红参为人参（Panax Ginseng C.A.Meyer）栽培品经蒸制后的干燥根和根茎[1]，除了含有常规皂苷，还产生了 Rg3、20（R）-Rg2、Rg5[2]、Rg6 等特有皂苷[3]。在药用价值方面，红参可以作为哮喘、阿尔兹海默症和预防结肠炎相关癌症的潜在治疗药物[4-6]。而在食品领域，红参产品也日趋丰富，如红参多糖饮料[7]、拐枣子红参压片[8]和红参石榴胶原蛋白肽复合饮品[9]等。
酸奶是以牛奶为原料，经巴氏杀菌后发酵制成的一款乳制品，具有改善睡眠[10]、缓解原发性高血压[11]、维护肠道菌群生态平衡[12]、提升免疫力[13]和延缓衰老[14]等功效。此外，由于益生菌对原料乳中乳糖和蛋白质的转化及分解，不仅提高了营养物质的消化利用率而且增加了VB2、VB6等次生代谢产物[15-16]。
为提高酸奶的保健价值，促进中草药在食品领域的应用，本研究将红参与牛乳结合研制红参酸乳，采用Plackett-Burman试验和响应面试验确定红参酸乳的最佳工艺，以期为促进红参在食品领域的应用与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红参（四年生）、白砂糖、牛奶：市售；菌粉（10菌型）：昆山佰生优生物科技有限公司。
无水乙醇、冰乙酸、浓硫酸、酒石酸钾钠、氯化钠硼酸、盐酸、乙酸锌、硫酸钾、亚铁氰化钾、氢氧化钠、硫酸铜（均为分析纯）：北京化工厂；MRS培养基、MC培养基：青岛海博生物技术有限公司；改良MRS培养基配套试剂：广东环凯微生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：安徽天地高纯溶剂有限公司。
1.2 仪器与设备
全自动凯氏定氮仪（K9860）：山东海能科学仪器有限公司；电子天平（AUY220）、可见分光光度计（UV-1700）：日本岛津仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（ZX-9070MBE）：上海博迅实业有限公司；电热数显恒温水浴锅（DK-S28）：上海精宏试验设备有限公司；高压蒸汽灭菌锅（GI54DWS）：厦门致微仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260 infinityⅡ）：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
纯牛奶→60℃预热→添加白砂糖和红参粉→均质（均质袋）→60℃灭菌30 min→冷却→添加菌粉→恒温发酵→4℃，后熟12 h→成品
1.3.2 单因素试验
在前期试验的基础上，确定纯牛奶300 mL，选取不同红参粉添加量（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 g）、菌粉添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）、白砂糖添加量（6、12、18、24、30、36 g）、发酵时间（4、6、8、10、12、14 h）及发酵温度（35、37、39、41、43、45 ℃）进行单因素试验，采用主成分分析法对脂肪、酸度、持水力、蛋白质、蔗糖、嗜热链球菌、双歧杆菌、乳杆菌、感官评分共9个指标进行综合分析，确定发酵条件。
1.3.3 Plackett-Burman试验
将菌粉添加量、白砂糖添加量、红参粉添加量、发酵时间和发酵温度作为考察因素，感官评分作为响应值，进行Plackett-Burman试验设计见表1。
表1 Plackett-Burman试验因素水平
Table 1 Plackett-Burman test factor level
水平 A'发酵时间/h E'白砂糖添加量/g-1 4 37 7.5 1.0 12 1 8 41 10.5 2.0 24 B'发酵温度/℃C'红参粉添加量/g D'菌粉添加量/g
1.3.4 响应面试验
以单因素试验和Plackett-Burman试验为基础，选择因素A、B和C作为自变量，感官评分（Y）作为因变量进行响应面试验（Box-Behnken）设计见表2。
表2 Box-Behnken试验因素水平
Table 2 Box-Behnken test factor level table
水平 A发酵时间/h B红参粉添加量/g C菌粉添加量/g-1 4 7.5 1.0 0 6 9.0 1.5 1 8 10.5 2.0
1.3.5 红参酸乳品质评价
将相同条件下未添加参粉的酸乳作为对照（CK），与红参酸乳进行品质对比，测定指标包括人参皂苷、脂肪和蛋白质等。
1.3.5.1 指标测定
脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[17]；蔗糖含量测定参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》[18]；酸度参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[19]；蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[20]；非脂乳固体含量测定参照GB 5413.39—2010《食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定》[21]；微生物测定参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物检验乳酸菌检验》[22]；人参皂苷测定采用超声提取-高效液相色谱法[23]。
