重要的作用[14]。本文采用沪酿3.042米曲霉为菌种对核桃粕进行发酵，以蛋白酶活力为评价指标，通过单因素和正交试验确定米曲霉发酵核桃粕产蛋白酶的最优发酵条件，为核桃粕蛋白资源的利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃粕：河北绿岭有限公司生产基地；沪酿3.042米曲霉：中国工业微生物菌种保藏管理中心；福林试剂、硫酸铜、硫酸钾、甲基红指示剂、石油醚、硫酸铜、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、干酪素、酪氨酸（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
XL-100马弗炉：鹤壁亿欣仪表有限公司；UV-1700PC紫外可见分光光度计：上海美析仪器分析公司；WS恒温恒湿培养箱：上海树立仪器仪表公司；MB35水分测定仪：瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 米曲霉发酵核桃粕工艺流程
以冷榨核桃粕为原料，进行粉碎和过筛，并将筛下物做浸润处理。润料完成后，将核桃粕放入锅中蒸煮1 h后焖锅冷却。待物料温度降到32℃后，接入一定量的米曲霉菌种，混合均匀后平铺到托盘中，料厚1.0 cm～1.5 cm，并在物料上盖6层湿纱布，每隔2 h向湿布上喷洒无菌水保持纱布的湿润状态，以保证米曲霉生长所需的湿度。最终将物料放入恒温培养箱中进行培养。由于菌种在生长繁殖的过程中会产热，在培养的过程中，物料的温度往往会高于培养箱的温度，所以需要在物料中插入温度计，以实时监测物料温度。
1.3.2 核桃粕基本成分的测定
用红外线快速水分测定仪来测定水分含量；灰分参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》进行测定；脂肪含量参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》进行测定；蛋白含量参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定；根据减差法计算出碳水化合物含量，即总碳水化合物含量等于100%减去样品的水分含量、脂肪含量、灰分含量以及蛋白质含量的总和。
1.3.3 核桃粕中蛋白酶活力的测定
1.3.3.1 蛋白酶标准曲线的绘制
以酪氨酸为标准品，根据酪氨酸不同浓度所对应的吸光度值绘制标准曲线，如图1所示。所得标准曲线的回归方程为y=0.0100x-0.003 4，R2=0.99，线性关系良好。
图1 酪氨酸标准曲线
Fig.1 Standard curve of tyrosine
1.3.3.2 蛋白酶活力的计算
根据SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》中的福林法并稍作修改，进行蛋白酶活性的测定与计算。
式中：X为样品蛋白酶活力，U/g；A为样品在波长为660nm时测得的吸光度值；N为样品稀释倍数（稀释10倍）；k为标曲的斜率。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 浸润水量的选择
称取核桃粕100 g，分别用物料质量分数的40%、50%、60%的水量去润料30 min，浸润完成后将核桃粕在2 200 W的功率下蒸煮1 h，测定熟料的水分含量。
1.3.4.2 发酵温度对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
称取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷却后，接入0.025%的米曲霉菌种，分别于28、31、34、37℃的温度下恒温发酵48 h后，测定蛋白酶活力，每个样品做3次平行。
1.3.4.3 发酵时间对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
称取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷却后，接入0.025%的米曲霉菌种，在31℃的条件下恒温发酵 24、34、44、48、52 h后，测定蛋白酶活力，每个样品做3次平行。
1.3.4.4 米曲霉添加量对核桃粕中蛋白酶活力的影响
称取核桃粕100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷却后，分别接入0.005%、0.010%、0.015%、0.025%、0.035%的米曲霉菌种，在31℃的条件下恒温发酵48 h后，测定蛋白酶活力，每个样品做3次平行。
1.3.4.5 通风量对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
称取2份100 g的核桃粕，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷却后接入0.015%的米曲霉菌种，在31℃的条件下恒温培养，其中一份核桃粕在培养过程中通风处理，48 h后测定其蛋白酶活力。
1.3.5 正交试验优选最佳产酶条件
在单因素试验的基础上，分析各因素的适宜水平，选择发酵温度、米曲霉添加量、发酵时间3个因素进行正交试验，以进一步优化米曲霉在核桃粕中发酵的最佳产酶条件。正交试验因素与水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Level of orthogonal test
