亚麻籽饼粕是亚麻籽加工制油的主要副产物，亚麻籽饼粕中的粗蛋白含量达30%以上，脂肪含量在6.5%以上，粗制膳食纤维含量约为26%，碳水化合物含量为6.5%。除此之外，亚麻籽饼粕中分离出有价值的营养成分，这些活性物质以及不饱和脂肪酸有多种保健功能。Xia等[1]的研究表明添加研磨亚麻籽的饮食通过降低TLR4/NF-κB通路的基因表达和改变链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠的肠道微生物群来改善肝脏炎症。Parikh等[2]的研究表明膳食亚麻籽对心肌梗死后室性心律失常和左室扩张有保护作用。除此之外，亚麻籽还具有降血脂、降胆固醇[3]、抗氧化[4]、提高免疫力[5]、抗癌[6-7]和减肥[8]等多种功效。根据国内外研究表明，很多研究者利用酶水解技术对废渣副产物进行高值化、生态化利用，特别是功能多肽的制备，其中活性肽在体外具有黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抑制活性，在体内具有降尿酸的活性[9]。酶法水解反应过程比较温和，反应用时短且得率高，不会破坏氨基酸结构，且纯度较高，能较好地保留酶解产物的营养价值[10]。酶法水解亚麻籽饼粕制备的多肽耐受性良好，可以稳定存在于强酸和高温中而不被破坏。
本试验以副产物亚麻籽粕废渣为研究对象，使用不同蛋白酶制备酶解产物，比较不同酶解产物的黄嘌呤氧化酶抑制活性以及抗氧化活性，为亚麻籽粕蛋白质功能活性肽的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
亚麻籽、生榨饼粕、熟榨饼粕：宁夏索米亚生态农业科技有限公司；风味蛋白酶（152 000 U/g）、复合蛋白酶（421 800 U/g）、水解蛋白酶（11 436 U/g）、中性蛋白酶（256 900 U/g）、复合蛋白酶粉末（21 809 U/g）、风味蛋白酶粉末（70 213 U/g）、木瓜蛋白酶（256 915 U/g）、碱性蛋白酶（460 638 U/g）：天津慧智百川生物技术有限公司；黄嘌呤氧化酶（100 U/mg）、别嘌呤醇、C2HCl3O2、K2SO4、CuSO4：天津市裕达科技发展有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（752）：天津市拓普仪器有限公司；台式高速离心机（TGL-16C）：湖南星科科学仪器有限公司；数显pH计（FE20）：北京汇中顺成科技有限责任公司；摇床（SKY-2102）：苏坤实业有限公司；电热恒温培养箱（WDP-9062）：上海安亭科学仪器有限公司；数显鼓风干燥箱（GZX-9030MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；半自动凯氏定氮仪（K9840）：山东海能科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（LC-20AT）：日本岛津有限公司；恒温振荡水浴锅（HH-S4）：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；快速冷冻干燥机（Alpha2-4LDpLus型）：德国Chirst公司。
1.2 试验方法
1.2.1 检测指标及方法
蛋白质含量测定：参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的方法，采用凯氏定氮法测定[11]。
脂肪的测定：参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的方法，采用索氏抽提法测定[12]。
灰分的测定：参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[13]中的方法。
粗纤维的测定：参考GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》[14]中的方法。
总糖的测定：参考DB12/T 847—2018《饲料中总糖的测定分光光度法》[15]中的方法。
游离脂肪酸的测定：参考NY/T 1797—2009《油菜籽中游离脂肪酸的测定滴定法》[16]中的方法。
多酚的测定：参考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》[17]中的方法。
碳水化合物的测定：参考GB 28050—2011《食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》[18]中的方法计算。
1.2.2 亚麻籽多肽制备工艺
亚麻籽饼粕→粉碎过滤→过60目筛→调料液→胶体研磨→调pH值→酶解→离心→取上清液→冷冻干燥→粗多肽粉
1.2.3 酶解亚麻籽饼粕制备多肽
