黄芪为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus var.mongholicus） 或膜荚黄芪（Astragalus membranaceus）的干燥根[1]，其味甘，微温，无毒，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌等功效，可煎服、生用或蜜炙用，食药用历史非常悠久，在我国应用比较广泛，畅销于国内外[2-3]。目前已从黄芪中分离鉴定出200多种成分，其中多数为皂苷、多糖和黄酮类，具有抗氧化、抗肿瘤和提高免疫力等活性[4]。研究表明，黄芪水提物可通过诱导超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）和自由基水平发挥抗氧化作用[5]。
黑木耳（Auricularia heimuer）又称木耳、黑菜等，子实体味道鲜美，富含胶质和多种营养成分，是一种既可食用又可药用的大型真菌[6-7]。目前，对黑木耳中的多糖、蛋白质、黄酮类、多酚类和黑色素等活性成分均有研究，其中多糖为含量最高的成分，可显著提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性并显著降低乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD）活性和丙二醛（MDA）含量，并能清除自由基，且具有抗衰老、抗癌、清除自由基、降低血糖浓度、增强免疫力、护肝、止咳化痰等作用[8-10]。
我国黑木耳资源比较丰富，开发和利用黑木耳有很大的前景。黑木耳液体深层发酵相对子实体的培养，具备菌丝生长快、生产周期短的优势，且发酵出来的菌丝菌龄大都一致，也有成本低、效率高、易于工业应用等诸多优点[11]。近年来，人们开始探索用生物活性物质和微量元素研发复合基质培养食用菌，通过科学方法和特殊工艺培育具有保健功能成分的菌类产品。文献表明，在发酵培养基中添加刺五加、天麻等生物活性成分或硒等微量元素，可促进黑木耳菌丝的生长和活性物质产生，并增强其生物活性[12-14]。目前，黄芪对黑木耳液体发酵影响的相关研究较少，仅张劲松等[15]研究了黄芪水提物对包括黑木耳在内的5种食用菌菌丝体生长的影响，深层发酵基质中添加黄芪后黑木耳菌丝体的生长状况、活性成分和抗氧化能力的变化未见报道。因此，本试验以黑木耳作为研究对象，在其发酵基质中添加黄芪水提物，探索其对黑木耳菌丝体生长、活性成分含量和抗氧化活性的影响，为新型功能性食药用菌产品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄芪：山西省浑源县的蒙古黄芪主根；黑木耳菌种（雪梅三号）：保存于山西省农科院农业资源与经济研究所。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率检测试剂盒、羟基自由基测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；亚硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、酵母浸膏、水杨酸：天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇、硝酸铝、硫酸镁、磷酸二氢钾：天津市风船化学试剂科技有限公司；黄芪甲苷、槲皮素：北京北方伟业化工技术研究院；没食子酸：成都市科龙化工试剂厂；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；香草醛、四氯苯醌、苯酚、氯化铁：南京化学试剂股份有限公司；福林酚试剂：北京索莱宝科技有限公司；硫酸亚铁：无锡市晶科化工有限公司；过氧化氢：天津市东方广诚医药化工有限公司；三氯乙酸：天津市光复精细化工研究所；铁氰化钾：国药集团化学试剂有限公司；无水氯化亚铁：上海依赫生物科技有限公司；氢氧化钠：天津市大陆化学试剂厂；亚铁嗪、硼氢化钠：美国Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限公司；维生素B1：天津力生制药股份有限公司。所用试剂均为分析纯。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、硫酸镁0.2%、磷酸二氢钾0.2%、琼脂2%。