1.3.5.2 感官评价
选10位同学对红参酸乳的色泽、组织状态和滋味、气味进行综合评分[24]，取均值，具体标准见表3。
表3 红参酸奶感官评分标准
Table 3 Sensory score criteria of red ginseng yogurt
项目 评分标准 得分色泽（30） 与红参粉相符的黄白色，色泽均匀 21～30淡黄白色，色泽不匀 11～20乳白色，不具备参粉色泽 ≤10组织状态（30） 组织均匀、黏稠度好，无乳清析出 21～30组织较均匀、黏稠度适中，少量乳清析出 11～20组织不匀，黏稠度差，大量乳清析出 ≤10滋味、气味（40） 酸甜适宜，具有红参粉的滋味气味 31～40酸甜适宜但微苦，有轻微颗粒感，但可接受 21～30酸甜失衡，口感粗糙 11～20不具备参粉的滋味气味 ≤10
1.4 数据分析
利用 IBM SPSS Statistics 25.0、Design-Expert 8.0.6、WPS Office等软件进行数据分析及图表绘制。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 菌粉添加量的确定
主成分分析是利用降维的方式，旨在将多个指标转化为少数综合指标的一种多变量数据最佳综合简化方法[25]。不同菌粉添加量主成分分析结果见表4。
表4 不同菌粉添加量综合指标系数及贡献率
Table 4 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different bacterial powder
生化指标 主成分1 2 3脂肪 -0.02 0.39 0.07酸度 -0.06 -0.03 0.30持水力 0.21 -0.13 0.17蛋白质 -0.24 0.06 0.16蔗糖 -0.30 0.02 0.01嗜热链球菌 0.18 0.08 -0.45双歧杆菌 0.23 -0.12 0.32乳杆菌 0.09 0.37 -0.08感官 0.11 0.26 0.36特征值 3.35 2.55 1.68贡献率/% 37.18 28.37 18.71累积贡献率/% 37.18 65.55 84.26
由表4可知，主成分1、主成分2和主成分3的贡献率分别为37.18%、28.37%、18.71%，累积贡献率达到84.26%，其特征值分别为3.35、2.55和1.68。综合评价值（D值）见图1。
图1 不同菌粉添加量的综合评价值
Fig.1 Comprehensive evaluation value of different bacterial powder supplemental levels
如图1所示，不同菌粉添加量的最高综合评价值为0.66，因此确定1.5 g为适宜菌粉添加量。
2.1.2 白砂糖添加量的确定
不同白砂糖添加量主成分分析结果见表5，综合评价值（D值）见图2。
表5 不同白砂糖添加量综合指标系数及贡献率
Table 5 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different white sugar powder
生化指标 主成分1 2脂肪 -0.16 -0.15酸度 0.18 0.12持水力 -0.15 0.30蛋白质 0.14 0.14蔗糖 0.05 0.30嗜热链球菌 0.17 -0.22双歧杆菌 -0.18 -0.13乳杆菌 0.09 -0.40感官 0.20 0.09特征值 4.88 2.13贡献率/% 54.26 23.62累积贡献率/% 54.26 77.88
图2 不同白砂糖添加量综合评价值
Fig.2 Comprehensive evaluation value of different addition amounts of granulated sugar
由表5可知，主成分1和主成分2的累积贡献率为77.88%，其中主成分1的贡献率所占比重较大为54.26%。如图2所示，18 g白砂糖所对应综合评价值最大，故选择18 g为适宜白砂糖添加量。
2.1.3 发酵时间的确定
不同发酵时间主成分分析结果表6，综合评价值（D值）见图3。
表6 不同发酵时间综合指标系数及贡献率
Table 6 Different fermentation time comprehensive indicator coefficient and contribution rate
生化指标 主成分1 2 3脂肪 -0.13 0.32 -0.06酸度 0.10 -0.31 -0.01持水力 0.04 -0.01 -0.53蛋白质 0.18 0.25 0.14蔗糖 -0.14 -0.04 0.45嗜热链球菌 0.19 0.23 -0.09双歧杆菌 0.25 0.09 0.02乳杆菌 0.22 0.02 0.31感官 0.23 -0.20 -0.01特征值 3.62 2.74 1.62贡献率/% 40.25 30.43 18.04累积贡献率/% 40.25 70.68 88.72
