高脂血症是由本身血脂代谢异常而引起的疾病，常表现为血清高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C） 降低或总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol LDL-C）升高。目前，高脂血症的治疗药物主要以他汀类、贝特类为主。虽然疗效显著，但是这两类药物作用靶点单一，近年来研究发现他汀类药物可能引发肝损伤、横纹肌溶解、新发肿瘤和糖尿病等不良反应，而且停药后反弹率高。因此，植源性药物的研究成为人们关注的热点[1]。
核桃青皮又称青龙衣，为核桃外部的一层厚厚绿色果皮，是核桃的主要副产品之一，每年其产量巨大，都被丢弃在田间地头，不仅造成资源浪费，还带来环境污染。有研究报道核桃青皮中含有多种活性物质，如多酚类化合物[2-4]、黄酮类化合物[5]、醌类化合物[6-7]、二芳基庚烷类化合物[8]、萜类化合物以及甾体类化合物、多糖[9-10]等。现代研究核桃青皮具有抗氧化[11-12]、抗菌[13-14]、抗炎[15]、抗肿瘤[16]、保肝[17]、杀虫[18]、改善肠道菌群[19]、加快伤口愈合[20]等作用。近年来，从天然产物中筛选治疗和预防高脂血症的物质成为国内外研究的热点[21]。本文利用急性高脂血症小鼠模型探究核桃青皮乙醇提取物的降脂作用，然后利用液质联用技术（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）分析核桃青皮提取物中降脂活性成分，以期为核桃青皮资源的有效开发与利用奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
核桃：云南大理漾濞县深纹核桃，漾泡，9月采收，机械脱外层青皮；核桃青皮粗提取物：云南中医药大学药食资源实验室自制。基础饲料：苏州双狮实验动物饲料科技有限公司。
无水碳酸钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；福林酚试剂（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；生理盐水：昆明市宇斯药业有限责任公司；非诺贝特胶囊：法国利博福尼制药公司；血清总胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司。
健康昆明种雄鼠[体重18 g～22 g，生产许可证号：SCXK（京）20140004]：中国医学科学院医学实验动物研究所。所有动物实验的操作均严格遵守云南中医学院动物伦理委员会的相关条例规定。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；UV759S紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SK7210HP超声波清洗机：上海科导超声仪器有限公司；ZDHW调温电热套：北京中兴伟业仪器有限公司；YRE-2020Z旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司；DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；INFINITEM200PRO酶标仪：瑞士TECAN公司；TM（OHAUS）先行者电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；H.H.S电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂。
2 方法
2.1 核桃青皮提取物的制备
新鲜核桃青皮采用电热鼓风干燥箱烘干，粉碎过60目筛。过筛后的核桃青皮粉末采用以下提取工艺进行提取：50%乙醇、料液比 1∶20（g/mL），提取温度70 ℃、提取3次，每次提取时间为1 h。合并3次提取液并过滤、滤液浓缩、冷冻干燥，备用。
2.2 核桃青皮提取物中多酚含量的测定
2.2.1 溶液的配制
福林酚溶液的配制：精确移取2.5 mL浓度为100%的福林酚溶液于25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容后即得浓度为10%的福林酚溶液。
Na2CO3溶液的配制：称取1.875 g Na2CO3固体加蒸馏水溶解并定容至25 mL，即得7.5% Na2CO3溶液。
样品溶液的制备：精确称取25 mg核桃青皮粗提物粉末于100 mL容量瓶中，加60%乙醇超声溶解并定容。
2.2.2 核桃青皮提取物多酚含量的测定
取1 mL 2.2.1中制备的样品溶液置于10 mL容量瓶中，加5.0 mL 10%福林酚溶液，充分摇匀，反应5 min后，再加入4mL7.5% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，30℃下避光反应1 h，在765 nm波长下测定吸光度。根据标准曲线方程A=0.094 6c+0.043 9；R2=0.999 1计算得核桃青皮提取物中多酚含量为0.143 8 mg/g。
2.3 急性高脂血症小鼠模型的建立