水平 A发酵温度/℃ B米曲霉添加量/% C发酵时间/h 1 29 0.010 46 2 31 0.015 48 3 33 0.020 50
1.3.6 米曲霉在核桃粕与豆粕中蛋白酶活力的比较
称取核桃粕与豆粕各100 g，在2 200 W的功率下蒸煮1 h，待物料冷却后，按照正交试验得出的最佳产酶条件，对两种物料各自进行发酵处理，测定其蛋白酶活力。
1.4 数据处理与统计
数据统计分析用SPSS 22.0、Excel 2010软件；做图用Origin8.6。试验数据以平均数±标准偏差表示。
2 结果与分析
2.1 核桃粕基本成分分析
利用1.3.2方法对核桃粕的主要成分进行测定，测定结果见表2。
表2 核桃粕基本成分分析
Table 2 Analysis of basic components of walnut meal
项目 水分/% 灰分/% 脂肪/% 蛋白质/% 碳水化合物/%核桃粕 7.65 3.54 25.94 51.36 11.51
由表2可知，核桃粕中的蛋白含量高达51.36%，如果将这部分蛋白合理高效地利用起来，对提高核桃附加价值，促进企业经济效益将具有重大意义。核桃粕脂肪25.94%，碳水化合物11.51%，不仅满足了米曲霉所需的氮源和碳源，而且部分脂肪的氧化为最终产品提供了部分风味物质。
2.2 浸润水量的选择
浸润水量与熟料水分对比见表3。
表3 浸润水量与熟料水分对比
Table 3 Comparison of infiltration water and clinker water
核桃粕原料 浸润水量/% 浸润后物料水分含量/% 熟料水分含量/%原料1 40 36.67 37.42原料2 50 40.00 39.18原料3 60 42.63 43.58
如表3所示，对核桃粕进行不同浸润水量的处理并蒸煮后，所对应的熟料中水分含量相差不大。冷榨核桃蛋白具有良好的吸水性[15]，其通过与水的相互作用而具有结合水的能力，蛋白质的带电基团、亲水基团和非极性基团都可以与水分子紧密结合[16]。在蒸料的过程中，由于高温及水蒸气的作用，使得核桃蛋白发生变性并形成凝胶，吸水性增强[17]。同时也会使经过不同浸润水量处理的物料在蒸煮后，达到基本相近的水分含量。水分对米曲霉产酶的影响主要体现在对米曲霉营养传输途径的保证上，熟料水分保持在40%～50%最为恰当。物料水量过高则会导致其氧气含量降低，过低则营养传递的界面丧失，这样都会使米曲霉的蛋白分泌受到影响[18]。所以本试验采取60%的浸水量进行操作。同时由于沪酿3.024的遗传特性决定了其分泌中性和碱性蛋白酶的能力远比分泌酸性蛋白酶能力强，因此在培养的过程中还是以中性pH值为好（pH=7左右）[19]。因此本试验采用中性自然的无菌水进行浸润。
2.3 发酵温度对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
发酵温度对米曲霉酶活力的影响见图2。
图2 发酵温度对米曲霉酶活力的影响
Fig.2 Effect of ferment temperature on enzyme activity of soy sauce koji
在不同发酵温度下，米曲霉在核桃粕中的所产生的蛋白酶活力不同。米曲霉属于中温菌，在30℃左右的环境下菌落生长最好，过高或过低的温度均会对其产生抑制作用[20]。由图2可知，随着发酵温度的升高，米曲霉分泌酶的能力不断增强，使核桃粕中的蛋白酶活力呈先上升后下降的趋势。当发酵温度为31℃时，核桃粕中的蛋白酶活力（1 254.67 U/g）达到了峰值，说明此时的温度最适合米曲霉在核桃粕中分泌蛋白酶。当发酵温度超过31℃后，米曲霉的活动受到了温度的限制，生成的蛋白酶量开始减少，蛋白酶活力也在大幅度降低[21]。所以初步确定，米曲霉产酶的最佳发酵温度为31℃。
2.4 发酵时间对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
发酵时间对米曲霉蛋白酶活力的影响见图3。
图3 发酵时间对米曲霉酶活力的影响
Fig.3 Effect of ferment time on enzyme activity of soy sauce koji
由图3可知，随着发酵时间的延长，米曲霉利用营养物质不断地生长繁殖，使核桃粕中的蛋白酶活力积累增加，并在48 h时达到最大值，酶活力为1 254.67 U/g[22]。超过48 h之后，米曲霉分解蛋白质产生的氨基酸、多肽等胞外蛋白质开始大量积累，蛋白酶活力出现下降趋势[23]。此时核桃粕中的淀粉酶活性也较高。而淀粉的水解产物葡萄糖等对霉菌产蛋白酶的阻碍作用也会导致蛋白酶活力先增加后减小[24]。所以在核桃粕中，米曲霉产酶的最佳发酵时间为48 h。
2.5 米曲霉添加量对核桃粕中蛋白酶活力的影响
米曲霉添加量对其蛋白酶活力的影响见图4。
图4 米曲霉添加量对米曲霉酶活力的影响
Fig.4 Effect of Aspergillus oryzae addition on enzyme activity of soy sauce koji