图3 不同发酵时间综合评价值
Fig.3 Comprehensive evaluation value of different fermentation time
由表6可知，主成分1的贡献率和特征值分别为40.25%、3.62，主成分2的贡献率和特征值分别为30.43%、2.74，主成分3的贡献率和特征值分别为18.04%、1.62。如图3所示，最大综合评价值为0.95，故适宜发酵时间为6 h。
2.1.4 发酵温度的确定
不同发酵温度主成分分析结果见表7，综合评价值（D值）见图4。
由表7可知，主成分1和主成分2的累积贡献率为75.39%，解释了75%以上的信息。结合主成分1和2可知，发酵温度对酸度、感官、乳杆菌和双歧杆菌影响较大。如图4所示，选择最大综合评价值所对应的39℃为适宜发酵温度。
表7 不同发酵温度综合指标系数及贡献率
Table 7 Different fermentation temperature comprehensive indicator coefficients and contribution rates
生化指标 主成分1 2脂肪 0.18 -0.15酸度 0.09 0.25持水力 -0.16 -0.15蛋白质 0.09 -0.37蔗糖 0.19 -0.10嗜热链球菌 0.19 0.18双歧杆菌 0.21 0.12乳杆菌 0.10 0.21感官 -0.15 0.30特征值 4.49 2.29贡献率/% 49.90 25.49累积贡献率/% 49.90 75.39
图4 不同发酵温度综合评价值
Fig.4 Comprehensive evaluation value of different fermentation temperatures
2.1.5 红参粉添加量的确定
不同红参粉添加量主成分分析结果见表8，综合评价值（D值）见图5。
图5 不同红参粉添加量综合评价值
Fig.5 Comprehensive evaluation value of different red ginseng powder supplemental levels
表8 不同红参粉添加量综合指标系数及贡献率
Table 8 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different red ginseng powder
生化指标 主成分1 2脂肪 0.16 0.24蔗糖 0.16 0.22酸度 0.14 -0.17持水力 -0.10 0.34
续表8 不同红参粉添加量综合指标系数及贡献率
Continue table 8 Comprehensive index coefficient and contribution rate of different red ginseng powder
生化指标 主成分1 2蛋白质 0.16 0.20嗜热链球菌 -0.14 0.27双歧杆菌 -0.15 0.23乳杆菌 0.12 -0.11感官 -0.15 -0.25特征值 5.42 2.01贡献率/% 60.26 22.37累积贡献率/% 60.26 82.64
由表8可知，主成分1的贡献率和特征值分别为60.26%和5.42；主成分2的贡献率和特征值分别为22.37%和2.01。由图5可知，不同红参粉添加量的最大综合评价值为0.76，故适宜红参粉添加量为9.0 g。
2.2 Plackett-Burman试验
在单因素试验的基础上进行Plackett-Burman试验，结果见表9、表10。
表9 Plackett-Burman试验结果
Table 9 Plackett-Burman test results
序号 A'发酵时间感官评分1 -1 -1 -1 1 -1 71.4 2 1 1 -1 1 1 77.8 3 -1 -1 1 -1 1 68.6 4 -1 1 1 -1 1 65.9 5 -1 1 -1 1 1 76.6 6 1 -1 1 1 -1 74.1 7 1 -1 -1 -1 1 75.1 8 -1 -1 -1 -1 -1 72.2 9 1 1 1 -1 -1 73.3 10 1 -1 1 1 1 71.2 11 -1 1 1 1 -1 74.0 12 1 1 -1 -1 -1 77.2 B'发酵温度C'红参粉添加量D'菌粉添加量E'白砂糖添加量
表10 Plackett-Burman方差分析
Table 10 Variance analysis of Plackett-Burman
注：*表示影响显著（P<0.05）。
来源 平方和 df 均方值 F值 P值模型 108.33 5 21.67 4.63 0.044 5*A'发酵时间 33.33 1 33.33 7.13 0.037 1*B'发酵温度 12.40 1 12.40 2.65 0.154 6 C'红参粉添加量 44.85 1 44.85 9.59 0.021 2*D'菌粉添加量 13.65 1 13.65 2.92 0.138 4 E'白砂糖添加量 4.08 1 4.08 0.87 0.386 2残差 28.07 6 4.68总和 136.40 11
