辣木籽（Moringa oleifera seed）是辣木中的可食用部分之一，蛋白质及脂质含量占比高，具有较高的营养价值[1]，含有多种活性成分，如黄酮类、皂苷类、多糖类等[2-4]。辣木籽的活性成分之一异硫氰酸酯，是一类广泛存在于十字花科植物中的天然活性物质，具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护、组织保护等活性[5-8]，辣木籽异硫氰酸酯的糖苷配基部分中有一个额外的鼠李糖结构，相较其他十字花科中的异硫氰酸酯[9-11]，具有相对高的稳定性。但相比其他活性物质，辣木籽提取出的异硫氰酸酯类化合物在常温及光照条件下易降解[12-14]，导致该活性物质的生物利用率普遍较低。为保护辣木籽异硫氰酸酯的生物活性，提高其生物利用率，本文采用柔性脂质体技术包裹辣木籽异硫氰酸酯，制备辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体，以期为植物提取活性成分柔性脂质体的制备提供方向，提高天然活性成分的生物利用率，同时为辣木的高值化利用提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
辣木籽异硫氰酸酯：云南农业大学云南省生物大数据重点实验室自制；大豆卵磷脂：阿伟拓（上海）医药科技有限公司；胆固醇、胆酸钠、甲醇（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三氯甲烷（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
CR-100S超声清洗仪：深圳市春霖清洗设备有限公司；A360型紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；YRE-2000E旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；THZ-300摇床：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的制备方法
采用薄膜分散法制备辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体。将卵磷脂、胆固醇、胆酸钠溶于甲醇和三氯甲烷（1∶1，体积比）的混合液，使用超声清洗仪超声助溶，待溶解完全，转移至圆底烧瓶，于37℃真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂形成磷脂薄膜。
将异硫氰酸酯-二氯甲烷（0.5 mmol/L）溶液加入到含有磷脂薄膜的圆底烧瓶，置于摇床中，25℃避光条件下，用10 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH7.5）水化 12 h，得到异硫氰酸酯粗柔性脂质体悬浊液。将异硫氰酸酯粗柔性脂质体悬浊液再次旋转蒸发（25℃）除去二氯甲烷，超声清洗仪超声使辣木籽异硫氰酸酯在柔性脂质体悬浮液中均匀分布，最后置于4℃避光保存。
1.3.2 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率测定
1.3.2.1 辣木籽异硫氰酸酯标准曲线的建立
精确称取辣木籽异硫氰酸酯311 mg，放入容量瓶中用二氯甲烷定容到100 mL，得到质量浓度为10 mmol/L的异硫氰酸酯溶液。之后再分别梯度稀释成 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.550 mmol/L的标准溶液，以二氯甲烷为空白对照，于236 nm处测量其吸光度，得到标准曲线A=5.088 6C+0.032 7，R2=0.999。
1.3.2.2 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的计算
辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率采用低温超速离心法计算。将柔性脂质体用PBS稀释3倍后，加入1.5 mL离心管中，按照柔性脂质体稀释液∶甲醇=1∶2（体积比）加入甲醇，旋涡振荡1 min，再超声5 min，4℃下以15000 r/min离心30 min，离心结束后精密移取上清液1 mL检测上清液的吸光度，再根据标准曲线方程计算异硫氰酸酯的浓度C。包封率（entrapment efficiency，EE）的计算公式如下。
式中：C总为加入异硫氰酸酯的浓度，mmol/L；C游为上清液中异硫氰酸酯的浓度，mmol/L。
1.3.3 单因素试验
按照1.3.1的制备方法，选取卵磷脂与胆固醇质量比（2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、卵磷脂与胆酸钠质量比（2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、超声时间（2、4、6、8、10、12 min）3 个因素进行单因素试验，探究各因素对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响，每个因素平行试验3次，取平均值。
1.3.4 Box-Behnken响应面法优化辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体制备工艺
在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken试验设计方法，以包封率为响应值，进行响应曲面试验设计，其因素与水平设计见表1。
表1 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体Box-Behnken试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of box-behnken test for liposomes of isothiocyanate in Moringa oleifera seeds