液体种子培养基：黄豆芽汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、酵母浸膏0.5%、硫酸镁0.1%、维生素B10.01%，pH自然。
1.2 仪器与设备
超净工作台（SW-GJ-1FD）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温振荡培养箱（BS-S）：国华电器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：江苏金坛市环宇科学仪器厂；真空冷冻干燥机（Christ ALPHA 2-4 LD plus）、电热恒温鼓风干燥箱（HG-9040S）：浙江宁波东南仪器有限公司；紫外分光光度计（721型）：上海精密科学仪器有限公司；高速多功能粉碎机（L-500A型）：浙江省永康市松青五金工具厂。
1.3 方法
1.3.1 黄芪水提物的制备
黄芪主根切片、干燥、粉碎，过60目筛后，按照料液比1∶10（质量比）加入蒸馏水，搅拌沸煮1 h，冷却后用4层纱布过滤，收集滤液，重复沸煮过滤两次，合并滤液，减压浓缩至适当体积，分装置于-20℃冰箱18 h，于冷冻干燥机内冻干，用研钵研成粉末，过筛，即得黄芪水提物干粉，置于-20℃冰箱备用。
1.3.2 黑木耳菌种的活化
配制PDA固体培养基，灭菌1.5 h后趁热倒入平板，冷却至水汽消失，接种黑木耳菌种，培养一段时间，每天观察菌种生长情况，选择长势良好的菌种用于后续试验。
1.3.3 添加黄芪水提物的黑木耳菌丝体生长情况测定
1.3.3.1 平板培养
精密称取4 g黄芪水提物干粉溶于20 mL双蒸水中，配制成0.2 g/mL的黄芪水提物母液备用。在50 mL的锥形瓶中分别添加黄芪水提物母液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL，再向锥形瓶中加入热的PDA培养基至40 mL，摇匀，配制成黄芪水提物浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的培养基。高压蒸汽灭菌90 min后趁热倒入平板，每个浓度3次重复，冷却，待培养基水汽消失后用6 mm2打孔器接入活化好的黑木耳菌种。连续培养6 d后，记录菌落直径，计算菌丝平均生长速率。平均生长速率/（mm/d）=（菌落直径-接种菌饼直径）÷培养时间。
1.3.3.2 深层培养
锥形瓶中放入黄芪水提物浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的液体种子培养基 45 mL，在每个锥形瓶中加入5 mL培养好的黑木耳液体深层发酵母液，3次重复，在恒温培养箱温度28℃、转速100 r/min下培养7 d后，将所得深层发酵液于离心机中3 500 r/min离心20 min，弃上清，用洗瓶摇洗、离心2次，将沉淀置恒温鼓风干燥箱中60℃干燥至恒重，称重并计算菌丝体干重。
1.3.4 添加黄芪水提物深层发酵黑木耳菌丝体的制备
1.3.4.1 黑木耳深层发酵母液的制备
配制液体种子培养基，接入活化的黑木耳菌种，28℃下以转速100 r/min恒温振荡培养7 d，得到黑木耳深层发酵母液。
1.3.4.2 添加黄芪水提物的深层发酵
配制50 mg/mL溶解于液体种子培养基的黄芪水提物母液。锥形瓶中加入80 mL液体种子培养基，然后处理组添加10 mL黄芪水提物母液，使其终浓度达到5 mg/mL，对照组添加10 mL液体种子培养基，2次重复，蒸汽灭菌，冷却后各加入10 mL黑木耳深层发酵母液，置恒温振荡培养箱中，28℃下以转速100 r/min培养7 d。
1.3.4.3 菌丝体干粉及待测溶液的制备
将培养好的处理组和对照组黑木耳深层发酵液分别于3 500 r/min离心20 min，弃上清，用洗瓶摇洗、离心2次后，将沉淀置恒温鼓风干燥箱中60℃干燥至恒重，研磨称重，密封保存于-20℃冰箱。
测定活性成分含量时，将菌丝体干粉从冰箱取出静置至室温后进行。精密称取菌丝体干粉，用50%甲醇[固液比 1∶10（g/mL）]浸提 1 h，离心收集上清液，用双蒸水稀释得到 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、25.0 mg/mL的菌丝体抗氧化活性待测溶液。