由表10可知，该模型显著（P<0.05），表明建立模型有意义。结合F值和P值可知，红参粉添加量和发酵时间对酸乳的感官评分影响显著，而菌粉添加量、发酵温度和白砂糖添加量未达到显著影响，表明其对于酸乳感官评分影响较小。因此结合单因素试验及F值、P值大小，综合选择A′、C′和D′共3个因素进行响应面设计。
2.3 响应面试验
2.3.1 响应面试验结果
结合上述试验，将感官评分作为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验（Box-Behnken）。试验结果见表11、表12。
表11 Box-Behnken试验结果
Table 11 Box-Behnken test results
试验号 A发酵时间 B红参粉添加量 C菌粉添加量 感官评分1 0 -1 -1 77.8 2 0 0 0 86.5 3 -1 1 0 77.6 4 0 0 0 85.5 5 1 -1 0 88.2 6 0 0 0 87.8 7 1 0 1 84.2 8 1 1 0 84.0 9 -1 0 1 78.0 10 0 0 0 86.9 11 0 1 -1 81.2 12 0 0 0 87.5 13 -1 -1 0 78.6 14 0 -1 1 84.2 15 0 1 1 76.8 16 -1 0 -1 75.6 17 1 0 -1 80.8
表12 Box-Behnken方差分析
Table 12 Variance analysis of Box-Behnken
注：**表示影响极显著（P<0.01）；*表示影响显著（P<0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方值 F值 P值模型 296.21 9 32.91 29.16 ＜0.000 1**A 93.85 1 93.85 83.13 ＜0.000 1**B 10.58 1 10.58 9.37 0.018 3*C 7.61 1 7.61 6.74 0.035 7*AB 2.56 1 2.56 2.27 0.175 8 AC 0.25 1 0.25 0.22 0.652 2 BC 29.16 1 29.16 25.83 0.001 4**A2 27.27 1 27.27 24.16 0.001 7**B2 20.29 1 20.29 17.97 0.003 8**C2 90.85 1 90.85 80.48 ＜0.000 1**残差 7.90 7 1.13失拟项 4.63 3 1.54 1.89 0.272 9净误差 3.27 4 0.82总误差 304.11 16
利用Design-Expert 8.0.6对表11数据进行分析得到该模型的二次多元回归方程为Y=86.84+3.43A-1.15B+0.98C-0.80AB+0.25AC-2.70BC-2.54A2-2.19B2-4.64C2。
由表12可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05）；相关系数 R2=0.974 0、校正决定系数 R2Adj=0.940 6，以上数据表明模型具有较高拟合度。在该回归模型中，因素A、交互项BC及二次项A2、B2、C2的P值均小于0.01，影响极显著；因素B、C的P值分别为0.0183和0.035 7，小于0.05，表明影响显著。根据3个因素的F值可知，各因素对红参酸乳感官评分的影响顺序依次为A＞B＞C，即发酵时间＞红参粉添加量＞菌粉添加量。
2.3.2 响应面分析图
响应面分析图是由响应值和试验因素组成的立体曲面图，因素间交互作用对红参酸乳的响应面图见图6。
由图6可知，响应曲面皆开口向下，表明感官评分随着发酵时间、菌粉添加量和红参粉添加量各因素的增加而先增大后减小，表明存在感官评分最大值。其中红参粉添加量和菌粉添加量交互作用的响应面曲图较陡，且等高线呈现椭圆形，表明红参粉添加量与菌粉添加量交互作用对酸乳感官评分影响极显著。经分析可得，红参酸乳的优化工艺为红参粉添加量8.12 g、发酵时间7.56 h、菌粉添加量1.65 g，感官评分预测值为88.656。
图6 各因素间交互作用对感官评分的影响
Fig.6 The effect of interaction between factors on sensory scores
2.3.3 验证试验
根据实际操作，将工艺参数调整为红参粉添加量8.1 g、菌粉添加量1.7 g和8 h的发酵时间，取3次验证试验的均值为88.2与预测值接近，表明工艺参数的可行性。
2.4 红参酸乳品质评价
红参酸乳理化指标对比见表13，微生物指标对比见表14。
表13 红参酸乳理化指标对比
Table 13 Comparison of physicochemical indexes of red ginseng yogurt
（g/100 g） 酸度/°T 非脂乳固体/（g/100 g）CK 3.33 2.82 5.86 92 8.53红参酸乳 3.90 3.33 6.58 98 9.39项目 脂肪/（g/100 g）蛋白质/%蔗糖/
表14 红参酸乳微生物指标对比
