铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属草本植物[1-2]。铁皮石斛叶含有多糖、多酚、石斛碱、黄酮、萜类等生物活性物质，具有抗氧化[3]、抗炎镇痛、调节免疫力等多种功效[4]。《中国药典》规定铁皮石斛以茎入药，导致较多的叶子常被丢弃，造成铁皮石斛资源的严重浪费。因此，对铁皮石斛叶活性成分进行提取及利用可以提高铁皮石斛资源利用率。
目前国内外对铁皮石斛的研究多集中在铁皮石斛多糖、总黄酮提取及利用[5-9]，而铁皮石斛多酚的相关研究鲜见报道，张珍林等[10]研究了铁皮石斛干花多酚的提取工艺，但关于铁皮石斛叶多酚的研究鲜见。植物多酚因具有抗氧化、抗病毒等功效而引起人们广泛关注[11]。植物多酚提取方法有溶剂浸提[12]、超声波辅助提取[13]、超声-微波协同提取[14]、超临界CO2萃取[15]等。超声辅助提取具有无溶剂残留、提取能力强、易操作、能耗低等优点，目前被广泛应用于天然产物的提取。本试验对铁皮石斛叶多酚超声辅助提取的最优工艺条件和铁皮石斛叶多酚清除自由基活性进行研究，旨在扩大铁皮石斛产品附加值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛叶：福建南靖铁皮石斛人工大棚种植基地；没食子酸（纯度≥98%）：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚试剂（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；抗坏血酸（纯度≥99%）：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度为 96%）：上海铭博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
KQ5200DE超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；UV-1800-DS2紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；LGR10-4.2高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器设备公司；FD-2C-80真空冷冻干燥机：上海继谱电子科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 铁皮石斛叶多酚提取工艺流程
铁皮石斛叶→60℃烘干→粉碎过筛→样品粉末→超声辅助提取→离心→取上清液→浓缩→干燥→多酚样品。
1.3.2 铁皮石斛叶多酚提取量计算
铁皮石斛叶多酚含量测定采用福林酚法[16]，铁皮石斛叶多酚提取量计算参考文献[17]。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 乙醇体积分数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
固定超声功率为200 W，提取温度为40℃，提取时间为 20 min，液料比为 10∶1（mL/g），提取 1 次，考察乙醇体积分数（0%、15%、30%、45%、60%、75%）对铁皮石斛叶多酚提取量的影响。
1.3.3.2 超声功率对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
固定乙醇体积分数为45%，提取温度为40℃，提取时间为 20 min，液料比为 10∶1（mL/g），提取 1 次。考察超声功率（200、250、300、350、400、450 W）对铁皮石斛叶多酚提取量的影响。
1.3.3.3 提取时间对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
固定乙醇体积分数为45%，超声功率为350 W，提取温度为40℃，液料比为10∶1（mL/g），提取1次。考察提取时间（20、25、30、35、40、45 min）对铁皮石斛叶多酚提取量的影响。
1.3.3.4 液料比对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
固定乙醇体积分数为45%，超声功率为350 W，提取温度为40℃，提取时间为30 min，提取1次。考察液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]对铁皮石斛叶多酚提取量的影响。
1.3.3.5 提取温度对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
固定乙醇体积分数为45%，超声功率为350 W，提取时间为 35 min，液料比为 40∶1（mL/g），提取 1 次。考察提取温度（40、50、60、70、80、90 ℃）对铁皮石斛叶多酚提取量的影响。
1.3.4 响应面优化试验