84只体重18 g～22 g健康昆明种雄鼠，适应性饲养1周后，根据体重随机分为6组（每组14只）：正常组、模型组、非诺贝特组[40 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物高剂量组[600 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物中剂量[400 mg/（kg·d）]、核桃青皮提取物低剂量组[200 mg/（kg·d）]，剂量设定以核桃青皮提取物中的多酚量计。正常组和模型组灌胃给予给药组等量的生理盐水，其余各组连续灌胃给药7 d。第7天给药2 h后，模型组和给药组腹腔注射蛋黄乳0.5 mL/只（75%蛋黄乳剂：45 mL蛋黄+15 mL生理盐水，混匀成乳状，4℃贮藏备用[22]）；正常组注射生理盐水0.5 mL/只，建立急性高脂血症小鼠模型。各组小鼠的给药剂量及给药浓度见表1。
表1 各组小鼠的给药剂量及给药浓度
Table 1 The administration dosage and concentration of each group
组别 给药剂量/[mg/（kg·d）]给药浓度（以多酚计）/（mg/mL）正常组 0.9%生理盐水模型组 0.9%生理盐水非诺贝特组 40 2核桃青皮提取物高剂量组 600 30核桃青皮提取物中剂量组 400 20核桃青皮提取物低剂量组 200 10
2.4 小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的测定
于第7天给药2 h后，正常组腹腔注射生理盐水（0.5 mL/只），其余各组都进行腹腔注射蛋黄乳0.5 mL/只，禁食不禁水16 h后采用摘除眼球取血法取血，待血样凝集后，3 000 r/min，4℃离心15 min，取上层血清按各测定试剂盒的操作说明书测定血清TC、TG、LDLC和HDL-C。
2.5 脏器指数的检测
小鼠称取体质量后，处死后取肝、肾、脾脏器，称重并记录，按下列公式计算脏器指数。
肝指数/%=肝重（g）/体重（g）×100
肾指数/%=肾重（g）/体重（g）×100
脾指数/%=脾重（g）/体重（g）×100
2.6 核桃青皮多酚的LC-MS鉴定
本试验中采用LC-MS鉴定核桃青皮粗提取物的多酚组成及相对含量，测定条件为安捷伦1260系列高效液相系统，包括G1214AUV探测器和Atlantis T3 C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）反相色谱柱。流动相A和B分别为水溶液（0.1%甲酸）和乙腈溶液，洗脱条件：0～1 min 100%A；1 min～4 min，100%～92%A；4 min～24 min，92%～80%A；24min～26min，80%～70%A；26min～28min，70%～0%A；28 min～35min，100%B；重平衡5 min。流速为350 μL/min、进样量为10 μL、柱温度保持在 25 ℃。紫外吸收光谱通过二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）在280 nm处检测，液相系统被偶联到microTOF-QII，配有电喷雾离子源（electrospray ion source，ESI），电喷雾在负离子模式操作，源电压3.5 kV。
2.7 数据分析
试验数据以（均值±标准差）表示，采用GraphPad Prism 5.0统计软件处理，采用单因素方差进行处理，采用Dunnett-t检验进行两两比较，P＜0.05为具有显著性意义。
3 结果与分析
3.1 核桃青皮提取物对小鼠脏器指数的影响
小鼠处死后分别摘取肝脏、肾脏、脾脏进行脏器指数的计算，核桃青皮提取物对小鼠脏器指数的影响结果见表2。
表2 核桃青皮提取物对小鼠脏器指数的影响
Table 2 Effect of extracts from walnut green husk on organ iedex of mice
注：与正常组相比，##表示差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
组别 剂量/[mg/（kg·d)]肝指数/% 肾指数/% 脾指数/%正常组 4.53±0.52 1.27±0.13 0.40±0.09模型组 4.82±0.48 1.24±0.09 0.46±0.08非诺贝特组 40 6.43±1.25**##1.42±0.25*0.45±0.08核桃青皮提取物高剂量组600 4.75±0.92 1.26±0.23 0.42±0.13核桃青皮提取物中剂量组400 5.22±1.56 1.36±0.11 0.51±0.16核桃青皮提取物低剂量组200 4.64±0.36 1.24±0.07 0.45±0.08
由表2可知，比较模型组与正常组，给药组与模型组之间的差异。结果显示，与正常组相比较，模型组和核桃青皮提取物高、中、低剂量组小鼠的肝、肾、脾指数差异不显著（P＞0.05），表明核桃青皮提取物对小鼠脏器无损伤；与正常组相比，非诺贝特组肝指数升高，且差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，非诺贝特组肝指数和肾指数均升高，且差异显著（P＜0.05），说明非诺贝特对小鼠的脏器有一定损伤作用。
3.2 核桃青皮提取物对小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响
核桃青皮提取物对小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响见图1。
图1 核桃青皮对高脂血症小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响
Fig.1 Effects of walnut green husk extract on serum TC，TG，HDL-C and LDL-C of hyperlipidemia mice
