桦褐孔菌又名桦树茸，是一种珍贵的药食两用真菌[1-4]。桦褐孔菌寄生于白桦、银桦等活立木的树皮上，属于多孔菌科、褐卧孔菌属真菌[5-7]。其中的多糖具有多种生物活性，包括抗氧化、抗疲劳、降血糖、抑制肿瘤生长、增强免疫力等。桦褐孔菌被视作天然的保健品，在欧美国家以及俄罗斯、日本等国家得到广泛的应用[8-13]。多糖作为生物活性大分子物质，如今越来越受到研究者们的关注[14-16]。磷酸化修饰是指利用游离的磷酸根基团取代多糖支链结构中的羟基，通过磷酸根带有的3个负电荷增加多糖的电负性，从而增强多糖活性。目前，关于经磷酸化修饰后的多糖生物活性在体内的作用机理以及应用开发方面的研究取得了一定的成果，如相关研究通过将壳聚糖磷酸化修饰，制备了用于骨膜组织工程的壳聚糖基支架材料，其在骨再生中有很好的应用[17]。随着结构分析方法的不断发展与完善，多糖的磷酸化修饰也有了更广阔的应用前景。试验以桦褐孔菌为原料，利用乙醇浸提法得到桦褐孔菌多糖，通过单因素试验确定反应温度、反应时间、pH值、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的适宜取值范围，再运用响应面法对桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺进行优化，以期为桦褐孔菌多糖食品资源的开发利用，以及研究开发新的功能性多糖食品原料提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桦褐孔菌菌粉：北京同仁堂健康药业有限公司；葡萄糖：天津广成化学试剂有限公司；苯酚：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、95%乙醇、磷酸二氢钠、氢氧化钠：天津阳光允能试剂公司；三偏磷酸钠、三聚磷酸钠：国药集团上海试剂有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子天平（BSA124S）：上海民桥精密科学仪器有限公司；高速万能粉碎机（FW100）：天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-26）：上海一恒科技有限公司；台式高速离心机（TCL-16G）：上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发仪（N100IDSB210）：上海泉杰仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桦褐孔菌多糖的提取
将粉碎的桦褐孔菌菌粉按料液比1∶5（g/mL）加入85%乙醇溶液，回流提取4 h，真空抽滤，滤渣再回流2次。合并3次滤液真空减压浓缩，冷却后加入3倍体积的85%乙醇溶液充分搅拌，静置20 h，3 500 r/min离心5 min，分离得到沉淀物，置于平皿中充分干燥，得到桦褐孔菌多糖。
1.3.2 桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺
称取一定比例的磷酸化试剂（三聚磷酸钠和三偏磷酸钠）共7 g溶于100 mL蒸馏水中，配制成磷酸化试剂，加入1 g桦褐孔菌多糖、5 g硫酸钠，溶解后调节溶液pH值至8.7，在一定温度、时间下进行磷酸化反应。反应结束后，向其中加入95%乙醇溶液，使溶液体积变为原来的4倍，静置沉淀24 h，经透析、干燥得到磷酸化桦褐孔菌粗多糖。
1.3.3 磷酸根含量的测定
采用钼蓝比色法测定磷酸根含量，将不同浓度的磷酸根标准溶液，加入由20%抗坏血酸、3 mol/L硫酸和3%钼酸铵配制成的定磷试剂中，在45℃条件下反应30 min，冷却后于660 nm处测吸光值，绘制标准曲线。得到标准曲线回归方程为y=0.81x+0.0407、R2=0.995 1，式中：y为吸光度；x为磷酸根含量。
样品中磷酸根含量测定方法：取0.5 g样品置于烧杯中，依次加入1 mL浓硫酸和1 mL浓硝酸，加热至产生白烟。溶液冷却后，加30%的H2O21 mL，再次加热。重复以上操作，至不产生白烟。再加入6 mol/L盐酸1 mL，加热分解溶液中残留的酸。取5 mL磷酸化后的桦褐孔菌多糖溶液，定容后通过绘制标准曲线方法测定样品中磷酸根含量。
1.3.4 单因素试验方法
取0.5 g桦褐孔菌多糖样品，以三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比（0∶7、1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1、7∶0）、反应温度（30、50、70、80、90 ℃）、反应时间（1、2、3、4、5、6 h）、pH 值（6、7、8、9、10）为考察因素，按照 1.3.3 的方法计算桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量。
1.3.5 桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺的响应面优化
以单因素试验结果为基础，利用响应面Box-Benhnken设计原理，以桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量为响应值，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比、反应时间、反应温度、pH值作为变量，设计响应面试验，确定桦褐孔菌多糖磷酸化修饰的最佳工艺参数，响应面试验设计因素水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平因素A三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比 D反应时间/h-1 5∶2 3 0 6∶1 4 1 7∶0 5 B反应温度/℃ C pH值70 8 80 9 90 10
1.4 数据处理
运用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面设计和方差分析，Origin 2018软件和SPSS 23软件分别进行绘图及数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 三聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比对磷酸根含量的影响