以铁皮石斛叶多酚提取量作为试验设计的响应值，由单因素显著性分析得到对响应值影响较大的4个因素，采用四因素三水平的试验设计确定最优铁皮石斛叶多酚提取工艺条件。试验因素与水平设计见表1。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平D液料比/（mL/g）-1 30 30∶1 0 45 40∶1因素A乙醇体积分数/%B超声功率/W C提取时间/min 250 30 300 35 1 60 50∶1 350 40
1.3.5 铁皮石斛叶多酚清除自由基试验
以VC为对照，参考文献[18]测定铁皮石斛叶多酚对羟自由基的清除作用，参考文献[19]测定铁皮石斛叶多酚对超氧阴离子自由基的清除作用，参考文献[20]测定铁皮石斛叶多酚对DPPH自由基的清除作用。
1.4 数据分析
利用SPSS 21.0对单因素试验结果进行显著性分析，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计。试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
乙醇体积分数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响见图1。
图1 乙醇体积分数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图1可得，多酚提取量随着乙醇体积分数增大呈现先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为45%时，多酚提取量最大。原因是乙醇有利于含有羟基的多酚溶解析出，但是乙醇体积分数太大，多酚受醇溶性杂质影响，抑制溶出。因此，乙醇体积分数以45%为宜。
2.1.2 超声功率对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
超声功率对铁皮石斛叶多酚提取量的影响见图2。
图2 超声功率对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic power on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图2可得，多酚提取量随着超声功率增大先增大后减少，超声功率为350 W时，多酚提取量最大。原因是超声功率增加，萃取温度升高，细胞组织被分解得更彻底，增大多酚提取量；但超声功率过高，导致萃取温度过高，多酚被氧化分解，降低多酚提取量。因此，超声功率以350 W为宜。
2.1.3 提取时间对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
提取时间对铁皮石斛叶多酚提取量的影响见图3。
图3 提取时间对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.3 Effects of extraction time on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图3可得，多酚提取量随着提取时间延长先增大后减小，提取时间为35 min时，多酚提取量最大。原因是延长提取时间，铁皮石斛叶与溶剂接触时间越长，多酚越能充分地从铁皮石斛叶扩散到溶液中，但是提取时间过长，多酚易被氧化破坏，导致多酚提取量下降。因此，提取时间以35 min为宜。
2.1.4 液料比对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
液料比对铁皮石斛叶多酚提取量的影响见图4。
图4 液料比对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图4可得，多酚提取量随着液料比增大先增大后减小，液料比为40∶1（mL/g）时，多酚提取量最大。原因是提取溶剂体积越大，接触面积也越大，多酚提取量越高，但是提取溶剂体积过大，多糖、蛋白质等杂质溶解析出，多酚提取量降低，也不利于后续多酚的提纯。因此，液料比以 40∶1（mL/g）为宜。
2.1.5 提取温度对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
提取温度对铁皮石斛叶多酚提取量的影响见图5。
图5 提取温度对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.5 Effects of extraction temperature on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图5可得，多酚提取量随着提取温度升高先增大后减少，提取温度为60℃时，多酚提取量最大。原因是提取温度越高，有机溶剂扩散和传播得越快，越有利于多酚提取，但温度太高，易造成多酚分解。因此，提取温度以60℃为宜。
2.2 各单因素与铁皮石斛叶多酚提取量的方差分析
对5个单因素进行方差分析，结果如表2所示。
表2 单因素试验方差分析结果
Table 2 Variance analysis on single-factor experiment
