菰属植物（Zizania spp.）属禾本科（Gramineae）、稻族（Oryzeae Dumort）、菰亚族（Zizaniinae Benth）[1]。世界上的菰属植物共有4种，包括东亚的中国菰（Zizania latifolia）以及北美洲的水生菰（Zizania aquatica）、沼生菰（Zizania palustris）和得克萨斯菰（Zizania texana）[2]。中国菰可生长于湖泊、沟塘、河溪和湿地中，在淮河流域和长江流域中下游分布最为广泛[3-4]。中国菰种子经人工或机械方法去壳后得到的颖果为中国菰米（Chinese wild rice），是一种富含酚类化合物，尤其是类黄酮化合物的有色全谷物[5-6]。研究表明，菰米可改善高脂膳食诱导的大鼠胰岛素抵抗，降低高脂膳食诱导的低密度脂蛋白受体敲除小鼠的高血糖，还具有抗动脉粥样硬化作用[7-9]。水稻（Oryza sativa）与中国菰为近缘属，稻米主要分为籼稻和粳稻两个亚种[10-11]。稻米根据种皮颜色还可分为无色稻米和有色稻米，有色稻米种皮由于类黄酮的积累，呈红色、黑色等颜色，同时含有更丰富的生物活性物质[12]。糙米、红米和黑米仅脱去了外层的颖壳，和中国菰米一样都属于全谷物食品的范畴。居民日常膳食中适当添加有色稻米或糙米，可以起到预防脂肪肝、高血糖和高血脂等慢性疾病的效果[13-14]。
近年来，许多研究阐述了酚类化合物对糖尿病和多种代谢性疾病的作用机制。中国菰米作为富含类黄酮化合物的传统食品资源，目前还没有文章较为全面地研究过其对糖尿病和其他代谢疾病相关酶活性的抑制效果。因此，本文以已知的有效酶抑制剂为阳性对照，主要研究了中国菰米与稻米甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶的抑制作用，及抑制作用与酚类化合物含量的相关性，从而系统地比较中国菰米与稻米对多种慢性疾病相关酶活性抑制作用的差异，探究中国菰米和不同种类稻米的提取物在抗衰老、预防和辅助治疗糖尿病、肥胖等慢性疾病方面的潜力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中国菰米和不同种类稻米（籼米、粳米、红米、黑米）于2019年10月采自湖北省荆州市三湖农场和江苏省淮安市金湖县白马湖村，2018年也在两地收集了中国菰米样品[1]。所有样品进行去除颖壳、不去除种皮处理。样品经真空冷冻干燥至恒重；利用粉碎机粉碎至粉末状，每个样品有3个重复。
α-葡萄糖苷酶（11.05 U/mg）、α-淀粉酶（11 U/mg）、可溶性淀粉、胰脂肪酶（30 U/mg～90 U/mg）、酪氨酸酶（7 164 U/mg）、左旋多巴、曲酸：美国 Sigma公司；对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；拜糖平（阿卡波糖）：中国北京拜耳医药保健有限公司；4-硝基苯丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate，PNPB）、奥利司他：上海麦克林生化科技有限公司；DNS试剂：北京索莱宝科技有限公司；甲醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
冷冻干燥机（Alpha 1-4 LDPlus）：德国Marin Christ公司；粉碎机（FDV-SS）：弘荃机械企业有限公司；超声波恒温清洗机（SBL-30DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；离心机（Eppendorf AG 22331 Hamburg）：德国Eppendorf公司；旋转蒸发仪（RE100-Pro）：美国 Scilogex公司；光吸收型全波长酶标仪（SP-Max 2300A2）：上海闪谱生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 样品提取与制备
样品提取：参考Yu等[1]的方法，采用超声波辅助提取法进行样品提取。分别称取0.2 g（精确至0.000 1）中国菰米和4种稻米样品粉末加入5 mL甲醇后在超声萃取仪中50℃超声萃取40 min，3 500 r/min离心10 min后吸取上清液并用0.22 μm极性膜过滤，制得游离态酚类样品液。向剩余滤渣中加入5 mL浓度为4 mol/L的NaOH溶液，于恒温振荡器中30℃230 r/min振荡水解4 h。随后在4 500 r/min下离心10 min，收集上清液。用6 mol/L盐酸调节上清液pH值至1.5～2.0，用乙酸乙酯萃取3次后，于旋转蒸发仪35℃蒸发至干，加入5 mL甲醇溶液超声复溶，过0.22 μm极性膜，得到结合态酚类提取液。提取液均于4℃条件储存。
