黑苦荞麦，属廖科双子叶植物[1]，加工过程中会产生大量的黑苦荞麦壳，其质量约占黑苦荞麦籽粒的1/3[2]，研究发现黑苦荞麦壳含约5%左右的酚类物质[3]。其中最受关注的是原花青素，原花青素具有非常强的抗氧化能力[4]以及抗菌[5]、消炎[6]、抑制肿瘤[7]等生物活性价值。生物活性强弱主要取决于原花青素结构和聚合度大小[8]。黑苦荞麦壳原花青素主要由原花青素单体（儿茶素或表儿茶素）、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体等组成，按聚合度大小可划分为低聚原花青素（聚合度≤4）和高聚原花青素（聚合度＞4）[9]。研究发现，黑苦荞麦壳原花青素中高聚原花青素占比达到55%，由于聚合度高，分子量大，很难透过生物膜进入细胞内，一定程度上降低了其生物利用度和抗氧化活性[10]，因此将高聚原花青素转化成低聚原花青素是提高黑苦荞麦壳附加值的重要途径之一。
目前，国内外对于高聚原花青素的降解方法主要分为化学降解和生物降解两种。化学降解主要通过酸[11]、碱[12]、氢化降解[13]等，将原花青素高聚体中C4-C8之间链接键断裂，得到低聚体；生物降解技术则采用微生物及生物酶将原花青素聚合物苯环打开降解为低聚物[14]。原花青素可广泛地应用于食品、医药、保健品等领域，因此对其纯度有非常高的要求，考虑到普通化学降解剂和生物降解菌参与降解反应后不易进行分离，势必会影响产物的纯度和后续应用，故提出采用固体酸作为催化剂降解高聚原花青素的思路。通过查阅文献资料证实，固体酸催化剂降解原花青素高聚物的想法是可行的，陈卫航等[15]利用SO42-/TiO2固体酸降解葡萄籽高聚原花青素，发现纳米级TiO2制备出的含H2SO4浓度为2 mol/L的SO42-/TiO2固体酸催化剂，降解率可达到61.18%；魏冠红[16]采用固体酸I号强酸树脂降解玫瑰红葡萄籽中原花青素高聚体，聚合度从6.26下降到2.30，下降了3.96个单位。徐旺等[17]采用723型阳离子树脂降解花生红衣中高聚原花青素，得到平聚合度为2.55的低聚原花青素。
Amberlyst系列固体酸催化剂，它是用苯乙烯和二乙烯苯在特殊制孔剂作用下经悬浮共聚成的珠体，再经磺化反应得到具有大孔网状、带有磺酸基团的高分子聚合物，属于磺酸型阳离子交换树脂。它的最高使用温度不超过120℃，适合高聚原花青素降解这类低温催化反应；金属负载型固体酸催化剂（SO42-/TiO2）属于高温催化剂，最高使用温度为220℃，在低温条件下，催化剂活性较低[18]。而且Amberlyst系列固体酸催化剂具有非凝胶型孔结构，比凝胶型树脂（723型阳离子树脂）具有更大的表面积和更强的稳定性，从而更好地结合底物进行催化反应[19]。综上，本研究考察不同种类固体酸催化剂的催化作用，以平均聚合度为评价指标，探讨了不同降解条件对黑苦荞麦壳高聚原花青素 （black tartary buckwheat shell polymeric proanthocyanidins，BPPC）降解的影响，优化了降解工艺，并评价了催化降解产物的抗氧化活性，为黑苦荞麦壳的开发利用和深入研究提供了理论依据，具有一定的实际应用价值和意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑苦荞麦（西农9940），2021年产自陕西榆林；抗坏血酸（vitamin C，VC）、2，6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT），均为分析纯：天津尖峰生物制品有限公司；固体超强酸[HND-32（SO42-/ZrO2）、HND-34（SO42-/Fe2O3）]，磺酸型阳离子交换树脂 [Amberlyst-45（A-45）、Amberlyst-35（A-35）、Amberlyst-15（A-15）]：南大合成有限公司；氯化铁、铁氰化钾（分析纯）：天津市大港亿中化工厂；2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐 [2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：郑州市中原科技玻璃仪器厂；紫外可见分光光度计 （UV-1800）：岛津企业管理（中国）有限公司；红外光谱仪（NEXUS670）：美国尼高力仪器公司；冷冻干燥机（LGJ-25C）：北京四环科学仪器厂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料处理