粉碎亚麻籽饼粕并去除其中杂质，称取一定量亚麻籽饼粕，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸馏水制成悬浮液，并分别调节复合蛋白酶粉末pH 6.0、风味蛋白酶粉末pH 6.0、中性蛋白酶pH 7.0、水解蛋白酶pH 9.0、复合蛋白酶（液体）pH 6.0、风味蛋白酶（液体）pH 6.0、木瓜蛋白酶pH 6.0、碱性蛋白酶pH 9.0，按照酶活2 000 U/g分别加入风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等8种蛋白酶，将反应温度与溶液的pH值调至每种蛋白酶的最适温度与pH值，在恒温振荡水浴锅酶解5 h，酶解结束后立即用100℃水浴灭酶 15 min，冷却至室温（25℃），5 000 r/min转速离心10 min提取多肽，离心沉淀，膜过滤提纯，-80℃冷冻干燥，用冻干机冻干，备用。
1.2.4 多肽含量的测定
参考 GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》[19]，利用三氯乙酸沉淀蛋白并结合凯氏定氮法测定酶解产物中的多肽含量。
1.2.5 多肽得率的测定
多肽得率计算公式如下。
式中：m1为亚麻籽粗多肽质量，g；m2为亚麻籽饼粕质量，g。
1.2.6 黄嘌呤氧化酶抑制活性测定
参考文献[20-21]中的方法，将200 μL样品依次加入10mL离心管中，与50 μL 0.03 U/mL黄嘌呤氧化酶溶液混匀，37℃下温浴10 min。加入400 μL 0.42 mmol/L黄嘌呤溶液，2 800 μL Tris-HCl缓冲液启动反应，37℃下保温20 min，加150 μL 1 mol/L HCl终止反应。使用去离子水代替样品做空白试验。别嘌呤醇（20 mmol/L和60 mmol/L）做阳性对照。过0.22 μm有机滤膜过滤反应液后进行高效液相检测，进样量为20 μL。
色谱条件为色谱柱：Shim pack C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：95%15 mmol/L NH4H2PO4+5%色谱级甲醇（pH6.5）；检测波长：290 nm；流速：1 mL/min；柱温：25℃。
使用不同浓度的尿酸标准溶液建立标准曲线。黄嘌呤氧化酶抑制率计算公式如下。
式中：X1为试验组尿酸含量，μmol/mL；X2为对照组尿酸含量，μmol/mL。
1.2.7 体外抗氧化活性测定
1.2.7.1 ABTS+自由基清除率测定
参考文献[22-23]的方法进行测定。配制7 mmol/L ABTS+母液及2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，使用前以1∶1的体积比混合，避光放置16 h后，用pH 7.4、浓度5 mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释ABTS+溶液，使其在734 nm处的吸光度为0.70±0.02。将ABTS+溶液与样品等体积混合，室温（25℃）反应10 min后，在734 nm下测定吸光度A1。空白组用蒸馏水代替样品，吸光度记为A0。以维生素C（1 mg/mL）作为对照。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
1.2.7.2 羟基自由基清除率测定
参考文献[24-25]的方法进行测定。将1 mL样品与0.3 mL FeSO4（8 mmol/L）、1 mL水杨酸（3 mmol/L）及1 mL H2O2（3%）混匀，37℃保温30 min，冷却至室温（25℃）后，加入0.7mL蒸馏水使反应液总体积达4 mL，5 000 r/min离心10 min，510 nm波长下测定吸光度A1，用蒸馏水代替样品作为空白对照，吸光度记为A0。以维生素C（1 mg/mL）作为对照。羟基自由基清除率计算公式如下。
1.2.8 单因素试验
探究料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、酶解pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g）、酶解温度（40、45、50、55、60 °C）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）对多肽得率的影响及对黄嘌呤氧化酶的抑制活性的影响。
1.2.9 Plackett-Burman（PB）试验设计
根据单因素试验结果，选用试验次数为12的PB试验设计，对酶解过程中影响多肽得率的5个因素（A料液比、B酶解pH值、C酶添加量、D酶解温度、E酶解时间）进行研究，以多肽得率为响应值。编码和水平因素如表1所示。
表1 Plackett-Burman试验水平及编码
Table 1 Plackett-Burman experiment test standard and code
水平因素A料液比/（g/mL）B酶解pH值C酶添加量/（U/g）D酶解温度/℃E酶解时间/h-1 1∶18 9.5 3 800 45 4.5 0 1∶20 10.0 4 000 50 5.0 1 1∶22 10.5 4 200 55 5.5
1.2.10 最陡爬坡试验
在PB试验结果的基础上设计最陡爬坡试验，按一定的梯度增加C酶添加量、D酶解温度和E酶解时间的梯度，其余2个均取单因素最佳值，测定多肽得率，从而确定这3个因素的最佳条件。
1.2.11 响应面优化试验