样品制备：吸取等量游离态酚类提取液和结合态酚类提取液涡旋混匀，取5 mL混合液于45℃氮吹至干，加入1 mL DMSO复溶配制成100 mg/mL储备液，于4℃条件储存。
1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制作用
储备液用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS，pH6.9）稀释 20 倍后得到供测样品液，反应体系在Chu等[15]建立的方法上加以改进。用NaCl PBS（6.7 mmol/L）配制 α-葡萄糖苷酶（0.25 U/mL）。阳性对照阿卡波糖浓度为1 mg/mL。反应在96细胞培养板中进行，将70 μL供测样品溶液和10 μL α-葡萄糖苷酶溶液充分振荡混匀后于37℃恒温箱中孵育10 min。加入 20 μL PNPG（6 mmol/L）启动反应，振荡混匀后于37℃恒温箱中孵育20min。加入100μL 1mol/L Na2CO3溶液终止反应，充分振荡混匀于400 nm波长下测定吸光度。按照下式计算抑制率。
式中：A样品为添加供测样品反应液的吸光度；A空白代表未添加样品反应液（以PBS稀释的5%DMSO替代）的吸光度；A背景为不含α-葡萄糖苷酶（以NaCl PBS替代）的背景溶液吸光度（1为添加样品，2为未添加样品）。
1.3.3 α-淀粉酶抑制作用
储备液用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.9）稀释20倍后得到供测样品液，反应体系在Yuan等[16]建立的方法上加以改进。阳性对照阿卡波糖浓度为0.005 mg/mL。用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液制备可溶性淀粉溶液（1%，质量比）和α-淀粉酶溶液（0.5 U/mL）。反应在2 mL离心管中进行，将100 μL样品溶液与40 μL α-淀粉酶充分混合后在37℃下孵育10 min。向离心管中添加100 μL可溶性淀粉溶液，孵育10 min。加入200 μL DNS试剂停止反应，并在100℃保温5 min。将所得混合物冷却至室温，加入1.5 mL超纯水稀释，于520 nm下测量吸光度。按照下式计算抑制率。
式中：A样品为添加供测样品反应液的吸光度；A空白代表未添加样品反应液（以PBS稀释的5%DMSO替代）的吸光度；A背景为不含α-淀粉酶（以NaCl PBS替代）的背景溶液吸光度（1为添加样品，2为未添加样品）。
1.3.4 胰脂肪酶抑制作用
储备液用0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-HCl，pH8.0）稀释 20倍后得到供测样品液，反应体系在已建立的方法[16-17]上加以改进。以0.5 mg/mL奥利司他为阳性对照。向96细胞培养板中加入100 μL供测样品溶液和50 μL胰脂肪酶Tris-HCl溶液（0.5 mg/mL），充分振荡混匀后于37℃恒温箱中孵育10 min。加入50 μL 4-硝基苯丁酸酯Tris-HCl溶液（15 mmol/L）启动反应，振荡混匀后37℃恒温孵育20 min，于400 nm波长下测定吸光度。按照下式计算抑制率。
式中：A样品为添加供测样品反应液的吸光度；A空白代表未添加样品反应液（以Tris-HCl稀释的5%DMSO替代）的吸光度；A背景为不含胰脂肪酶（以Tris-HCl替代）的背景溶液吸光度（1为添加样品，2为未添加样品）。
1.3.5 酪氨酸酶抑制作用
储备液用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）稀释20倍后得到供测样品液，反应体系在Yuan等[16]建立的方法上加以改进。以0.005 mg/mL曲酸为阳性对照。反应在96细胞培养板中进行，将70 μL样品溶液与50 μL酪氨酸酶（50 U/mL）混合后在25℃下孵育10 min，然后添加80 μL 0.5 mmol/L左旋多巴（溶于0.05 mol/L PBS）启动反应。充分混匀在25℃下孵育20 min后，于475 nm处测量吸光度。按照下式计算抑制率。
式中：A样品为添加供测样品反应液的吸光度；A空白代表未添加样品反应液（以PBS稀释的5%DMSO替代）的吸光度；A背景为不含酪氨酸酶（以PBS替代）的背景溶液吸光度（1为添加样品，2为未添加样品）。
1.4 数据统计方法
数据以平均值±标准差表示，试验为3次独立重复。运用 SAS v.9.4（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）统计分析软件，采用邓肯法多重比较对样品的数据进行方差分析，在P＜0.05下进行数据间差异显著性分析。Pearson相关分析在P＜0.05水平进行数据间相关性分析。