项目 因素乙醇体积分数F 131.21 P ＜0.000 1超声功率 提取时间61.50 13.57 0.004 5 0.022 1液料比 提取温度85.44 2.31 0.001 8 0.194 5
由表2可知，乙醇体积分数、超声功率和液料比对多酚提取量均有极显著影响（P＜0.01），提取时间对多酚提取量影响显著（0.01＜P＜0.05），提取温度对多酚提取量影响不显著（P＞0.05）。因此，选择影响多酚提取量的关键因素（乙醇体积分数、超声功率、提取时间和液料比）进行响应面试验。
2.3 响应面试验
2.3.1 响应面试验设计与结果
响应面试验设计及方差分析见表3～表4。
表3 Box-Behnken设计方案及试验结果
Table 3 Box-Behnken design and results
试验号 乙醇体积分数 液料比 超声功率 提取时间 多酚提取量/（mg/g）1 -1 -1 0 0 31.02 2 1 -1 0 0 32.57 3 -1 1 0 0 31.66 4 1 1 0 0 32.86 5 0 0 -1 -1 31.84 6 0 0 1 -1 32.60 7 0 0 -1 1 31.36 8 0 0 1 1 32.03 9 -1 0 0 -1 31.46 10 1 0 0 -1 32.51 11 -1 0 0 1 30.60 12 1 0 0 1 32.76 13 0 -1 -1 0 31.74 14 0 1 -1 0 32.08
续表3 Box-Behnken设计方案及试验结果
Continue table 3 Box-Behnken design and results
试验号 乙醇体积分数 液料比 超声功率 提取时间 多酚提取量/（mg/g）15 0 -1 1 0 32.25 16 0 1 1 0 32.92 17 -1 0 -1 0 30.49 18 1 0 -1 0 32.54 19 -1 0 1 0 31.82 20 1 0 1 0 32.47 21 0 -1 0 -1 32.10 22 0 1 0 -1 32.71 23 0 -1 0 1 32.00 24 0 1 0 1 32.04 25 0 0 0 0 32.65 26 0 0 0 0 32.61 27 0 0 0 0 32.64 28 0 0 0 0 32.55 29 0 0 0 0 32.57
表4 回归方程的方差分析
Table 4 Analysis of variance of the regression equation
注：**表示影响极显著（P＜0.01），*表示影响显著（0.01＜P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 11.67 14 0.83 113.86＜0.000 1 **A 6.25 1 6.25 853.79＜0.000 1 **B 0.56 1 0.56 76.37＜0.000 1 **1.36 1 1.36 185.81＜0.000 1 **D 0.49 1 0.49 67.22＜0.000 1 **AB 0.031 1 0.031 4.18 0.060 1 AC 0.49 1 0.49 66.94＜0.000 1 **AD 0.31 1 0.31 42.08＜0.000 1 **BC 0.027 1 0.027 3.72 0.074 3 BD 0.081 1 0.081 11.10 0.004 9 **CD 0.002 0 1 0.002 0 0.28 0.607 1 A2 1.46 1 1.46 199.87＜0.000 1 **B2 0.038 1 0.038 5.14 0.039 7 *C2 0.59 1 0.59 81.04 ＜0.000 1 **D2 0.66 1 0.66 89.99＜0.000 1 **残差 0.10 14 0.007 3失拟项 0.095 10 0.009 5 5.05 0.066 2纯误差 0.007 5 4 0.001 9所有项 11.77 28 C
对表3数据进行二次多项式回归模型方程拟合，得到铁皮石斛叶多酚提取量（Y）对乙醇体积分数（A）、超声功率（B）、提取时间（C）、液料比（D）的回归方程：Y=32.60+0.72A+0.22B+0.34C-0.20D-0.087AB-0.35AC+0.28AD+0.083BC-0.14BD-0.022CD-0.47A2-0.076B2-0.30C2-0.32D2。（R2=0.982 6），说明实测值与预测值之间有很高的相关性。由表4可知，模型中的失拟项（P＞0.05）表明此模型拟合度良好。A、B、C、D、AC、AD、BD、A2、C2和 D2对多酚提取量的影响极显著（P＜0.01），B2对多酚提取量的影响显著（P＜0.05）。影响多酚提取量主次顺序：乙醇体积分数（A）>超声功率（C）>液料比（B）>提取时间（D）。
2.3.2 响应面分析因素间的相互作用
各因素交互作用对铁皮石斛叶多酚提取量影响结果见图6。
图6 不同因素对铁皮石斛叶多酚提取量影响的响应面图
