核桃青皮，来源于核桃成熟后剥落的一层厚厚的绿色外皮，属于核桃的加工副产物。其油脂中含有大量不饱和脂肪酸[1]，含有很多对身体有益的油酸和亚油酸[2-3]。有研究指出核桃青皮在食品、医药、农药、色素方面具有重要的使用价值[4]，利用核桃青皮中的活性成分，对研发天然的植物性抗氧化剂具有重要的作用[5]。多酚类物质是天然的抗氧化成分，在一定条件下，其抗氧化能力随着多酚含量的增加而提高[6]。本试验使用甲醇对核桃青皮进行提取，利用不同体积分数的甲醇溶液，获得核桃青皮内的活性成分，并对提取液进行体外抗氧化实验，阐明其抗氧化活性差异，更好地发挥核桃青皮的研究价值和经济价值。
相关研究指出，核桃青皮富含多酚类、萘醌苷类和色素类化合物等功能成分[7-8]。田平平等[9]通过已醇提取核桃青皮，得到了槲皮素-3-O-葡萄糖苷、鞣花和表儿茶素等7种抗氧化活性的主要成分。张卫星等[10]发现用乙酸乙酯和氯仿溶液对核桃青皮进行提取，二者的提取液对DPPH自由基清除能力及还原力很强，表现出与多酚物质或功能组分含量有一定的正相关关系。吕建平等[11]发现当料液比为1∶18（g/mL）时，活性物质中多糖提取率为9.02%，其对羟基自由基清除率低于维生素C，同样，对超氧阴离子自由基清除率也没有维生素C效果好，但均具有一定的清除效果。在核桃青皮的化学成分研究中，甙类物质可以减轻症状、缓解疼痛、提高食欲、助于睡眠，丹宁类物质可用于工业做染色剂和固色剂[4]。醇提取是一种常见的预处理方式，甲醇的分子极性比乙醇分子极性大，所以核桃青皮经甲醇溶液提取后研究其抗氧化活性，为研发天然的抗氧化剂提供了一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃（含青皮，食品级）：市售；硫酸亚铁、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、福林酚、无水乙醇、无水甲醇、铁氰化钾、三（羟甲基）氨基甲烷、三氯化铁、三氯乙酸、无水碳酸钠（均为分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；没食子酸（分析纯）：大茂（天津）化学试剂有限公司；邻苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（均为分析纯）：飞净（福州）生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DK-98-II恒温水浴锅：泰斯特（天津）仪器有限公司；AC 100-240 V磁力搅拌器、MC-4 K型低速离心机：群安（宁波）试验仪器有限公司；FA 214型电子天平（千分之一）：豪晟（上海）科学仪器有限公司；DSA 100-GL 2-4.0 L超声波清洗仪：德森精工有限公司；EPOCH 2酶标仪：伯腾（美国）仪器有限公司；PHS-3 CU pH计：越平（上海）仪器有限公司；101型电热鼓风干燥箱：科伟永兴（北京）仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 核桃青皮提取物的制备
取适量自然晾干的核桃青皮，50℃烘干至恒重后粉碎、过80目筛后，避光保存，备用。称取1 g核桃青皮粉，按料液比1∶10（g/mL）分别加入 0%、20%、40%、60%、80%甲醇，在30℃条件下超声30 min，静置12 h，4 000 r/min，离心10 min后取上清液，即得核桃青皮提取液，避光保存[12]。
1.3.2 多酚含量的测定
参考郑渝川等[13]和张天财等[14]的方法中福林酚比色法测定多酚含量。
1.3.3 核桃青皮提取液抗氧化活性的测定
1.3.3.1 核桃青皮提取液还原力的测定
核桃青皮提取液还原力的测定采用普鲁士蓝法[15]，稍作修改。取50 μL的不同甲醇浓度提取液，分别加入125 μL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液，混匀后，45℃水浴25 min，快速冷却至室温25℃，加入125μL 10%三氯乙酸终止反应。4 000r/min离心10min后，取125μL上清液，加入125μL蒸馏水和25μL0.1%三氯化铁溶液，摇匀，室温25℃放置10 min。在700nm处测吸光度，记为A700 nm，其吸光度反映了还原力的大小。
1.3.3.2 羟基自由基清除率的测定
参照文献[16]的方法，稍作修改。取浓度为9.0mmol/L FeSO4溶液50 μL，加入9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液50 μL，再加入不同甲醇浓度提取液 50 μL，最后加入8.8mmol/LH2O2溶液50μL，摇匀后在37℃反应30min，在波长510 nm处测定吸光度A1，按照上述相同方法，使用蒸馏水替代样品溶液，测定A0，使用蒸馏水替代过氧化氢，测定A2。由公式（1）计算出羟基自由基清除率。
式中：A0为空白溶液吸光度；A1为加入样品后的吸光度；A2为不加显色剂的吸光度。
1.3.3.3 DPPH自由基清除能力的测定
参考文献[12，17-18]的方法，稍作修改。将不同样品稀释为1 mg/mL，取50 μL 1 mg/mL不同样品溶液和50 μL 0.1 mmol/LDPPH溶液，混匀后在室温25℃下避光静置30 min，用酶标仪在517 nm处测定吸光度（A）。每个样品重复测定3次，结果取平均值。由公式（2）计算出DPPH自由基清除率。
式中：A1为加入提取液后DPPH的吸光度；A2为同等量的无水乙醇代替DPPH溶液后的吸光度；A3为DPPH溶液的吸光度。
1.3.3.4 超氧阴离子自由基清除率的测定
参考文献[19-20]方法稍作修改。依次向试管中加入50 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 值为8.2）225 μL，在25℃的水浴锅中保温20 min，加入50 μL样品溶液，再加入25 mmol/L邻苯三酚溶液20 μL，快速混匀，放入25℃的水浴锅中5 min，立即加入8 mol/L盐酸溶液50 μL终止反应。在325 nm处测定吸光度A1。用去离子水代替邻苯三酚，测定A2，用去离子水代替样品溶液做空白参照，测定A3。由公式（3）计算得出超氧阴离子自由基清除率。