2 结果与分析
2.1 中国菰米与稻米甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用
中国菰米与稻米甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率如图1所示。
图1 中国菰米与稻米甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on α-glucosidase activity
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，1 mg/mL阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶活性抑制率为（65.54±1.05）%。12个样品中，荆州黑米和淮安黑米甲醇提取物表现出最强的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，抑制率分别为（93.23±4.78）%和（87.39±3.81）%，显著高于阳性对照阿卡波糖（P＜0.05）。此外，荆州产地2018年、2019年中国菰米以及荆州红米对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用虽然低于同产地黑米和阳性对照，但相较于同产地的籼米、粳米也表现出较强抑制作用，抑制率分别为（22.80±0.06）%、（22.03±0.31）%和（14.53±0.29）%。淮安产地2018年中国菰米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率为（11.53±0.39）%，显著高于同产地除黑米外的其他样品。淮安产地籼米、粳米、红米、2019年中国菰米的α-葡萄糖苷酶酶活性抑制率之间无显著性差异。荆州产地红米、黑米、2018年和2019年中国菰米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率分别为籼米的3.19、20.48、5.01和4.84倍，粳米的 3.07、19.69、4.82 和 4.65倍，种皮颜色深的样品相比种皮无颜色的样品呈现出更强的α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力。
中国菰米与稻米甲醇提取物对α-淀粉酶活性的抑制率如图2所示。
图2 中国菰米与稻米甲醇提取物对α-淀粉酶活性的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on α-amylase activity
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，本试验12个样品的α-淀粉酶活性抑制率均显著低于0.005 mg/mL阿卡波糖的（38.67±0.47）%（P＜0.05）。荆州黑米的 α-淀粉酶活性抑制率为（22.50±0.76）%，显著高于同产地籼米、粳米以及2018年、2019年中国菰米（P＜0.05）。荆州粳米的α-淀粉酶活性抑制率仅为（7.44±0.37）%，为同产地样品最低。淮安黑米的α-淀粉酶活性抑制率为（22.34±2.15）%，显著高于同产地的其他样品（P＜0.05）。淮安红米与淮安2019年中国菰米的α-淀粉酶活性抑制率分别为（18.28±1.14）%和（16.53±0.91）%，两者之间无显著差异，但均显著高于淮安籼米和淮安粳米的（5.00±2.76）%和（12.13±0.38）%（P＜0.05）。
2.2 中国菰米与稻米甲醇提取物对胰脂肪酶活性的抑制作用
中国菰米与稻米甲醇提取物对胰脂肪酶活性的抑制率如图3所示。
图3 中国菰米与稻米甲醇提取物对胰脂肪酶活性的抑制作用
Fig.3 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on pancreatic lipase activity
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，阳性对照奥利司他（0.5 mg/mL）的胰脂肪酶活性抑制率为（83.08±5.57）%，所有12个样品对胰脂肪酶均有一定的抑制作用，但抑制率均显著小于阳性对照（P＜0.05）。荆州产地籼米、粳米、红米、黑米、2018年和2019年中国菰米胰脂肪酶活性抑制率分 别 为 （16.87±4.44）% 、（16.04±0.94）% 、（23.25±1.03）%、（35.54±3.13）%、（19.53±0.46）%和 （18.75±1.43）%。淮安产地籼米、粳米、红米、黑米、2018年和2019年中国菰米胰脂肪酶活性抑制率分别为（18.30±0.35）% 、（16.54 ±0.05）% 、（23.16 ±0.91）% 、（29.40 ±1.25）%、（20.59±4.04）%和（21.25±4.09）%。所有样品中，黑米对胰脂肪酶的抑制率显著高于同地区其他样品（P＜0.05），中国菰米样品与籼米、粳米和红米间并无显著性差异（P＞0.05）。