水平 A卵磷脂与胆固醇质量比B卵磷脂与胆酸钠质量比C超声时间/min-1 8∶1 8∶1 6 0 10∶1 10∶1 8 1 12∶1 12∶1 10
1.3.5 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的形态表征
1.3.5.1 粒径分布及Zeta电位
取辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体1 mL，用蒸馏水稀释至10 mL，适当超声处理以防止微粒聚集影响测定结果，样品测定前在25℃平衡2 min，采用粒径分析仪测定柔性脂质体的粒径分布、多分散性系数（polydispersity index，PDI）及Zeta电位。
1.3.5.2 透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察
取一滴辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体样品滴在200目铜网上，室温（25℃）下自然风干除去水分后置于透射电子显微镜下观察。
1.3.6 体外释放率测定
以PBS（pH7.5）作为释放介质，精密量取辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体溶液10 mL至透析袋，将透析袋封口后置于40 mL的PBS中，室温（25℃）下搅拌。分别于0、2、4、6、8……48 h每隔2 h取出4 mL释放介质PBS，并补充相同体积的PBS，于236 nm处检测辣木籽异硫氰酸酯的含量，每组试验重复3次。体外释放率计算公式如下。
式中：W1为异硫氰酸酯的释放浓度，mmol/L；W0为柔性脂质体中异硫氰酸酯的总浓度，mmol/L。
1.4 数据处理
试验指标的测定均重复3次，结果取平均值，数据采用Graphpad Prism5和Design Expert 8.0.6进行分析和绘制。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 卵磷脂和胆固醇质量比的考察
卵磷脂与胆固醇质量比对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响见图1。
图1 卵磷脂与胆固醇质量比对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响
Fig.1 Effect of lecithin and cholesterol mass ratio on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome
如图1所示，随着卵磷脂质量增加，胆固醇质量的减少，辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率总体呈逐渐增加的趋势。当卵磷脂与胆固醇的质量比超过10∶1时，辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率急剧减小。出现该结果的原因可能是胆固醇具有使柔性脂质体保持稳定，调节磷脂双分子层柔韧性，使膜通透性降低，从而减少辣木籽异硫氰酸酯渗漏的作用[15]。在试验中，当使用的卵磷脂与胆固醇质量比为2∶1时，胆固醇添加量超过膜负荷，因此包封率并不高；但随着卵磷脂与胆固醇质量比增大，柔性脂质体体系稳定性发生改变，导致辣木籽异硫氰酸酯泄露。综上所述，卵磷脂与胆固醇质量比应在10∶1附近较为合适。
2.1.2 卵磷脂与胆酸钠质量比的考察
卵磷脂与胆酸钠质量比对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响见图2。
如图2所示，随着卵磷脂与胆酸钠质量比的增加，辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率逐渐变大，当质量比为10∶1时辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的包封率最大；当卵磷脂与胆酸钠质量比继续增大时，包封率则骤然减小。导致该结果的原因是胆酸钠可以加强柔性脂质体的柔性，是柔性脂质体制备中的柔软剂，同时它也能降低柔性脂质体的粒径。当卵磷脂与胆酸钠的质量比达到阈值之后，过量的胆酸钠使柔性脂质体变形，粒径过小，从而使辣木籽异硫氰酸酯渗漏[16-17]，随着胆酸钠质量的减少，包封率逐渐变大，但当胆酸钠质量太小时，柔性脂质体的包封率受到较严重的影响，包封率随之大幅降低。由此可知，卵磷脂与胆酸钠质量比10∶1为辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体制备的最佳单因素条件。
图2 卵磷脂与胆酸钠质量比对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响
Fig.2 Effect of lecithin and sodium cholate mass ratio on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome
2.1.3 超声时间的考察
超声时间对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响见图3。
图3 超声时间对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的影响
Fig.3 Effect of ultrasound time on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome
由图3可知，随着超声时间的延长，柔性脂质体包封率呈先下降后上升再下降的趋势，当超声时间8 min时，柔性脂质体包封率最大；超声时间8 min之后，随着超声时间的延长，柔性脂质体包封率反而减小。出现该结果可能是因为适当的超声可以使团聚的柔性脂质体粒子逐渐分开，从而更好地包裹辣木籽异硫氰酸酯，但是过长时间的超声，导致柔性脂质体粒子被过度振荡而碎裂[18-19]；同时，随着超声时间的延长，溶液体系温度升高，柔性脂质体体系稳定性减小，从而发生渗漏。因此，最佳的超声时间在8 min左右。
2.2 响应曲面法优化辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率
辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的Box-Behnken试验方案与结果见表2。
表2 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率Box-Behnken试验方案与结果
Table 2 Experimental scheme and results of box-behnken Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency
编号 A卵磷脂与胆固醇质量比B卵磷脂与胆酸钠质量比 C超声时间 包封率/%1 1 53.19 2 1 1 1 57.72 1 1 3 1 57.19 4-1 -1 -1 52.14 5 1 1 1 57.46 1 1 6 0 59.60 7-1 -1 -1 56.93 8 0 0 0 61.66 0 0-1 -1 -1 57.36 10 1 1 1 55.61 11 -1 -1 -1 58.31 12 1 1 1 52.14 13 -1 -1 -1 57.22 14 0 0 0 57.75 15 1 1 1 62.07 16 0 0 0 58.41 17 0 0 0 62.04 9
利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合，得到辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率对卵磷脂与胆固醇质量比、卵磷脂与胆酸钠质量比、超声时间的二次多项回归模型为Y=61.32-0.28A+0.49B-0.55C+0.082AB-1.26AC-0.21BC-2.36A2-1.60B2-2.35C2，R2=0.914。对回归方程系数进行显著性检验见表3。
表3 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的方差分析
Table 3 Variance analysis of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency
项目 平方和自由度 均方 F值 P值模型 132.46 9 14.72 8.28 0.005 4**A 0.72 1 0.72 0.40 0.544 9 B 2.01 1 2.01 1.13 0.322 6 C 2.00 1 2.00 1.12 0.324 5 AB 0.039 1 0.039 0.022 0.886 0 AC 8.41 1 8.41 4.73 0.066 1 BC 0.20 1 0.20 0.11 0.748 8 A2 15.02 1 15.02 8.45 0.022 8*
续表3 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率的方差分析
Continue table 3 Variance analysis of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
项目 平方和自由度 均方 F值 P值B2 7.83 1 7.83 4.40 0.074 0 C2 20.03 1 20.03 11.26 0.012 2*残差 12.45 7 1.78失拟项 8.30 3 2.77 2.66 0.183 8纯误差 4.15 4 1.04总和144.91 16
由表3可知，整体模型为极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明方程和试验拟合较好，可以对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体工艺进行预测。各因素对辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体包封率影响的排序为卵磷脂与胆酸钠质量比（B）＞超声时间（C）＞卵磷脂与胆固醇质量比（A）。图4～图6是根据回归方程所做出的响应曲面和等高线图，等高线及响应面图能够反映出各因素之间的交互作用以及各因素和响应值之间的关系，等高线呈圆形表示两因素间的交互影响作用不显著[20-21]。
图4 卵磷脂与胆固醇质量比和卵磷脂与胆酸钠质量比对柔性脂质体包封率影响的响应面和等高线图
Fig.4 Response surface and contour diagram of the effect of lecithin-cholesterol mass ratio and lecithin-cholate mass ratio on liposome encapsulation efficiency
图5 卵磷脂与胆固醇质量比和超声时间对柔性脂质体包封率影响的响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour diagram of the effect of lecithin-cholesterol mass ratio and ultrasound time on liposome encapsulation efficiency