依据前期试验结果，确定了酶添加量、酶解时间、酶解温度为试验因素。通过Box-Behnken设计，以多肽得率为响应值，进行中心组合设计试验，各因素水平及编码值如表2所示。
表2 响应面分析因素与水平
Table 2 Response surface analysis factor and level
水平 因素F酶添加量/（U/g）G酶解时间/hH酶解温度/℃-1 3 000 4 45 0 4 000 5 50 1 5 000 6 55
1.3 数据处理
每组试验重复3次，使用Design-Expert V8.0.6进行响应面设计及统计分析，采用Origin 9.0进行数据处理并作图。
2 结果与分析
2.1 亚麻籽饼粕营养成分
亚麻籽饼粕营养成分的检测结果见表3。
表3 亚麻籽饼粕中的基本营养成分的测定
Table 3 Determination of basic nutrients in flaxseed cake
项目蛋白质/%灰分/%粗纤维/%总糖/%游离脂肪酸/%脂肪/%碳水化合物/%多酚/（mg/g）亚麻籽 31.94 2.30 26.06 14.52 1.21 8.35 6.80 11.08生榨饼粕 31.45 5.35 26.50 12.80 1.11 7.41 7.60 4.00熟榨饼粕 32.31 5.20 30.00 14.24 1.20 6.84 6.50 4.90营养参考值 30.00～39.00 6.00 28.00 20.00 1.50 9.50 10.00 19.00～30.00
由表3可知，亚麻籽饼粕中营养物质含量丰富，本文采用熟榨饼粕，熟榨饼粕蛋白质含量较高为32.31%，粗纤维含量30.00%，灰分含量5.20%，总糖14.24%，游离脂肪酸1.20%，是优质的蛋白质来源。此外，亚麻籽饼粕还含有多酚、木酚素等抗氧化物质，其中多酚含量4.90 mg/g。研究表明，亚麻籽及其饼粕的基本成分、营养价值与大豆粕相比，其氨基酸组成与大豆相似，缺乏赖氨酸、蛋氨酸，富含色氨酸。亚麻籽饼粕是可以进行开发的丰富蛋白质资源，是优质植物蛋白。
2.2 不同蛋白酶酶解效果的影响
不同蛋白酶酶解亚麻籽饼粕结果见图1。
由图1可知，在酶添加量为2 000 U/g、酶解时间5 h条件下，碱性蛋白酶酶解亚麻籽饼粕的多肽得率较高，水解效果较好。风味蛋白酶粉末在8种酶中显示出最弱的水解能力，其酶解多肽得率最低。在酶解反应中，蛋白质之间的一些相互作用被破坏，影响功能特性[26]，所以不同酶解反应黄嘌呤氧化酶抑制活性也不同，复合蛋白酶粉末和碱性蛋白酶的酶解反应后多肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性较好，综合考虑选用碱性蛋白酶作为最优酶。
图1 不同蛋白酶对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.1 Effects of different proteases on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase
*表示蛋白酶粉末。
2.3 不同蛋白酶对多肽的抗氧化活性的影响
亚麻籽多肽的抗氧化活性试验结果见图2。
由图2可知，不同种类的蛋白酶酶解所得多肽的自由基清除率虽存在区别，但均在80%以上，其中碱性蛋白酶酶解物的自由基清除率最高。由此推断，多肽得率与抗氧化活性呈正相关。与任佰萍等[27]的研究结果一致。
图2 不同蛋白酶对多肽抗氧化活性的影响
Fig.2 The effect of different proteases on antioxidant activity
*表示蛋白酶粉末。
2.4 酶解工艺的优化
2.4.1 酶添加量对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
酶添加量对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响见图3。
图3 酶添加量对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.3 The effect of the amount of enzyme added on the peptide yield and xanthine oxidase inhibitory activity
由图3可知，随着酶添加量的增加，多肽得率先呈上升趋势。当酶添加量4 000U/g时多肽得率最高，此时亚麻籽多肽得率达到67.46%。随着酶添加量的增加，亚麻籽多肽的水解度不再增加，呈平稳趋势。酶添加量达到底物与酶作用的饱和时，水解达到饱和，多肽得率不再增加。亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性几乎相差不大，因此确定最适酶添加量为4 000 U/g。
2.4.2 酶解时间对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
酶解时间对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响见图4。