2.3 中国菰米与稻米甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
中国菰米与稻米甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制率如图4所示。
图4 中国菰米与稻米甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa methanol extracts on tyrosinase activity
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，12个样品中黑米的酪氨酸酶活性抑制率最高，荆州黑米和淮安黑米的酪氨酸酶活性抑制率分别为（58.78±1.74）%和（47.19±0.57）%，显著高于阳性对照 0.005 mg/mL 曲酸的 （38.18±3.31）%（P＜0.05）。荆州2018年和2019年中国菰米的酪氨酸酶活性抑制率分别为（35.29±0.08）%和（34.72±1.83）%，淮安2018年和2019年中国菰米的酪氨酸酶活性抑制率分别为（31.50±0.62）%和（30.27±0.76）%。同产地中国菰米、红米、黑米与无色稻米甲醇提取物的酪氨酸酶活性抑制率表现为黑米＞中国菰米＞红米＞无色稻米，且两地区样品间差异规律相似。与荆州样品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率规律相同，种皮颜色较深的黑米、中国菰米、红米较无色的籼米、粳米表现出更强的酪氨酸酶活性抑制能力。
2.4 中国菰米和稻米体外酶抑制作用与总酚、总黄酮、总原花青素含量的相关性分析
中国菰米与稻米体外酶抑制作用与总酚含量（total phenolic content，TPC）、总黄酮含量（total flavonoid content，TFC）、总原花青素（total proanthocyanidin content，TPAC）含量的相关性分析结果见表1。
表1 中国菰米与稻米体外酶抑制作用与总酚、总黄酮、总原花青素含量的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between inhibitory effects of Zizania latifolia and Oryza sativa on enzymesin in vitro and the content of total phenols，total flavonoids，and total proanthocyanidins
注：TPC以每100克中国菰米或稻米米粉中含有的当量没食子酸的毫克数[mg Gallic acids equivalents（GAE）/100 g]表示；TFC和TPAC以每100克中国菰米或稻米米粉中含有的当量儿茶素的毫克数[mg Catechin equivalents（CE）/100 g]表示。
项目 α-葡萄糖苷酶抑制作用/% α-淀粉酶抑制作用/% 胰脂肪酶抑制作用/% 酪氨酸酶抑制作用/%TPC/（mg GAE/100 g）y=0.001 1TPC-0.012 8 R=0.642 9，P＜0.01 y=0.001 1 TFC-0.006 5 R=0.854 2，P＜0.01 TPAC/（mg CE/100 g）y=0.001 3 TPAC-0.036 8 R=0.935 8，P＜0.01 y=0.000 7 TPC+0.124 2 R=0.814 5，P＜0.01 TFC/（mg CE/100 g）y=0.001 5 TFC-0.182 4 R=0.597 1，P＜0.01 y=0.000 2 TPC+0.116 1 R=0.599 3，P＜0.01 y=0.000 2 TPC+0.179 2 R=0.461 5，P＜0.05 y=0.000 3 TFC+0.074 6 R=0.666 6，P＜0.01 y=0.000 3 TFC+0.135 3 R=0.585 0，P＜0.01 y=0.000 2 TPAC+0.122 9 R=0.645 9，P＜0.01 y=0.000 2 TPAC+0.173 8 R=0.826 7，P＜0.01 y=0.000 6 TPAC+0.152 1 R=0.924 3，P＜0.01