1.3.5 菌丝体活性成分含量的测定
总皂苷测定采用浓硫酸/香草醛法[2]，标准品为黄芪甲苷；总黄酮测定采用硼氢化钠/四氯苯醌法[16]，标准品为槲皮素；总酚酸测定采用福林酚法[17]，标准品为没食子酸；多糖的提取采用醇析法[18]，测定采用硫酸/苯酚法[19]，标准品为葡萄糖。
1.3.6 黑木耳菌丝体抗氧化活性的测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除能力
配制所需浓度的菌丝体溶液。配制25 mg/L的DPPH-乙醇溶液。按试剂盒说明书所示添加试剂，摇匀，避光静置1.5 h，在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率的按下式计算。
式中：As为添加DPPH和待测样品的混合液的吸光度；Ar为添加无水乙醇和待测样品的混合液的吸光度；A0为添加DPPH和无水乙醇的混合液的吸光度。
1.3.6.2 羟基自由基清除能力
配制所需浓度的菌丝体溶液。配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液。取16支10 mL EP管，先在各管中加入1 mL FeSO4溶液和2 mL水杨酸-乙醇溶液，然后加入2 mL样品（以双蒸水作空白对照），混匀，再加入2 mL H2O2溶液，室温（25℃）反应1 h，在510 nm处测其吸光度。羟基自由基清除率按下式计算。
式中：Aa为添加待测样品和H2O2溶液的混合液的吸光度；Ab为添加待测样品和双蒸水的混合液的吸光度；Ac为添加H2O2溶液和双蒸水的混合液的吸光度。
1.3.6.3 还原力
配制所需浓度的菌丝体溶液。配制0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）、1%铁氰化钾、10%三氯乙酸和0.1%氯化铁溶液。取21支2.5 mL EP管，在各管中加入0.2 mL菌丝体溶液（以双蒸水为空白对照）、0.5 mL磷酸缓冲液和0.5 mL铁氰化钾溶液，50℃水浴20 min，加0.5 mL三氯乙酸溶液，静置反应20 min，再加入0.5 mL氯化铁溶液，静置10 min，测定700 nm处的吸光度。
1.3.6.4 亚铁离子螯合能力
配制所需浓度的菌丝体溶液。配制2 mmol/L FeCl2溶液和5 mmol/L亚铁嗪溶液。先在各管中加入0.5 mL样品（以双蒸水作空白对照）和0.1 mL FeCl2溶液，混匀后反应5 min，然后再加入0.1 mL亚铁嗪溶液，静置10 min，最后在562 nm处测定吸光度。亚铁离子螯合率按下式计算。
式中：A0为空白对照的吸光度；A1为待测样品的吸光度。
1.4 数据统计分析
各试验设3个重复，结果表示为平均值±标准差；用Duncan's多重比较检验各个处理数据间的差异显著性；用GraphPad Prism 8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 黄芪水提物对深层培养黑木耳菌丝生长的影响
不同黄芪水提物浓度下黑木耳菌丝体生长情况见图1。
图1 不同黄芪水提物浓度下黑木耳菌丝体生长情况
Fig.1 Mycelial growth of A.heimuer treated with different concentrations of A.membranaceus aqueous extract
同一指标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
添加不同浓度黄芪水提物后，平板培养和深层培养中黑木耳菌丝的生长情况均出现明显差异。由图1（I）可见，平板培养中各处理黑木耳菌丝为白色丝状，黄芪水提物的添加不影响菌丝颜色；菌落近圆形。如图1（II）所示，菌丝体平均生长速率和干重在黄芪水提物浓度为2.5 mg/mL时最大，在5.0 mg/mL时次之，随后在5.0 mg/L～30.0 mg/mL内随黄芪水提物浓度的升高而呈减小趋势。平板培养中，菌丝的致密度则随黄芪水提物浓度的升高而增大，在黄芪水提物浓度为0和2.5 mg/mL时较稀疏，在5.0 mg/mL～30.0 mg/mL时较致密。深层培养7 d后，与对照组相比，黄芪水提物浓度在2.5 mg/mL～10.0 mg/mL时能极显著促进黑木耳菌丝体生长（P＜0.01），在15.0 mg/mL时菌丝体干重与对照组差异不显著（P＞0.01），在 20.0 mg/mL～30.0 mg/mL时抑制了菌丝体生长，菌丝体干重极显著低于对照（P＜0.01）。