将干燥后的黑苦荞麦壳粉碎，过100目筛，使用石油醚对得到的黑苦荞麦壳粉进行充分脱脂。脱脂后的黑苦荞麦壳粉采用溶剂法提取原花青素，提取剂为60%的乙醇溶液，料液比为 1∶15（g/mL），50℃水浴浸提60 min。采用乙酸乙酯作为萃取剂对黑苦荞麦壳原花青素粗提液进行分级，溶液分层后，水相为BPPC，经-80℃冻干，得到高聚原花青素粉末。有机相为黑苦荞麦壳低聚原花青素（black tartary buckwhea shell oligomeric proanthocyanidins，BOPC）。
1.3.2 固体酸降解工艺
将0.5 g高聚原花青素粉末加入10 mL去离子水中，溶解，然后在高聚原花青素溶液中加入一定质量的固体酸催化剂，并将其置于已设置好相应温度和时间的加热磁力搅拌器中反应，反应结束后，过滤催化剂终止反应，即可得到高聚原花青素降解液。
1.3.3 黑苦荞麦壳高聚原花青素固体酸降解单因素试验
选择 2 种固体超强酸 HND-32（SO42-/ZrO2）、HND-34（SO42-/Fe2O3）和3种磺酸型阳离子交换树脂Amberlyst-45（A-45）、Amberlyst-35（A-35），Amberlyst-15（A-15）催化降解BPPC，以原花青素平均聚合度为评价指标，在催化温度为65℃、催化剂添加量为10%（质量分数）的基础上，研究催化时间（20、30、40 min）对黑苦荞麦壳原花青素平均聚合度的影响，从而筛选出一种合适的催化剂。
对筛选出的催化剂的催化条件进行工艺优化，研究催化剂不同添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、催化时间（10、20、30、40、50 min）、催化温度（45、55、65、75、85℃）对黑苦荞麦壳原花青素平均聚合度的影响。
表1 催化剂理化参数
Table 1 Physicochemical parameters of catalysts
催化剂种类酸容量/（mmol/g）最高使用温度/℃HND-34 ≥4.5 220 HND-32 ≥4.7 380 Amberlyst-15 ≥4.7 120 Amberlyst-35 ≥5.2 120 Amberlyst-45 ≥5.5 140
1.3.4 黑苦荞麦壳高聚原花青素固体酸降解正交优化试验
依据催化降解的单因素试验结果，以各单因素为自变量，平均聚合度为因变量，设计正交试验，见表2。
表2 试验设计水平编码
Table 2 Levels and factors in the experimental design
水平 A催化剂添加量/%1 8 2 10 3 12 B催化时间/min C催化温度/℃55 65 75 20 30 40
1.3.5 原花青素平均聚合度的测定
采用分光光度法检测样品液的平均聚合度，见下式。
式中：m为原花青素质量含量，μg；M为儿茶素相对分子质量，290；n原花青素物质的量，μmol。
1.3.5.1 原花青素质量浓度测定
参照文献[20]中方法，略作修改。在甲醇体系中，以儿茶素为标准品绘制标准曲线。配制不同浓度的儿茶素系列标准溶液；取各浓度标准溶液1 mL，分别加入4 mL含4%香草醛的甲醇溶液和2 mL浓盐酸溶液混匀，于常温下避光反应20 min。反应结束后取出，以甲醇代替样品作为空白对照，测定500 nm处吸光度，绘制的标准曲线方程为Y=2.484 4X+0.048 9，R2=0.993 6。取1 mL样品稀释液，按以上步骤测定。
1.3.5.2 原花青素含量测定
参照文献[21]中方法，略作修改。在乙酸体系中，以儿茶素为标准品绘制标准曲线。配制儿茶素系列标准溶液，取1 mL样品加入5 mL含4%盐酸和0.5%香草醛的乙酸溶液，避光于20℃下反应10 min，以乙酸替代样品作空白组，测定500 nm处的吸光度，绘制的标准曲线方程为Y=5.041 8X+0.053 6，R2=0.998 6。取1 mL样品稀释液，按以上步骤测定。
1.3.6 原花青素傅里叶红外光谱扫描分析
参照文献[22]，分别取2 mg左右的黑苦荞麦壳高聚原花青素样品和固体酸降解产物，加入200 mg KBr混匀，在玛瑙研钵中充分研磨、压片，在傅里叶红外光谱仪中，首先对纯KBr薄片进行背景扫描，然后再对含有原花青素样品的KBr薄片进行扫描，得到红外光谱图。红外光谱条件为扫描频率：64次/s；扫描范围：600 cm-1～4 000 cm-1，其分辨率为 4.0 cm-1。
1.3.7 原花青素体外抗氧化能力的测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定