Table 14 Comparison of microbial indicators of red ginseng yogurt
乳杆菌/（106CFU/mL）CK 6.2 4.4 3.9红参酸乳 10.9 6.8 7.2项目 嗜热链球菌/（108CFU/mL）双歧杆菌/（108CFU/mL）
由表13、表14可知，红参酸乳的各项理化指标、微生物指标均符合国家发酵乳标准，且优于同等条件CK。
红参酸乳皂苷含量见图7。
图7 红参酸乳皂苷含量
Fig.7 The content of ginsenoside in red ginseng yogurt
如图7所示，红参酸乳与水溶液的皂苷种类相同，但含量有所不同。红参酸乳中Rb1含量为2.19mg/g、Rb2含量为 0.95 mg/g、Rc 含量为 1.20 mg/g、Rh2含量为0.07mg/g、Rg3含量为 0.23mg/g、Rg1+Re含量为 2.51mg/g。此外，皂苷Rd含量增加了37.84%，为1.52 mg/g。
3 结论
本文通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面试验对红参酸乳工艺进行研究，最佳工艺为8.1 g红参粉、1.7 g菌粉、18 g白砂糖加入300 mL牛奶，于39℃恒温发酵8 h。该工艺所得酸乳不仅酸甜适宜，且风味独特。此外，红参粉的添加不仅增加了酸乳的营养价值，同时使其兼具了中药活性成分的功效，为人参在食品领域的应用提供方向。
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[19]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定:GB 5413.34—2010[S].北京:中国标准出版社,2010.Ministry of Health of the People's Republic of China.National food safety standard Determination of acidity inmilk and milkproducts:GB 5413.34—2010[S].Beijing:Standards Press of China,2010.
[20]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中蛋白质的测定:GB 5009.5—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.National Health and Family Planning Commission,National Food and Drug Administration.National food safety standard Determination of protein in food:GB 5009.5—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[21]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定:GB 5413.39—2010[S].北京:中国标准出版社,2010.Ministry of Health of the People's Republic of China.National food safety standard Determination of nonfattotal milk solids in milk and milkproducts:GB 5413.39—2010[S].Beijing:Standards Press of China,2010.
[22]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验:GB4789.35—2010[S].北京:中国标准出版社,2010.Ministry of Health of the People's Republic of China.National food safety standard Food microbiological examination:Lactic acid bacteria:GB4789.35—2010[S].Beijing:Standards Press of China,2010.
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[24]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准发酵乳:GB 19302—2010[S].北京:中国标准出版社,2010.Ministry of Health of the People's Republic of China.National food safety standard Fermented milk:GB 19302—2010[S].Beijing:China Standard Press,2010.
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