图4 酶解时间对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.4 The effect of different enzymatic hydrolysis time on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase
随着酶解时间的延长，多肽得率呈现先升高后降低的趋势。亚麻籽多肽的形成需要一定的时间，随着时间的延长，小分子多肽逐渐增加。酶解时间为5 h时，多肽得率为70.16%，酶解效果达到峰值。酶解时间继续延长，多肽含量并未增加，是因为随着反应时间进一步延长，溶液中底物浓度达到饱和，反应速度下降。亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性随着酶解时间的延长呈先增加后降低趋势，酶解5 h时，亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性为62.04%，与其他时间抑制活性相差不大。因此确定最适酶解时间为5 h。
2.4.3 酶解温度对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
酶解温度对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响见图5。
图5 酶解温度对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.5 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase
由图5可知，随着酶解温度的逐渐升高，亚麻籽饼粕酶解多肽得率呈上升趋势，亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性波动变化。在50℃时，多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性达到最大。继续升高温度，蛋白逐渐发生变性，导致蛋白酶活力逐渐降低，多肽得率呈下降趋势。因此确定最佳酶解温度为50℃。
2.4.4 碱性蛋白酶酶解pH值对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
酶解pH值对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响见图6。
图6 酶解pH值对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.6 The effect of different pH on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase
由图6可知，随着酶解pH值的增加，多肽得率逐渐增加；当pH值达到10.5时，多肽得率为62.20%，亚麻籽多肽得率达到最大。在pH 8.0～10.0条件下，多肽得率变化不大，但是黄嘌呤氧化酶抑制活性波动变化，可能是由于pH值不同改变了酶与底物的带电状态，影响了酶解反应。当pH值增大或者减小时，影响亚麻籽蛋白分子酶切位点与蛋白酶活性，破坏了酶与亚麻籽蛋白最适宜的酶解空间结构[28]，黄嘌呤氧化酶抑制活性降低。因此确定最适pH值为10.5。当pH值为11时，由于溶液局部pH值太高，反复调节过程中强碱对pH电极造成影响，pH计不稳定，因此选择9.5、10.0、10.5进行PB试验。
2.4.5 碱性蛋白酶料液比对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
不同料液比对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响见图7。
由图7可知，随着溶剂体积的逐渐增加，多肽得率逐渐上升，当料液比为1∶20（g/mL）时，多肽得率达到最大，为64.43%。溶剂体积继续增大，多肽得率降低。当料液比在 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）范围内，随着溶剂体积增加，溶剂与溶质接触更加充分，促进混溶蛋白溶解成多肽，多肽得率逐渐增大。随着溶剂体积增加，溶液浓度减小，亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性也降低。但继续增大溶剂体积，多肽得率变化不明显。因此确定最佳料液比为1∶20（g/mL）。
图7 不同料液比对多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响
Fig.7 The effect of different material-liquid ratios on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase
2.5 PB试验结果
PB试验设计和试验结果见表4。
表4 PB试验设计和试验结果
Table 4 PB test design and test results