由图4可知，随着米曲霉添加量的增加，核桃粕中的蛋白酶活力先升高后降低，当米曲霉添加量为0.015%时，蛋白酶活力达到最大值（1 340.00 U/g），说明此时米曲霉的数量与营养物质恰好达到平衡，产生的蛋白酶最多。当米曲霉添加量大于0.015%时，蛋白酶活力开始下降。从理论上讲，添加量过大可使出发菌体的数量增加，但也会加大原料中可利用营养物质的竞争，使个体菌体的生长状况不佳，影响孢子的成熟，最终影响蛋白酶的诱导产生[18]。所以确定，当米曲霉添加量为0.015%时，核桃粕中的蛋白酶活力最高。
2.6 通风量对米曲霉在核桃粕中蛋白酶活力的影响
按照1.3.4.5的方法，对两种发酵核桃粕进行蛋白酶活力的测定发现，在其他因素相同的条件下，经过通风处理的核桃粕蛋白酶活力为585.00 U/g，而未经通风处理的核桃粕蛋白酶活为858.00 U/g，其氨基酸态氮的含量也明显高于前者。因为本次试验是在实验室中进行，每次试验所选用的物料较少，并且在发酵的过程中采用的是薄层培养，使得米曲霉具有充足的氧气，而通风会过多的带走物料中的水分与热量，使物料水分下降加快，从而影响到米曲霉蛋白酶的分泌。
2.7 正交试验结果与分析
为了获得米曲霉在核桃粕中的最佳产酶条件，在单因素试验的基础上，优选发酵温度、米曲霉添加量、发酵时间这3个因素，探究其对米曲霉在核桃粕中发酵产蛋白酶活力的影响，正交试验设计与结果见表4，方差分析见表5。
表4 L9（34）正交试验设计与结果
Table 4 L9（34）orthogonal test design and results
序号 A发酵温度B米曲霉添加量C发酵时间 D空列 蛋白酶活力/（U/g）1 1 1 1 1 339.20 2 1 2 2 2 505.07 3 1 3 3 3 955.73 4 2 1 2 3 985.60 5 2 2 3 1 1 187.20 6 2 3 1 2 791.47 7 3 1 3 2 282.40 8 3 2 1 3 394.67 9 3 3 2 1 666.13 k1 600.00 535.73 508.45 730.84 k2 988.09 695.65 718.93 526.31 k3 447.73 804.44 808.44 778.67极差R 540.36 268.71 299.99 252.36
表5 方差分析
Table 5 Analysis of variance
注：** 表示差异极显著，P＜0.01。
因素 偏差平方和自由度 均方 F值 P值 显著性A 1 397 346.750 2 698 673.375 36.593 0.000 **B 328 843.994 2 164 421.997 8.612 0.002 **C 426 953.434 2 213 476.717 11.181 0.001 **误差 381 860.741 20 19 093.037
由表4可知，各因素对核桃粕中蛋白酶活力的影响程度依次为A＞C＞B，即发酵温度＞发酵时间＞米曲霉添加量。最优组合为A2B2C3，即发酵温度为31℃、米曲霉添加量为0.015%、发酵时间为50 h，而此最优组合与k值最优A2B3C3进行验证试验作对比发现，A2B2C3所对应的蛋白酶活力为1 187.20 U/g，而A2B3C3所对应的蛋白酶活力为867.00 U/g。因此，选择A2B3C3作为最佳产酶条件。
由表5可知，在所设计的因素范围内，A、B、C的P值均小于0.01，说明发酵温度、米曲霉添加量、发酵时间对核桃粕中蛋白酶活力的大小均有极显著影响。
2.8 米曲霉在核桃粕与豆粕中蛋白酶活力的比较
豆粕也是一种重要的植物性蛋白原料，其蛋白质含量一般为30%～50%，富含氨基酸且必需氨基酸平衡性好[25]。近年来大豆粕在加工利用及其实际应用方面都取得了很大的进展，所以本文按照正交试验中的最佳产酶条件，对核桃粕和豆粕进行发酵处理后，对其中所含的蛋白酶活力进行比较。图5为核桃粕发酵后物料外观，图6为豆粕发酵后物料外观。
图5 28 h和50 h不同时间段核桃粕发酵外观图
Fig.5 Appearance diagram of walnut meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h
a.28 h；b.50 h。
图6 28 h和50 h不同时间段豆粕发酵外观图
Fig.6 Appearance diagram of soybean meal fermentation at different time periods of 28 h and 50 h
a.28 h；b.50 h。
从图5中可以看出，米曲霉在核桃粕中长势良好，在发酵前期，米曲霉以生长白色菌丝为主，随着时间的延长，米曲霉孢子大量繁殖，呈现为明显的黄绿色微小颗粒。最终测得核桃粕中的蛋白酶活力为1 225.40 U/g，豆粕中的蛋白酶活力为434.80 U/g，核桃粕中的蛋白酶活力要明显高于豆粕中的蛋白酶活力。以此说明，与豆粕相比，米曲霉更适宜在核桃粕发酵。
3 结论
核桃粕是一种优质植物蛋白的重要来源，但目前却被用作生产价值低廉且不可食用的饲料和肥料，造成了蛋白资源的极大浪费。所以对核桃粕进行酶解发酵，对促进核桃资源的高效利用具有重大意义。本文通过单因素和正交试验确定了米曲霉在核桃粕中发酵的最佳产酶条件：发酵温度为31℃，米曲霉添加量为0.015%，发酵时间为50 h，这3个因素对核桃粕中蛋白酶活力的大小均有极显著影响。在此最佳条件下培养，菌种表现出的蛋白酶活力为1 187.20 U/g。并且在最优条件下，对核桃粕和豆粕进行发酵处理，对比发现，米曲霉在核桃粕中的蛋白酶活力要明显高于豆粕中的蛋白酶活力。
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