在反应温度80℃、pH8.0、反应时间5 h的条件下，选择不同的三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比，对桦褐孔菌多糖进行磷酸化修饰，结果如图1所示。
图1 三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比对磷酸根含量的影响
Fig.1 Effects of mass ratio of sodium tripolyphosphate and sodium trimetaphosphate on phosphate content
由图1可知，当三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比在0∶7～4∶3时，溶液中磷酸根含量变化幅度不大，说明在此范围内三聚磷酸钠和三偏磷酸钠有相互抑制的作用，且破坏了桦褐孔菌多糖的化学结构。当试剂配比为4∶3～6∶1时，溶液中磷酸根含量随着三聚磷酸钠占比的增大逐渐升高，说明适当提高三聚磷酸钠占比可以起到促进磷酸化反应的作用[18]，当试剂配比达到6∶1时，磷酸根含量达到最大值。因此选择三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量比为 5∶2、6∶1、7∶0 进行后续试验。
2.1.2 反应温度对磷酸根含量的影响
在反应时间5 h、pH8.0、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比为5∶2的条件下，不同反应温度对磷酸根含量的影响结果如图2所示。
图2 反应温度对磷酸根含量的影响
Fig.2 Effects of reaction temperature on phosphate content
由图2可知，桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量随反应温度的升高先增大后减小。当温度在30℃～80℃时，磷酸根含量随温度升高逐渐增大，由5.76%增加到9.63%，这可能是因为随着温度的升高，桦褐孔菌多糖中的高分子键活性得到增强[19]，磷酸根的利用率也会随之增加。当反应温度在80℃～90℃时，磷酸根含量呈下降趋势。因为反应温度过高，破坏了多糖内部的糖苷键，导致多糖磷酸化程度下降。因此选择反应温度为70、80、90℃进行后续试验。
2.1.3 反应时间对磷酸根含量的影响
在反应温度80℃、pH8.0、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比5∶2的条件下，不同反应时间对磷酸根含量的影响结果如图3所示。
图3 反应时间对磷酸根含量的影响
Fig.3 Effects of reaction time on phosphate content
由图3可知，当反应时间为1 h～4 h时，磷酸根含量随反应时间延长而增加。这可能是由于适当延长反应时间，磷酸化试剂与桦褐孔菌多糖分子的接触更充分，使得桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量增加。当反应时间在4 h～6 h时，磷酸根含量呈现下降的趋势，这可能是因为桦褐孔菌多糖在高温下发生焦化作用[20]，从而使其多糖中磷酸根含量下降。当反应时间为4 h时，桦褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量最高，达到9.14%。因此选择反应时间为3、4、5 h进行后续试验。
2.1.4 pH值对磷酸根含量的影响
在反应温度60℃、反应时间3 h、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比5∶2的条件下，不同pH值对磷酸根含量的影响结果如图4所示。
图4 pH值对应的磷酸根含量
Fig.4 Effects of pH value on phosphate content
由图4可知，当pH值为6～9时，桦褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量随pH值的升高而增加。这是因为三聚磷酸钠和三偏磷酸钠在酸性条件下分解成焦磷酸钠和正磷酸钠，pH值的升高，为磷酸化试剂与桦褐孔菌多糖反应提供了适当的碱性环境，故桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量增加。当pH值为9～10时，桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根的含量随pH值升高而逐渐下降，这是因为pH值过高会对整个反应的酯化过程产生不可逆的副作用。当pH值为9时，桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量达到最高，为9.58%。因此选择pH值为8、9、10进行后续试验。
2.2 响应面分析法优化桦褐孔菌多糖磷酸化修饰的工艺条件
2.2.1 回归模型的建立及方差分析
响应面试验设计与结果见表2，回归模型方差分析结果见表3。
表2 响应面分析设计及结果
Table 2 Design and results of response surface analysis
试验号 A三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比磷酸根含量/%1 1-1 0 0 7.93 B反应温度 C pH值 D反应时间2 0 1 -1 5.84 3 0 0 0 0 9.83 0 4-1 -1 0 8.35 5 0-1 0 1 7.91 0 6 1 0 -1 5.75 7 0 0 0 0 10.38 0-1 -1 0 0 8.08 9-1 0 -1 0 9.33 10 1 0 0 -1 8.33 11 0 0 0 0 10.23 12 1 1 0 0 6.53 13 0 -1 1 0 8.13 14 0 -1 0 -1 7.59 15 -1 0 0 1 8.75 16 0 0 0 0 10.25 17 -1 0 1 0 7.02 18 0 0 0 0 9.79 19 -1 0 0 -1 7.38 20 -1 1 0 0 6.82 21 0 0 -1 1 8.59 22 0 1 -1 0 7.58 23 0 1 1 0 5.61 24 1 0 0 1 7.99 25 1 0 1 0 6.97 26 0 1 0 1 5.85 27 0 0 1 1 6.84 28 0 0 -1 -1 8.45 29 1 0 -1 0 8.86 8