由图1可知，在黄芪水提物添加浓度为2.5 mg/mL和5.0 mg/mL时，可显著促进黑木耳菌丝的生长，也可使黄芪水提物对菌落大小和菌丝致密度的提升作用发挥到最大，两个浓度对菌丝体平均生长速率和干重的影响差异不显著（P＞0.01），且较高的添加浓度还可使更多的黄芪活性物质进入培养基，有利于活性物质向菌丝体的迁移转化。故而本研究采用5.0 mg/mL作为后续黑木耳深层发酵中黄芪水提物的添加浓度。
2.2 黄芪水提物对深层培养黑木耳菌丝体活性成分含量的影响
黄芪水提物对深层培养黑木耳菌丝体活性成分含量的影响见表1。
表1 黑木耳深层发酵菌丝体活性成分含量
Table 1 Contents of active compounds in A.heimuer mycelia in submerged fermentation supplemented with A.membranaceus aqueous extract
注：同列字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
项目胞外多糖/（mg/mL）胞内多糖/（mg/g）总酚酸/（mg/g）总黄酮/（mg/g）总皂苷/（mg/g）培养液添加黄芪水提物 4.15±0.63A 192.85±8.87A 3.52±0.93A 2.97±0.16A 1.61±0.10A常规培养液 2.21±0.34B 156.07±4.15B 1.33±0.18B 1.85±0.22B 0.87±0.04B增量 1.94 36.78 2.19 1.12 0.74
由表1可见，添加黄芪水提物深层发酵后，黑木耳菌丝体中的活性成分含量均有不同程度的提高。其中胞内多糖的增加最为明显，增量达到36.78 mg/g，其次为总酚酸、胞外多糖和总黄酮，说明黄芪水提物对这些成分的影响较大。相比之下，添加黄芪水提物深层发酵后黑木耳总皂苷的增量较小。
2.3 黄芪水提物对深层培养黑木耳菌丝体抗氧化活性的影响
2.3.1 DPPH自由基清除能力
黑木耳菌丝体的DPPH自由基清除能力见图2。
图2 黑木耳菌丝体的DPPH自由基清除能力
Fig.2 DPPH·scavenging capacity of A.heimuer mycelia
同一浓度字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
如图2所示，黑木耳菌丝体对DPPH自由基的清除率随着其浓度的增加而升高。添加黄芪水提物共发酵的黑木耳菌丝体（M1）与常规深层发酵黑木耳菌丝体（M0）清除DPPH自由基的50%效应浓度（EC50值）分别为8.30 mg/mL和20.77 mg/mL。在试验浓度范围内，M1的DPPH自由基清除率与对照M0相比极显著增强（P＜0.01），在菌丝体浓度为 12.5 mg/mL 时，M1与M0的DPPH自由基清除率差异最大，是M0的2.27倍，表明培养基中添加黄芪水提物发酵可显著促进黑木耳菌丝体DPPH自由基的清除能力。
2.3.2 羟基自由基清除能力
黑木耳菌丝体的羟基自由基清除能力见图3。
图3 黑木耳菌丝体的羟基自由基清除能力
Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of A.heimuer mycelia
同一浓度大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
如图3所示，经常规深层发酵或添加黄芪提取物的深层发酵后，黑木耳菌丝体均对羟基自由基有一定的清除能力，其清除率随着菌丝体浓度的增加而变大。M1与对照M0清除羟基自由基的EC50值分别为16.55 mg/mL和27.14 mg/mL。在菌丝体浓度为7.5 mg/mL～25.0 mg/mL时，羟基自由基清除率极显著提高（P＜0.01），其中在浓度为10.0 mg/mL时，M1与M0的羟基自由基清除率差异最大，是M0的1.38倍，说明黄芪提取物的添加可显著提高深层发酵黑木耳菌丝体羟基自由基的清除能力。
2.3.3 还原力
黑木耳菌丝体的还原力见图4。
图4 黑木耳菌丝体的还原力
Fig.4 Reducing capacity of A.heimuer mycelia