试验号A料液比/（g/mL）B酶解pH值C酶添加量/（U/g）D酶解温度/℃E酶解时间/h多肽得率/%1 1∶18 9.5 4 200 55 5.5 63.52 2 1∶22 9.5 3 800 45 4.5 61.86 3 1∶22 9.5 3 800 55 4.5 60.27 4 1∶18 10.5 3 800 45 4.5 62.50 5 1∶18 9.5 4 200 55 4.5 63.08 6 1∶22 10.5 4 200 55 4.5 62.55 7 1∶18 10.5 4 200 45 4.5 64.10 8 1∶18 10.5 3 800 55 5.5 61.36 9 1∶18 9.5 3 800 45 5.5 63.43 10 1∶22 9.5 4 200 45 5.5 64.34 11 1∶22 10.5 4 200 45 5.5 64.15 12 1∶22 10.5 3 800 55 5.5 62.16
PB试验方差分析结果见表5。
表5 PB试验方差分析
Table 5 PB experiment analysis of variance table
注：* 表示有显著影响，P＜0.05；**表示有极显著影响，P＜0.01。
因素 均方根 F值 P值 显著性模型 3.120 0 15.380 0 0.002 3 A料液比 0.059 0 2.910 0 0.138 8 B酶解pH值 9.533 0 0.042 0 0.844 1 C酶添加量 8.600 0 42.480 0 0.000 6 **D酶解温度 4.610 0 22.780 0 0.003 1 **E酶解时间 1.760 0 8.710 0 0.025 6 *
排列图结果见图8。
图8 各因素的排列图
Fig.8 Pareto chart of each factor
A.料液比；B.酶解 pH 值；C.酶添加量；D.酶解温度；E.酶解时间；蓝色表示消极影响；橙色表示积极影响。
由表5和图8可知，正影响因子有A料液比、B酶解pH值、C酶添加量、E酶解时间。负影响因子为D酶解温度。其中C酶添加量、D酶解温度、E酶解时间对多肽得率的合成有显著的影响。因此选择C酶添加量、D酶解温度、E酶解时间为下一步爬坡试验的研究对象。
2.6 爬坡试验
爬坡试验结果见表6。
表6 爬坡试验设计及结果
Table 6 Experimental design and the results of steepest ascent
试验号 酶添加量/（U/g）酶解温度/℃ 酶解时间/h 多肽得率/%1 3 000 60 3.0 59.29 2 3 200 58 3.5 61.02 3 3 500 55 4.0 62.87 4 3 800 52 4.5 63.57 5 4 000 50 5.0 67.56 6 4 200 48 5.5 65.29 7 4 500 45 6.0 63.28
由表6可知，在酶添加量4 000 U/g、酶解温度50 U/g、酶解时间5.0 h时，多肽得率达到最大，因此选择其作为响应面试验的中心点。
2.7 响应面优化试验
响应面试验设计及结果如表7所示。
表7 响应面试验设计及结果
Table 7 Response surface experiment design and results
试验号 F酶添加量/（U/g）G酶解时间/h H酶解温度/℃多肽得率/%1 3 000 5 55 58.80 2 4 000 5 50 68.43 3 4 000 5 50 67.86
续表7 响应面试验设计及结果
Continue table 7 Response surface experiment design and results
试验号 F酶添加量/（U/g）G酶解时间/h H酶解温度/℃多肽得率/%4 5 000 4 50 63.02 5 4 000 5 50 68.78 6 5 000 5 45 61.29 7 4 000 5 50 68.28 8 3 000 6 50 62.57 9 5 000 6 50 63.02 10 4 000 6 45 64.99 11 4 000 6 55 63.53 12 5 000 5 55 60.90 13 3 000 5 45 60.56 14 4 000 4 55 62.90 15 4 000 4 45 63.36 16 4 000 5 50 67.59 17 3 000 4 50 61.29
多元回归方程的方差分析结果见表8。
表8 多元回归方程的方差分析
Table 8 Analysis of variance in multiple regression equation
注：* 表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
项目 平方和df 均方根 F值 P值 显著性模型 157.43 9 17.49 115.28 ＜0.000 1 **F酶添加量 3.14 1 3.14 20.68 0.002 6 **G酶解时间 1.57 1 1.57 10.32 0.014 8 *H酶解温度 2.07 1 2.07 13.65 0.007 7 **FG 0.41 1 0.41 2.70 0.144 4 FH 0.47 1 0.47 3.09 0.122 1 GH 0.25 1 0.25 1.65 0.240 1 F2 85.65 1 85.65 564.48 ＜0.000 1 **G2 6.09 1 6.09 40.14 0.000 4 **H2 45.58 1 45.58 300.4 ＜0.000 1 **残差 1.06 7 0.15失拟 0.18 3 0.06 0.27 0.844纯误差 0.88 4 0.22总和158.5 16