参照文献[23]中方法，略作修改。将100 μL样品溶液加入到100 μmol DPPH甲醇溶液中，混匀后37℃下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度，空白组为甲醇。DPPH自由基清除率计算公式如下。
式中：A0和A分别代表空白组和样品组的吸光度。
1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力的测定
参照文献[24]中方法，略作修改。所有试剂采用50 mmoL/L磷酸盐缓冲溶液配制。将50 μL样品溶液加入到150 μL ABTS工作液中，混匀后30℃下避光反应30 min，于734 nm处测定吸光度，空白组为磷酸盐缓冲溶液。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
式中：A0和A分别代表空白组和样品组的吸光度。
1.3.7.3 亚铁离子螯合能力的测定
参照文献[25]中方法，略作修改。取0.5 mL样品溶液，依次加入50 μL 2 mmoL/L氯化亚铁溶液和0.2 mL 5 mmoL/L铁氰化钾溶液，混匀后30℃下反应10 min，于562 nm处测定吸光度，空白组为超纯水。亚铁离子螯合能力计算公式如下。
式中：A0和A分别代表空白组和样品组的吸光度。
1.3.8 数据处理
试验均重复3次，通过SPSS 16.0进行数据分析，采用Duncan’s进行显著性分析，Origin 2019进行绘图处理。
2 结果与分析
2.1 黑苦荞麦壳原花青素平均聚合度的测定
低聚、高聚原花青素占原花青素提取物比例及平均聚合度结果见表3。
表3 低聚、高聚原花青素占原花青素提取物比例及平均聚合度
Table 3 Proportions of oligomeric and polymeric proanthocyanidins to proanthocyanidin extract and average degree of polymerization
样品 占原花青素提取物比例/% 平均聚合度BOPC（乙酸乙酯相） 43.74±0.23 2.31±0.07 BPPC（水相） 56.36±0.12 6.89±0.09
2.2 固体酸催化剂的筛选
催化剂种类对原花青素平均聚合度的影响结果见图1。
图1 催化剂种类对原花青素平均聚合度的影响
Fig.1 Effect of catalyst content on average polymerization degree of proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
原花青素平均聚合度越低，表明固体酸催化剂催化效果越好。由图1可知，催化时间从20 min增加到40 min时，固体超强酸HND-32、HND-34均未呈现出良好的催化效果，其原因可能是HND-32、HND-34为高温型催化剂，使用温度范围分别为80℃～220℃和80℃～380℃，在低温条件下，催化剂活性较低，不适用该降解反应[18]。磺酸型阳离子交换树脂催化效果如下：A-35＞A-45＞A-15。在 A-35 为催化剂时，反应进行40 min，原花青素平均聚合度下降到2.32，A-15和A-45催化反应时原花青素平均聚合度分别下降到4.56、3.02，A-35的催化效果显著优于A-15和A-45（p＜0.05）。这是因为高聚原花青素降解效果与阳离子交换树脂酸容量有关，催化剂A-45的酸容量最大（5.5 mmol/g）、A-35 次之（5.2 mmol/g），A-15 最小（4.7 mmol/g），酸容量太大，会直接将原花青素降解为花青素，酸容量太小，不能完全将C4-C8链接键断开[26]，因此选择催化剂A-35较为合适。
2.3 黑苦荞麦壳高聚原花青素固体酸降解单因素试验
催化剂添加量对原花青素平均聚合度的影响结果如图2所示。
图2 催化剂添加量对原花青素平均聚合度的影响
Fig.2 Effect of catalyst content on average polymerization degree of proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
催化剂添加量从6%上升至10%时，平均聚合度从4.74下降至2.62，变化显著（p＜0.05），当催化剂添加量大于10%时，降解液的平均聚合度趋于平稳，无显著差异（p＞0.05）。该结果表明，10%的催化剂添加量已可提供足够多的酸性位点与底物相接触，过量的催化剂对降解效果无显著影响，考虑到能源消耗等问题，最终确定最佳催化剂添加比例为10%。
催化时间对原花青素平均聚合度的影响结果如图3所示。
图3 催化时间对原花青素平均聚合度的影响