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：* 差异显著，P＜0.05；** 差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 51.56 14 3.68 24.32 ＜0.000 1 **A三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比0.049 1 0.049 0.33 0.576 9 B反应温度 8.04 1 8.04 53.08 ＜0.000 1 **C pH值 9.58 1 9.58 63.25 ＜0.000 1 **D反应时间 0.56 1 0.56 3.69 0.075 3 AB 0.004 9 1 0.004 9 0.032 0.859 8 AC 0.044 1 0.044 0.29 0.597 9 AD 0.73 1 0.73 4.83 0.045 3 *BC 0.74 1 0.74 4.88 0.044 2 *BD 0.012 1 0.012 0.080 0.781 5 CD 0.18 1 0.18 1.22 0.287 7 A2 4.37 1 4.37 28.84＜0.000 1 **B2 21.00 1 21.00 138.69＜0.000 1 **C2 8.13 1 8.13 53.67 ＜0.000 1 **D2 12.90 1 12.90 85.67＜0.000 1 **残差 2.12 14 0.15失拟项 1.83 10 0.18 2.56 0.189 5不显著纯误差 0.29 4 0.072总和 53.68 28
根据Design-Expert V8.0.6软件分析，得到桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量（Y）与自变量之间的回归方程：Y=10.10-0.064A-0.82B-0.89C+0.22D-0.035AB+0.11AC-0.43AD-0.43BC-0.055BD+0.21C-0.82A2-1.80B2-1.12C2-1.4D2。
由表3可知，本试验回归模型P＜0.01，表明该模型影响极显著。而失拟项P＞0.05，模型差异不显著，说明理论值与实际值有良好的关联性，该方法优化桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺是准确可靠的。由F值可知，各因素对桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影响的大小顺序为pH值＞反应温度＞反应时间＞三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比。
2.2.2 响应面分析与优化
利用Design-Expert V8.0.6进行优化，按照方程模型可得到桦褐孔菌多糖磷酸化修饰的最优工艺参数：三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比为5.93∶0.07，反应温度为73.16℃，反应时间为4.06 h，pH值为8.64，在此条件下，桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量为10.34%。考虑到反应的实际条件，则将参数调整为三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量比为6∶1，反应温度75℃，反应时间4 h，pH值为8.6。在此条件下进行验证试验，对桦褐孔菌多糖进行磷酸化修饰，测得桦褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量为9.58%，与该回归方程模型的预测值接近。
各因素交互作用的响应面图见图5和图6。响应曲面坡度越陡峭，说明交互作用影响越大，反之影响越小[21]。
图5 三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比与反应时间交互作用
Fig.5 The interaction between mass ratio of sodium tripolyphosphate and sodium trimetaphosphate and reaction time
图6 反应温度与pH值交互作用
Fig.6 The interaction between reaction temperature and pH value
由图5可知，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比与反应时间交互作用的响应曲面坡度较为陡峭，等高线图接近椭圆形，说明该交互作用对桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影响显著，与方差分析结果一致。由图6可知，反应温度和pH值交互作用的响应曲面坡度较为陡峭，等高线图接近椭圆形，说明该交互作用对桦褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影响显著，与方差分析结果一致。
3 结论
在单因素试验基础上，通过响应面法对桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺进行优化，确定最佳工艺条件：三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的质量比为6:1，反应温度为75℃，反应时间为4 h，pH值为8.6。选用此工艺参数进行验证试验，测得磷酸根含量为9.58%，与理论值接近，充分验证了模型的准确性。本文可为桦褐孔菌多糖磷酸化修饰工艺研究，以及后续的桦褐孔菌多糖磷酸化衍生物的开发提供一定的参考依据。
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