由表 8可知，模型的F 值为115.28，P＜0.000 1，说明模型差异极显著。R2大于0.8说明方程拟合度较好，可以用此模型对蛋白酶酶解亚麻籽饼粕工艺进行优化。结合方差分析可知，一次项中F、H对多肽得率的影响极显著，G对多肽得率的影响显著。交互作用FG、FH、GH 对多肽得率影响不显著，二次项 F2、G2、H2对多肽得率影响极显著。各因素对亚麻籽多肽的影响次序为酶添加量＞酶解温度＞酶解时间。通过采用Design Expert 8.0得出最佳条件为碱性蛋白酶酶添加量4 060.17 U/g、酶解时间5.18 h、酶解温度49.59℃，多肽得率预测值为68.27%。对回归模型进行响应面分析，得到三维模型图，如图9～图11所示。
图9 酶添加量和酶解时间三维平面关系图
Fig.9 Three-dimensional plane relationship diagram between enzyme addition amount and enzymolysis time
图10 酶添加量和酶解温度三维平面关系图
Fig.10 Three-dimensional plane relationship diagram of enzyme addition and enzymolysis temperature
图11 酶解时间和温度三维平面关系图
Fig.11 Three-dimensional plane relationship diagram of enzymolysis time and temperature
响应面为平滑的曲面，且开口向下，说明在响应曲面上存在最大响应值，可从中确定最佳因素水平范围。如图9～图11所示，亚麻籽多肽得率随着酶添加量、酶解时间、酶解温度的增加呈现先升高后降低的趋势，存在极大值。此外，等高线沿酶添加量轴变化趋势明显高于酶解温度和酶解时间，由此可知，酶添加量对多肽得率的影响大于酶解时间和酶解温度。酶添加量和酶解时间、酶添加量和酶解温度、酶解时间和酶解温度交互作用对亚麻籽多肽得率影响不显著，与试验得到结果相符。
2.8 验证试验
按照预测条件进行平行试验，重复3次，测得结果取算数平均值，得到亚麻籽多肽得率为67.24%，与预测值68.27%较为接近，证明此模型参数可靠，有参考价值。
2.9 亚麻籽多肽抗氧化活性及黄嘌呤氧化酶抑制活性
亚麻籽多肽抗氧化活性的结果见表9。
表9 亚麻籽多肽与常用抗氧化剂之间的比较结果
Table 9 Comparison results between flaxseed peptides and commonly used antioxidants
组别 ABTS+自由基清除率/% ·OH清除率/%未水解亚麻籽饼粕 88.46 64.50亚麻籽多肽 92.68 90.65维生素C 95.78 92.65
由表9可知，亚麻籽多肽对ABTS+自由基和·OH的清除率均高于未水解亚麻籽饼粕，但要低于VC。亚麻籽多肽对ABTS+自由基和·OH的清除率为92.68%、90.65%，VC对ABTS+自由基和·OH的清除率为95.78%、92.65%。结果表明，蛋白酶解后，所得到的特定多肽段抗氧化效果更好。多肽的自由基清除能力对亚麻籽多肽的抗氧化性起着重要作用。
亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制活性的结果见表10。
表10 亚麻籽多肽与别嘌呤醇之间对黄嘌呤氧化酶抑制活性的比较结果
Table 10 Comparison of xanthine oxidase inhibitory activity between flaxseed polypeptide and allopurinol
组别 黄嘌呤氧化酶抑制活性/%未水解亚麻籽饼粕 40.85亚麻籽多肽 60.04 20 mmol/L别嘌呤醇 62.27 60 mmol/L别嘌呤醇 65.19
由表10可知，未水解亚麻籽饼粕对黄嘌呤氧化酶的抑制为40.85%，亚麻籽多肽对黄嘌呤氧化酶抑制性为60.04%，与对照组接近，表明亚麻籽多肽具有较强的黄嘌呤氧化酶抑制活性。
3 结论
以亚麻籽加工制油的主要副产物亚麻籽饼粕为原料，通过酶解亚麻籽饼粕制备多肽。以多肽得率和黄嘌呤氧化酶抑制活性为指标，采用单因素和响应面优化亚麻籽多肽制备工艺。最佳工艺为用碱性蛋白酶水解制备亚麻籽多肽，最佳酶解条件为酶添加量4 060.17 U/g、酶解pH值10.5、酶解温度49.59℃、酶解时间5.18 h、料液比1∶20（g/mL），此条件下多肽得率为67.24%。亚麻籽多肽对ABTS+自由基和羟基自由基有明显的清除作用，说明亚麻籽多肽具有抗氧化活性，且对黄嘌呤氧化酶也有一定的抑制活性。
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