式中：A1为加入邻苯三酚溶液后的吸光度；A2为加入离子水后的吸光度；A3为空白溶液吸光度。
1.4 数据处理和统计学分析
数据采用Origin9.1软件进行计算绘图。采用SPSS 19.0软件进行显著性分析。数据以平均值±标准差表示，p＜0.05为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 多酚含量的测定
不同甲醇浓度提取液对多酚含量的影响如图1所示。
图1 不同甲醇浓度提取液中多酚含量
Fig.1 Polyphenol content in extracts under different methanol concentrations
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图 1可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇提取液中多酚浓度分别为88.692、95.801、70.866、64.633、46.697 μg/mL，且随着浓度升高有显著性差异。当甲醇浓度为0%～20%时，提取液中多酚含量逐渐增加，20%甲醇提取效果最好，多酚含量最高，继续增加甲醇浓度后，提取液中多酚含量逐渐下降，80%甲醇提取效果最差，多酚含量最低。因此，当采用20%甲醇进行提取时，得到的提取液多酚含量最高。
2.2 不同甲醇浓度提取液对抗氧化活性的影响
2.2.1 不同甲醇浓度提取液对还原力的影响
不同甲醇浓度的提取液的还原力大小如图2所示。
图2 不同甲醇浓度提取液的还原力比较
Fig.2 Comparison of reducing power of extracts under different methanol concentrations
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图 2可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇浓度提取液的还原力分别为0.692、0.678、0.524、0.524、0.515。利用不同甲醇浓度溶液对核桃青皮进行提取，随着甲醇溶剂浓度的增加，提取液的还原力逐渐下降，其中0%与20%的甲醇提取液还原力相比无显著性差异，40%、60%和80%甲醇提取液的还原力相互之间无显著性差异。以0%的甲醇提取液还原力最高。
2.2.2 不同甲醇浓度提取液对羟基自由基的清除率的影响
不同甲醇浓度提取液对羟基自由基清除率的影响如图3所示。
图3 不同甲醇浓度提取液的羟基自由基清除率比较
Fig.3 Comparison of OH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图 3可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇浓度提取液的羟基自由基清除率分别为59.09%、61.18%、59.37%、53.93%、41.33%。随着甲醇溶剂浓度的增加，提取液的羟基自由基清除率先上升后下降。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羟基自由基清除率相互之间无显著性差异，但是与80%甲醇提取液相比均有显著性差异。以20%甲醇提取液的羟基自由基清除率最高。
2.2.3 不同甲醇浓度提取液对DPPH自由基清除率的影响
不同甲醇浓度的提取液对DPPH自由基清除率的影响如图4所示。
图4 不同甲醇浓度提取液的DPPH自由基清除率比较
Fig.4 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图4可知，不同甲醇浓度提取液的DPPH自由基的清除率分别为72.26%、96.18%、86.01%、87.28%、91.35%。其中0%与20%和80%甲醇提取液的羟基自由基清除率有显著性差异，但40%与60%甲醇提取液与其他组相比均不具有显著性差异。20%甲醇提取液对DPPH自由基的清除效果最好；DPPH自由基的清除率最低的是0%甲醇提取液。
2.2.4 不同甲醇浓度提取液对超氧阴离子自由基的清除率的影响
不同甲醇浓度提取液对超氧阴离子自由基清除率的影响如图5所示。
由图 5可知，0%、20%、40%、60%、80%甲醇浓度提取液的超氧阴离子自由基清除率分别为43.27%、46.06%、47.39%、46.67%、24.85%。当甲醇浓度为0%～40%时，提取液的超氧阴离子自由基清除率逐渐增加，40%甲醇提取液的清除率最高；继续增加甲醇浓度后，提取液的超氧阴离子自由基清除率逐渐下降，80%甲醇提取液的清除率最低。其中0%、20%、40%和60%甲醇提取液的羟基自由基清除率相互之间无显著性差异，但是与80%甲醇提取液相比均有显著性差异。以40%的甲醇提取液的超氧阴离子自由基清除率最高。
图5 不同甲醇浓度提取液的超氧阴离子自由基清除率比较
Fig.5 Comparison of O2-free radical scavenging rates of extracts under different methanol concentrations
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
3 结论
以核桃青皮为原料，采用不同甲醇浓度进行提取，测定了多酚含量、羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除率、还原力等抗氧化活性指标，最终阐明不同甲醇浓度提取液抗氧化活性间的差异。经研究得出，核桃青皮以20%甲醇为提取剂时多酚浓度最高，而80%甲醇提取剂多酚浓度最低。核桃青皮提取液的羟基自由基清除能力与提取液中的多酚含量相关，以20%甲醇溶液提取效果最好。随着甲醇溶剂浓度的增加，提取液的还原力逐渐下降，其还原力与提取溶剂浓度成负相关，以0%甲醇提取的还原力最高。而DPPH自由基清除能力和甲醇浓度无线性关系，不同甲醇浓度提取液中以20%甲醇提取对DPPH清除能力最高，不同浓度提取液中40%甲醇提取对超氧阴离子自由基清除能力最高。由此得出结论，20%甲醇提取液抗氧化活性最佳。
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