与正常组相比，##表示差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
由图1可知，与正常组相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平均升高，且差异极显著（P＜0.01），表明造模成功。与模型组相比，非诺贝特组和核桃青皮提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组的TC、TG、LDL-C水平降低，除核桃青皮提取物低剂量组的甘油三酯水平降低差异显著外（P＜0.05），其余剂量组差异均极显著（P＜0.01）；HDL-C水平升高，且差异极显著（P＜0.01）。
核桃青皮提取物对高脂血症小鼠血脂的影响程度见图2。
图2 核桃青皮提取物对高脂血症小鼠血脂水平的影响
Fig.2 Effect of walnut green husk extract on serum lipid level in hyperlipidemia mice
由图2可知，以模型组为基数，非诺贝特组的TC、TG、LDL-C分别降低43.82%、64.62%、45.95%，核桃青皮提取物高剂量组的TC、TG、LDL-C分别降低33.55%、50.82%和51.40%，核桃青皮提取物中剂量组的TC、TG、LDL-C 分别降低 31.21%、43.74%和50.00%，核桃青皮提取物低剂量组的TC、TG、LDL-C分别降低31.34%、29.92%和35.05%。
综上所述，核桃青皮提取物可显著地改善急性高脂血症小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，显示出良好的降脂作用。
3.3 核桃青皮多酚的LC-MS鉴定结果
采用LC-MS鉴定核桃青皮提取物中的降脂成分。色谱图分离并标记出16种物质，液相色谱见图3。
图3 核桃青皮多酚的液相色谱图
Fig.3 Liquid chromatography of walnut peel polyphenols
通过高效液相-质谱分析，鉴别出16种物质，各个化合物的保留时间，相应的分子式，分子量和所占百分比见表3。
表3 核桃青皮多酚的LC-MS鉴定
Table 3 Phenolic compounds identified by LC-MS in walnut green husk
序号 保留时间/min 化合物 分子式 分子量/Da 百分比/%1 1.664 儿茶素 C15H14O6 290.08 ＜0.01 2 5.093 焦性没食子酸 C6H6O3 126.11 ＜0.01 3 5.253 没食子酸 C7H6O5 170.02 8.43 4 5.587 单没食子酰基葡萄糖 C13H16O10 332.07 20.17 5 5.947 香草酸 C8H8O4 168.15 1.29 6 6.667 2-HHDP-葡萄糖异构体 C34H24O22 784.07 0.93 7 7.374 新绿原酸 C16H18O9 354.10 5.39 8 8.241 2-HHDP-葡萄糖异构体 C34H24O22 784.07 1.73 9 8.895 3-肉桂酰奎尼酸 C16H18O8 338.10 7.61 10 9.268 特里马素Ⅰ异构体 C34H26O22 786.09 3.58 11 10.536 香豆酸己糖苷异构体 C15H18O8 326.01 0.33 12 10.642 咖啡酸 C9H8O4 180.15 0.25 13 11.696 特里马素Ⅰ异构体 C34H26O22 786.09 5.08 14 12.737 3-没食子酰基葡萄糖苷 C27H24O18 636.10 4.01 15 17.273 鞣花酸 C14H6O8 302.01 1.75 16 21.822 flavogallonic C21H10O13 470.01 1.80
根据高效液相-质谱数据分析，从核桃青皮提取物中分离并鉴别出16种物质，分别为单没食子酰基葡萄糖、没食子酸、新绿原酸、3-肉桂酰奎尼酸、特里马素Ⅰ异构体、特里马素Ⅰ异构体、3-没食子酰基葡萄糖苷、儿茶素、焦性没食子酸、香草酸、2-HHDP-葡萄糖异构体、2-HHDP-葡萄糖异构体、香豆酸己糖苷异构体、咖啡酸、鞣花酸、flavogallonic。
4 结论
血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇是反应机体脂质代谢的主要指标。急性高脂血症是因为摄入过多外源性胆固醇而导致。小鼠腹腔注射蛋黄乳剂能快速升高TC、TG、LDL-C而形成高胆固醇血症，且具有经济、迅速、简便等优点，可作为筛选降脂药物的初步方法。本文用急性高脂血症小鼠模型研究核桃青皮的降脂作用，研究结果表明，核桃青皮提取物能降低急性高血脂小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，其降脂机制可能与抑制外源性胆固醇吸收，增加脂质代谢转运有关。研究结果还显示非诺贝特能使小鼠肝脏质量增加，非诺贝特在表现出降血脂作用的同时，还对小鼠肝脏有一定的损伤。此外通过高效液相-质谱分析，发现16种多酚类物质，分别为儿茶素、焦性没食子酸、没食子酸、单没食子酰基葡萄糖、香草酸、2-HHDP-葡萄糖异构体、新绿原酸、3-肉桂酰奎尼酸、特里马素Ⅰ异构体、香豆酸己糖苷异构体、咖啡酸、3-没食子酰基葡萄糖苷、鞣花酸、flavogallonic，其中单没食子酰基葡萄糖百分比最高，达20.17%，其次为没食子酸、3-肉桂酰奎尼酸，分别为8.43%和7.61%。综上所述，作为传统中药之一的核桃青皮（青龙衣）具有良好的降脂活性，其降脂成分可能是多酚类物质。