Fig.6 Response surface map of the effect of different factors on the extraction of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图6可得，各响应面均具有最高点，表明在所选的范围内多酚提取量均具有最大值。响应曲面越陡峭，表明该因素对多酚提取量的影响越显著。由图6响应曲面得，4个因素对多酚提取量的影响均显著，这与表5方差分析的结果一致。
2.3.3 响应面试验模型的验证
根据模型获得4个变量的最优值，乙醇体积分数50.55%，超声功率350 W，提取时间37.47 min，液料比36.02∶1（mL/g），在最优提取工艺条件下，铁皮石斛叶多酚提取量理论值为33.03 mg/g。为了进一步检验试验方法的可靠性，考虑实际操作简便，调整最优提取工艺条件为乙醇体积分数50%，超声功率350 W，提取时间 37 min，液料比 36∶1（mL/g）。结果表明试验值（32.87 mg/g）与理论预测值（33.03 mg/g）相对误差为0.48%，差异不显著（P>0.05）。因此，利用响应面优化铁皮石斛叶多酚提取工艺条件结果可信。
2.4 提取次数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
按铁皮石斛叶多酚最优提取工艺条件即乙醇体积分数50%，超声功率350 W，提取时间37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取温度 60℃，分别提取 1、2、3次，结果见图7。
图7 提取次数对铁皮石斛叶多酚提取量的影响
Fig.7 Effects of extraction times on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves
由图7可知，提取2次，铁皮石斛叶多酚提取量最大，说明提取2次已基本提取完全，若增加提取次数不但多酚提取量降低，还会导致其他成分溶出，不利后续提纯。因此，提取以2次为宜，铁皮石斛叶多酚提取量为34.15 mg/g。
2.5 铁皮石斛叶多酚清除自由基能力
2.5.1 铁皮石斛叶多酚对羟自由基的清除能力
铁皮石斛叶多酚对羟自由基的清除能力结果见图8。
图8 不同浓度铁皮石斛叶多酚和VC对羟自由基的清除率的影响
Fig.8 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of hydroxyl radicals
由图8可知，铁皮石斛叶多酚和VC对羟自由基清除率均随着质量浓度增大而升高。铁皮石斛叶多酚和VC对羟自由基清除率IC50值分别为 0.554 mg/mL和0.325 mg/mL，说明铁皮石斛叶多酚清除羟自由基能力弱于VC。
2.5.2 铁皮石斛叶多酚对超氧阴离子自由基的清除能力
铁皮石斛叶多酚对超氧阴离子自由基的清除能力结果见图9。
图9 不同浓度铁皮石斛叶多酚和VC对超氧阴离子自由基的清除率的影响
Fig.9 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of superoxide anion free radicals
由图9可知，铁皮石斛叶多酚和VC对超氧阴离子自由基清除率均随着质量浓度的增大而升高。铁皮石斛叶多酚和VC对超氧阴离子自由基清除率IC50值分别为0.775 mg/mL和0.364 mg/mL，说明铁皮石斛叶多酚清除超氧阴离子自由基能力弱于VC。
2.5.3 铁皮石斛叶多酚对DPPH自由基的清除能力
铁皮石斛叶多酚对DPPH自由基的清除能力结果见图10。
图10 不同浓度铁皮石斛叶多酚和VC对DPPH自由基的清除率的影响
Fig.10 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of DPPH free radicals
由图10可知，铁皮石斛叶多酚和VC对DPPH自由基清除率均随着质量浓度的增大而升高。铁皮石斛叶多酚和VC对DPPH自由基清除率 IC5 0分别为0.596 mg/mL和0.358 mg/mL，说明铁皮石斛叶多酚清除DPPH自由基能力弱于VC。
3 结论
本试验以铁皮石斛叶为原料，通过单因素和响应面试验优化，得到各因素对铁皮石斛叶多酚提取量影响主次顺序：乙醇体积分数＞超声功率＞料液比＞提取时间。超声辅助提取铁皮石斛叶多酚的最优工艺条件：乙醇体积分数50%，超声功率350 W，提取时间37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取温度 60 ℃，提取 2 次，在此条件下，铁皮石斛叶多酚提取量为34.15 mg/g，说明利用超声辅助提取铁皮石斛叶多酚具有实际应用价值。以同浓度梯度的VC作对照，清除自由基试验结果表明，铁皮石斛叶多酚能够有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基及DPPH自由基，且清除能力随着多酚质量浓度增加而增强，表明铁皮石斛叶多酚具有较强的抗氧化活性，根据IC50值的比较可知铁皮石斛叶多酚的清除自由基效果均弱于同浓度梯度的VC。
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