TPC、TFC、TPAC数据参考文献[1]所测得的中国菰米和稻米总酚、总黄酮、和总原花青素含量。中国菰米和稻米 TPC（R=0.642 9、0.599 3、0.461 5、0.814 5，P＜0.05）、TFC （R=0.597 1、0.666 6、0.585 0、0.854 2，P ＜0.01）、TPAC （R=0.935 8、0.645 9、0.826 7、0.924 3，P＜0.01）均与其对4种酶体外酶抑制作用呈显著的线性正相关，推测总酚、总黄酮和总原花青素含量是影响中国菰米和稻米体外酶活性抑制作用的重要因素。
3 讨论与结论
样品浓度为5 mg/mL时，荆州和淮安黑米的α-葡萄糖苷酶活性抑制率可达（93.23±4.78）%和（87.39±3.81）%，酪氨酸酶活性抑制率可达（58.78±1.74）%和（47.19±0.57）%，远高于其他样品，且已经高于试验中的阳性对照阿卡波糖（1 mg/mL）和曲酸（0.005 mg/mL）。中国菰米的α-葡萄糖苷酶活性和酪氨酸酶活性抑制率在7.40%～22.80%和30.27%～35.29%，显著高于红米和无色稻米（图1和图4）（P＜0.05）。中国菰米与稻米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性抑制率大小表现为黑米＞中国菰米＞红米＞无色稻米，趋势与Yu等[1]所测的中国菰米和稻米总酚、总黄酮、总原花青素含量相似。相关性分析表明，总酚、总黄酮和总原花青素含量与中国菰米和稻米体外酶抑制率呈显著正相关（P＜0.01）。Chu等[15]指出从中国菰米中分离得到的不同原花青素组分表现出不同程度的α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制作用。Yao等[18]的研究也发现在红米、紫米、黑米、紫玉米、黑色大麦和黑色大豆中，黑米的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最强，而且α-葡萄糖苷酶活性抑制作用与总酚和总花青素含量呈显著正相关。还有研究表明，藻类酚类化合物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶均有良好的抑制作用，尤其是对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于阿卡波糖[16]。
与α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶相比，中国菰米和稻米的α-淀粉酶和胰脂肪酶活性抑制率之间差异更小。与本研究结果类似的是，Boue等[19]研究了5种有色稻米米糠的乙醇提取物，结果显示5个样品总酚、总黄酮、总原花青素含量虽然存在不同程度差异，但并不是所有样品提取物的α-淀粉酶抑制能力都与酚类化合物总含量相关。Chu等[15]的研究结果显示，中国菰米中分离出的6个原花青素组分仅有一个聚合度较高的组分展现出弱胰脂肪酶抑制作用（IC50=1 054.01 μg/mL），并推测植物提取物的胰脂肪酶抑制作用不仅与酚类化合物的总量有关，还与分子类型有关。荆州菰米、淮安菰米和红米富含芦丁（103.7 μg/g～ 15.7 μg/g）和槲皮素（15.4 μg/g～ 44.1 μg/g），而且已有研究表明槲皮素和芦丁均为α-葡萄糖苷酶的有效抑制剂[4，20]。荆州中国菰米与黑米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制率显著高于同产地的籼米和粳米，可能与其提取物中的相关类黄酮单体含量更高有关。
综上所述，中国菰米与4种稻米的甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶均具有一定的抑制作用，其中黑米的α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性抑制率分别显著高于1 mg/mL阿卡波糖和0.005 mg/mL曲酸阳性对照。荆州中国菰米的α-葡萄糖苷酶活性和酪氨酸酶活性抑制率也要显著高于同产地的红米、籼米和粳米。黑米的胰脂肪酶活性抑制率显著高于同地区其他样品。相关性分析显示，中国菰米与4种稻米的酶活性抑制作用与总酚、总黄酮、总原花青素含量，尤其是总黄酮和总原花青素含量密切相关。本研究证实了中国菰米与4种稻米的甲醇提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶和酪氨酸酶的成分，所获得结果为中国菰米与稻米在糖尿病和其他代谢疾病相关酶的抑制作用方面提供了参考。
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