[1]刘学贵,李知明,刘长风,等.基于网络药理学探讨山楂叶抗高脂血症的作用机制及初步验证[J/OL].食品工业科技:1-18[2022-04-15].https://doi.org/10.13386/j.issn1002-0306.2021100176.LIU Xuegui,LI Zhiming,LIU Changfeng,et al.Study on the mechanism of action of hawthorn leaves against hyperlipidemia based on network pharmacology and preliminary validation study[J/OL].Science and Technology of Food Industry,1-18[2022-04-15].https://doi.org/10.13386/j.issn1002-0306.2021100176.
[2]杜京旗,李雪芬,杨卫民.应用TLC-CMS技术检测核桃青皮中多酚类化合物[J].农产品加工,2021(13):58-63,69.DU Jingqi,LI Xuefen,YANG Weimin.The polyphenol compounds in walnut(Juglans regin L.)green husk were detected by TLC-CMS[J].Farm Products Processing,2021(13):58-63,69.
[3]张旭,曹丽娟,赵庆宇婧,等.核桃青皮渣中多酚的超声提取工艺研究[J].食品科技,2016,41(3):218-223.ZHANG Xu,CAO Lijuan,ZHAO Qingyujing,et al.Ultrasonic extraction process of polyphenols from walnut green husk pomace[J].Food Science and Technology,2016,41(3):218-223.
[4]张旭,陈丹,曹丽娟,等.5种大孔树脂纯化鲜核桃青皮汁多酚工艺的比较[J].中成药,2016,38(8):1852-1855.ZHANG Xu,CHEN Dan,CAO Lijuan,et al.Comparison of five macroporous resins for purifying polyphenols from fresh walnut green husk juice[J].Chinese patent medicine,2016,38(8):1852-1855.
[5]王吉平,何铁光,苏利荣,等.核桃果皮中单宁、总黄酮和茶多酚的提取工艺研究[J].南方林业科学,2020,48(4):30-33.WANG Jiping,HE Tieguang,SU Lirong,et al.Simultaneous extraction of tannin,total flavonoids and tea polyphenol from Juglans regia L.husk[J].South China Forestry Science,2020,48(4):30-33.
[6]曹丽娟,张旭,陈朝银,等.核桃青皮的化学成分及药理作用研究进展[J].湖北农业科学,2016,55(18):4629-4633,4663.CAO Lijuan,ZHANG Xu,CHEN Chaoyin,et al.Research on the chemical components and pharmaceutical actions of walnut green husk[J].Hubei Agricultural Sciences,2016,55(18):4629-4633,4663.
[7]杜京旗,陈娇娇,杨卫民.应用TLC-CMS技术检测核桃青皮中醌类化合物[J].农产品加工,2021(12):56-59.DU Jingqi,CHEN Jiaojiao,YANG Weimin.TLC-CMS was used to detect quinone compounds in walnut peel[J].Farm Products Processing,2021(12):56-59.
[8]杨卫民,杜京旗,王子奇.应用TLC-CMS技术检测核桃青皮中二芳基庚烷类化合物[J].农产品加工,2021(10):52-57.YANG Weimin,DU Jingqi,WANG Ziqi.Diarylheptanoids in walnut(Juglans regia L.)green husk were determined by TLC-CMS[J].Farm Products Processing,2021(10):52-57.
[9]谢东雪,陆娟,王月,等.长白山区核桃青皮多糖分离纯化、鉴定及抗氧化活性分析[J].食品科学,2019,40(18):281-286.XIE Dongxue,LU Juan,WANG Yue,et al.Purification,preliminary characterization and antioxidant activity of polysaccharides from green husks of walnut(Juglans regia L.)grown in Changbai Mountain[J].Food Science,2019,40(18):281-286.