Fig.3 Effect of catalyst time on average polymerization degree of proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
在催化时间40 min时，降解液的平均聚合度下降至2.64，而超过此时间后，反应液的平均聚合度变化不大（p＞0.05），加之在超过60℃下若过长时间反应会导致原花青素内部结构破坏，例如发生开环反应[27]等，不再是活性强的低聚原花青素结构，因此最终确定40 min为最佳催化时间。
催化温度对原花青素平均聚合度的影响结果如图4所示。
图4 催化温度对原花青素平均聚合度的影响
Fig.4 Effect of catalyst temperature on average polymerization degree of proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
在45℃到85℃之间，原花青素的平均聚合度伴随温度的升高而逐渐下降，其中45℃～75℃区间，下降显著（p＜0.05），说明原花青素降解效果良好；而在75℃以后，反应液的平均聚合度下降不再明显（p＞0.05）。而且原花青素含有多羟基结构，温度越高稳定性越差，容易分解[27]，故最终确定75℃为最佳催化温度。
2.4 黑苦荞麦壳高聚原花青素固体酸降解正交优化试验结果分析
正交优化试验直观分析见表4，正交优化试验方差分析见表5。
表4 正交试验直观分析
Table 4 Visual analysis of orthogonal test
试验号 A催化剂添加量 B催化时间 C催化温度 平均聚合度1 1 1 1 3.54 2 2.41 3 1 3 3 3.22 1 2 2 4 3.26 5 2 2 1 3.43 2 1 3 6 2.45 7 3 1 2 2.8 2 3 2 8 3.83 9 3 3 3 3.51 3 2 1 k1 3.06 3.2 3.62 k2 3.05 3.22 2.65 k3 3.38 3.06 3.33极差R 0.33 0.16 0.97因素主次 C＞A＞B
表5 平均聚合度方差分析
Table 5 Analysis of variance of average degree of polymerization
注：**表示差异极显著，*表示差异显著。
来源 离差平方和 自由度 均方 F 显著性校正模型 1.996 6 0.333 319.425 **截距 80.222 1 80.222 77 013.333 **催化剂添加量 0.191 2 0.095 91.483 **催化时间 0.009 2 0.005 4.333 *催化温度 1.634 2 0.817 784.232 **误差 0.002 2 0.001总计 91.932 9校正总计 1.998 8
由表4及表5可知，对平均聚合度来说，催化剂添加量和催化温度对其有极显著影响（p＜0.01），催化时间对其有显著性影响，（p＜0.05）。各因素对高聚原花青素降解反应的影响主次顺序为：催化温度＞催化剂添加量＞催化时间适宜降解工艺条件：A2B3C2，即催化剂添加量为10%，催化温度为65℃，催化时间为40 min。此条件下，原花青素的平均聚合度从6.89下降至2.37。
2.5 傅里叶红外光谱分析
对黑苦荞麦壳高聚原花青素及其催化降解产物进行傅里叶红外光谱扫描，结果如图5所示。
图5 不同样品的红外光谱图对比
Fig.5 FTIR spectrograms of different samples
1.高聚原花青素降解产物；2.BPPC。
高聚原花青素3396cm-1处为原花青素分子结构中羟基由氢键作用引起的伸缩振动；1 610 cm-1、1 451 cm-1处是苯环骨架中C C的伸缩振动吸收峰；1 364 cm-1、1 263 cm-1、1 072 cm-1的吸收峰为原花青素分子结构C环的C—O—C的伸缩振动。可以发现降解产物特征峰对应的区域与高聚原花青素极为相似，表明用A-35降解后，原花青素的酚羟基等重要官能团没有发生明显变化，分子内结构没有被破坏[28]，降解效果良好。
2.6 体外抗氧化活性分析
2.6.1 DPPH自由基清除能力分析
高聚原花青素降解产物的DPPH自由基清除能力对比分析见图6
图6 高聚原花青素降解产物的DPPH自由基清除能力对比分析
Fig.6 Comparative analysis of DPPH radical scavenging capacity of degradation products of polymeric proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