同一浓度大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
从图4可见，随着黑木耳菌丝体浓度的增加，还原力（OD700nm）逐渐增加，呈一定的量效关系。还原力为0.5时，M1与对照M0的浓度分别为17.25 mg/mL和20.91 mg/mL。添加黄芪提取物发酵后，在5.0 mg/mL～25.0 mg/mL浓度内M1与M0的还原力有显著差异（P＜0.05），其中在浓度为5.0 mg/mL时差异最大，M1还原力是M0的1.58倍，说明添加黄芪提取物发酵对深层发酵黑木耳的还原力有一定的提高作用。
2.3.4 亚铁离子螯合能力
黑木耳菌丝体的亚铁离子螯合能力见图5。
图5 黑木耳菌丝体的亚铁离子螯合能力
Fig.5 Ferrous ion chelating capacity of A.heimuer mycelia
同一浓度字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
如图5所示，经常规深层发酵或添加黄芪提取物的深层发酵后，黑木耳菌丝体均具有较强的亚铁离子螯合能力，并表现出明显的量效关系。M1与对照M0螯合亚铁离子的EC50值分别为10.01mg/mL和26.94mg/mL。可见，添加了黄芪提取物发酵后，M1亚铁离子螯合能力显著提高，在菌丝体浓度为5.0 mg/mL时差异最大，是M0的1.97倍，说明添加黄芪水提物可促进深层发酵黑木耳菌丝体亚铁离子螯合能力的提高。
3 讨论与结论
本试验发现，当培养液中黄芪水提物的浓度为2.5 mg/mL～5.0 mg/mL时，对黑木耳菌丝生长的促进作用最大，菌丝体干重最高，之后继续增加黄芪水提物浓度，对菌丝生长的促进作用不再明显，在高浓度范围内，菌丝生长反而受到抑制。这一结果与已有报道一致。陈丽华等[20]研究了丹参、绞股蓝、决明子、红曲、银杏叶、何首乌、葛根和苦荞对黑木耳液体培养生物量的影响，认为它们中存在对黑木耳的生长具有促进和抑制作用的两种因子，促进因子使其菌丝体干重增加，而浓度的提高使抑制因子的作用增强，从而导致菌丝体干重下降。至于其中促进因子和抑制因子的具体成分，及其影响黑木耳菌丝生长的作用机理有待进一步研究。
据张劲松等[21]报道，添加黄芪水提物可显著提高深层发酵香菇菌丝体中的活性成分，其胞外多糖、胞内多糖、总酚酸、总黄酮和总皂苷含量分别为常规发酵对照的 1.16、1.09、1.66、1.25、2.20 倍。本试验也有类似发现，添加5 mg/mL黄芪水提物后，深层发酵黑木耳菌丝体中的活性成分含量显著增加，其胞外多糖、胞内多糖、总酚酸、总黄酮和总皂苷含量分别为对照的1.88、1.24、2.65、1.61、1.85 倍。可见，黄芪水提物能够促进深层发酵食药用菌活性成分的合成与积累。此外，添加5.0 mg/mL黄芪水提物后，深层发酵黑木耳菌丝体的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、还原力和亚铁离子螯合率分别为常规发酵对照菌丝体的2.27、1.38、1.58、1.97倍。该结果也与其他学者的报道类似，张颖等[14]研究了刺五加固体栽培基质对黑木耳子实体营养成分及其多糖化学组成、抗氧化性的影响，发现刺五加的添加明显提高了黑木耳的营养成分和多酚含量，并改变了黑木耳单糖组成比例，其对氧自由基和ABTS+自由基的清除能力也分别提高了3.2倍和2.7倍。值得一提的是，在其他食药用菌的培养基质中添加生物活性物质也取得相似的效果。如辛燕花等[22]报道，添加何首乌深层发酵后，灵芝菌丝体中多糖、总三萜和黄酮含量分别是对照的2.0、1.5倍和3.2倍；灵芝菌丝体中还原力、超氧阴离子自由基清除率和羟基自由基清除率分别是对照的4.5倍、1.5倍和2.0倍。由此可见，培养基质中添加生物活性物质，改变了黑木耳等食用菌化学成分的合成代谢途径，从而促进了其生物量、活性物质含量和功能的提升。
本试验结果表明，黄芪水提物的添加可促进深层发酵黑木耳菌丝体的生长，并可提升其活性物质含量和抗氧化活性。本研究可为黄芪的开发利用及新型食药用菌产品的研发提供参考。后续可在黄芪添加对黑木耳和其他食药用菌子实体的形成、生产性能、化学成分、生物活性的影响方面展开深入研究。
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