[10]张琳,樊东升,刘光耀.核桃青皮化学成分及其缓蚀作用研究进展[J].化工设计通讯,2021,47(2):75-77.ZHANG Lin,FAN Dongsheng,LIU Guangyao.Research progress on chemical constituents and corrosion inhibition of walnut green peel[J].Chemical Engineering Design Communications,2021,47(2):75-77.
[11]SOTO-MADRIDD,GUTIÉRREZ-CUTIÉOM,POZO-MARTÍNEZ J,et al.Dependence of the ripeness stage on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut(Juglans regia L.)green husk extracts from industrial by-products[J].Molecules(Basel,Switzerland),2021,26(10):2878.
[12]李晓华.核桃青皮中多酚类物质的分离纯化及其抗氧化性[J].食品工业,2021,42(7):1-4.LI Xiaohua.Separation and purification of polyphenols from walnut and its antioxidant activity[J].The Food Industry,2021,42(7):1-4.
[13]吴莹,包晓玮,陈勇,等.核桃(Juglans regia L.)青皮提取物抗氧化及抑菌活性的研究[J].畜牧兽医学报,2017,48(6):1118-1127.WU Ying,BAO Xiaowei,CHEN Yong,et al.Antioxidant capacity and antimicrobial activity of extracts from walnut(Juglans regia L.)green husks[J].Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences,2017,48(6):1118-1127.
[14]汪涛,梁亮,李旭锐,等.低共熔溶剂提取核桃青皮多酚工艺优化及其抑菌活性[J].农业工程学报,2021,37(5):317-323.WANG Tao,LIANG Liang,LI Xurui,et al.Optimization of the technology for deep eutectic solvents extraction and antibacterial activity of walnut green husk polyphenols[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2021,37(5):317-323.
[15]HUWC,WANG X F,WU L,et al.Apigenin-7-O-β-D-glucuronide inhibits LPS-induced inflammation through the inactivation of AP-1 and MAPK signaling pathways in RAW 264.7 macrophages and protects mice against endotoxin shock[J].Food & Function,2016,7(2):1002-1013.
[16]孙卉,何志贵,师俊玲.核桃青皮活性成分胡桃醌抗肿瘤作用研究进展[J].农产品加工,2021(14):86-90.SUN Hui,HE Zhigui,SHI Junling.Research progress on anti-tumor effect of juglone the active component of walnut green husks[J].Farm Products Processing,2021(14):86-90.
[17]方琼莲,王蒙蒙,乔雪,等.核桃青皮提取物对非酒精性脂肪肝的作用[J].食品与发酵工业,2021,47(18):159-164.FANG Qionglian,WANG Mengmeng,QIAO Xue,et al.Effect of walnut green husk extracts on non-alcoholic fatty liver disease[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(18):159-164.
[18]张宏露,罗兴平.核桃青皮主要成分胡桃醌的生物活性研究进展[J].当代化工研究,2021(9):164-165.ZHANG Honglu,LUO Xingping.Research progress on the biological activity of juglone,the main component of walnut green peel[J].Modern Chemical Research,2021(9):164-165.
[19]WANG G L,ZHANG Y L,ZHANG R G,et al.The protective effects of walnut green husk polysaccharide on liver injury,vascular endothelial dysfunction and disorder of gut microbiota in high fructose-induced mice[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,162:92-106.
[20]TAHERI A,MIRGHAZANFARI SM,DADPAY M.Wound healing effects of Persian walnut(Juglans regia L.)green husk on the incision wound model in rats[J].European Journal of Translational Myology,2020,30(1):8671.
[21]王冬菊.心脑血管疾病流行概况及主要影响因素[J].预防医学论坛,2016,22(1):71-75.WANG Dongju.Prevalence and main influencing factors of cardiovascular and cerebrovascular diseases[J].Preventive Medicine Tribune,2016,22(1):71-75.
[22]冯任南,郭福川,李颖,等.急性高血脂小鼠模型蛋黄乳及Trition法建立[J].中国公共卫生,2010,26(9):1116-1117.FENG Rennan,GUO Fuchuan,LI Ying,et al.Acute hyperlipidemia model induced by yolk and Trition-WR1339 in mice[J].Chinese Journal of Public Health,2010,26(9):1116-1117.