考察DPPH自由基清除能力是常用的体外抗氧化测定方法，常用IC50值表示，IC50值越低表明物质对DPPH自由基的清除能力越强。由图6可见，降解产物对DPPH自由基的清除能力显著低于BOPC和BHT（p＜0.05），但其明显高于 BPPC（p＜0.05）且与 VC无显著差异（p＞0.05）。可能因为BPPC经过固体酸降解后，其平均聚合度下降，DPPH自由基清除能力得到显著提高（p＜0.05），根据IC50计算，降解产物对DPPH自由基的清除能力是BPPC的1.92倍。
2.6.2 ABTS+自由基清除能力分析
高聚原花青素降解产物的ABTS+自由基清除能力对比分析见图7。
图7 高聚原花青素降解产物的ABTS+自由基清除能力对比分析
Fig.7 Comparative analysis of ABTS+radical scavenging capacity of degradation products of polymeric proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
由图7可见，降解产物对ABTS+自由基的IC50值显著低于BPPC，说明BPPC经固体酸催化剂降解后，降解产物对ABTS+自由基的清除能力得到显著提高（p＜0.05），与 VC无显著性差异（p＞0.05），但是显著低于BOPC和BHT（p＜0.05）。根据IC50计算，降解产物对ABTS+自由基的清除能力是BPPC的4.78倍。根据文献报道，邓兆雯[29]比较了不同聚合度的荔枝皮原花青素的抗氧化活性，表明原花青素的聚合度越低，其对ABTS+自由基清除能力越强，这可能是由于随着原花青素聚合度的增加，原花青素分子中一部分酚羟基在分子内部形成氢键，使具有活性的酚羟基大大减少，因而整体对ABTS+自由基的清除能力下降；反之随着原花青素聚合度的下降，其活性酚羟基增加，对ABTS+自由基的清除能力上升。
2.6.3 亚铁离子螯合能力分析
高聚原花青素降解产物的亚铁离子螯合能力对比分析见图8。
图8 高聚原花青素降解产物的亚铁离子螯合能力对比分析
Fig.8 Comparative analysis of Fe2+chelating ability of degradation products of polymeric proanthocyanidins
不同小写字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
铁是机体内一种重要且必需的元素，但铁含量的过剩也会造成机体的损害。过量的亚铁离子通过引发芬顿反应产生过氧自由基诱发脂质氧化，是极好的促氧化剂，但当其处于螯合状态时，便失去了促氧化的能力[30]。故本试验通过测定样品对亚铁离子的螯合作用，来判定其是否具有较好的间接抗氧化能力。结果如图8所示，由于浓度大于1.0 mg/mL时，部分样品螯合亚铁离子能力能达到100%，无法比较。所以在选择分别在0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的浓度条件下进行试验。结果表明高聚原花青素降解产物螯合亚铁离子的能力与BOPC和BPPC相比无显著性差异（p＞0.05），但均明显强于VC（p＜0.05）。这表明原花青素螯合亚铁离子能力与其平均聚合度关系不大。周玮婧[25]比较了不同品种的荔枝皮原花青素的亚铁离子螯合能力，发现不同品种的荔枝皮原花青素的聚合度虽然不同，但是亚铁离子螯合能力却无显著性差异，与本研究结果一致。
3 结论
本文以黑苦荞麦壳为原料，经脱脂后提取得到原花青素粗提物，通过萃取分离，得到了高聚原花青素。从5种固体酸催化剂中筛选出适合降解黑苦荞麦壳高聚原花青素的催化剂，确定磺酸型阳离子交换树脂Amberlyst-35（A-35）为固体酸催化剂。通过单因素试验和正交试验优化获得最佳的催化降解工艺参数如下：催化剂添加量10%（质量分数）、催化时间40 min、催化温度65℃。在此条件下，降解后的原花青素平均聚合度为2.37。傅里叶红外光谱显示，原花青素功能基团未被固体酸催化剂破坏，降解产物的DPPH、ABTS+自由基清除能力分别提高了1.92倍和4.78倍，亚铁离子螯合能力变化不显著。综上，固体酸催化剂A-35降解作为一种效果好、操作便捷的方法，可用于黑苦荞麦壳高聚原花青素的降解，从而得到聚合度低、抗氧化活性更强的低聚原花青素。
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