图6 卵磷脂与胆酸钠质量比和超声时间对柔性脂质体包封率影响的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface and contour diagram of the influence of the mass ratio of lecithin-cholate and the ultrasound time on liposome encapsulation efficiency
由图4可知，当卵磷脂与胆固醇质量比一定时，柔性脂质体包封率受卵磷脂与胆酸钠质量比的影响不大，随着卵磷脂与胆酸钠质量比的增大，柔性脂质体包封率先增大后有所下降；而当卵磷脂与胆酸钠质量比一定时，卵磷脂与胆固醇质量比对柔性脂质体包封率影响较大，包封率随着卵磷脂与胆固醇质量比的增大先增大后减小。
由图5可知，当卵磷脂与胆固醇质量比一定时，柔性脂质体包封率受超声时间的影响不大，随着超声时间的延长，柔性脂质体包封率先增大后有所下降；当超声时间一定时，卵磷脂与胆固醇质量比对柔性脂质体包封率影响也不大。
由图6的响应面可知，在卵磷脂与胆酸钠质量比为10∶1，超声时间为8 min时，柔性脂质体的包封率可达到达到最大。从等高线图可以看出，超声时间轴向的等高线密集，说明超声时间对柔性脂质体包封率影响较大，而卵磷脂与胆酸钠质量比轴向的等高线相对稀疏，说明卵磷脂与胆酸钠质量比对柔性脂质体包封率的影响较小。
2.3 模型验证
通过软件对模型进行分析，柔性脂质体的最佳制备工艺条件为卵磷脂与胆固醇质量比9.95∶1、卵磷脂与胆酸钠质量比10.32∶1、超声时间7.78 min。此条件下，柔性脂质体理论包封率为61.398 4%。
经过3次平行试验，测得平均包封率为（64.17±2.19）%，与理论预测值相差2.78%，小于3%。表明采用响应面法优化得到的异硫氰酸酯柔性脂质体工艺可靠，具有一定应用价值。
2.4 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的形态表征
2.4.1 粒径分布及Zeta电位
图7为辣木异硫氰酸酯柔性脂质体的粒径分布和Zeta电位图。
图7 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的粒径分布和Zeta电位
Fig.7 Size distribution and Zeta potential of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes
图7结果显示，辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的平均纳米粒径为348 nm，多分散系数PDI为0.251，表明响应面优化后得到的辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体粒径分散较为均一；Zeta电位图显示，该柔性脂质体Zeta电位为-24.7 mV，表示该柔性脂质体带负电，且体系较为稳定。
2.4.2 透射电子显微镜观察
图8为辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的透射电镜图。
图8 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的透射电镜图
Fig.8 Transmission electron micrograph of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes
图8结果显示，包裹辣木籽异硫氰酸酯的柔性脂质体边界清晰，为较圆整规则圆形，大部分柔性脂质体呈分散状态，但有小部分柔性脂质体聚集。
2.5 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的体外释放率
辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的体外释放率如图9所示。
图9 辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的体外释放情况
Fig.9 The cumulative release of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes
根据辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的体外释放曲线可以看出，在释放开始的前12 h～14 h，异硫氰酸酯出现爆发式释放，之后释放速度减慢，在48 h内，累积释放率达到80.105%左右，之后由于脱离柔性脂质体包裹后的异硫氰酸酯在自然环境下不稳定，因此释放率在80%附近波动。这表明将辣木籽异硫氰酸酯做成柔性脂质体之后，可以对辣木籽异硫氰酸酯的释放得到一定的控制，达到辣木籽异硫氰酸酯的缓释作用。
3 结论
本试验利用薄膜分散法制备脂溶性辣木籽异硫氰酸酯的柔性脂质体，通过Box-Behnken响应面法优化出辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的最佳制备工艺条件为卵磷脂与胆固醇质量比9.95∶1、卵磷脂与胆酸钠质量比10.32∶1、超声时间7.78 min，该条件下异硫氰酸酯脂质体的包封率为64.17%，模型方程高度显著，拟合性良好。辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体的粒径为348 nm，多分散系数为0.251，Zeta电位为-24.7 mV，其形态分布较为均匀。该柔性脂质体累积释放率在0～14 h内出现爆发式释放，之后释放率保持在80.105%左右，辣木籽异硫氰酸酯柔性脂质体具有缓释的效果。本研究将为植物提取活性成分柔性脂质体的制备提供依据，同时为各行业提供生物利用率高的新剂型奠定基础。
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