石油化工合成色素已广泛应用于各种食品中，但其会对人体健康产生不利影响，因此科学界必须探索更安全、自然和生态友好的色素。水果、蔬菜的果皮、种子、果渣等副产品中含有丰富的花青素、类胡萝卜素、叶绿素等天然色素[1-3]，其安全且具有潜在价值，在食品工业中被广泛应用[4-5]。为了满足日渐增长的社会需求，如何高效、便捷、充分提取天然色素，已成为色素生产的关键问题[6-10]。
索氏提取技术、浸渍或氢蒸馏等[11]传统提取天然色素的方法提取率较低、过程复杂、耗时长且成本高。因此，需要创新技术。研究报道，超声波辅助纤维素酶技术因其对溶剂要求极低、快速、方便、可提高提取率、保护色素不被降解等优点而受到人们的青睐，此外，乙醇被认为是很好的绿色提取溶剂，其对人类健康无影响且不会造成环境污染，受到大众喜爱[12-15]。
黄瓜是葫芦科的一种暖季型蔬菜[16]，其清香爽口、耐储存，是人们食用较多的一类菜肴[17]。其中，黄瓜果皮含有大量的天然色素（类胡萝卜素及叶绿素）。然而，现有研究对黄瓜农副食品废弃物的价值化探索甚少，黄瓜果皮并不为人类所消耗，每天产生的大量黄瓜皮被当作垃圾处理，会造成污染源[17-18]，对其进行资源利用很有必要。
此外，尚未有利用超声波辅助纤维素酶提取黄瓜果皮中色素的研究。因此，本研究以黄瓜皮为原料，通过超声波辅助酶解提取黄瓜皮中的色素，采用单因素试验和正交试验优化提取条件，确定最佳的提取工艺并测定该条件下提取的色素含量，以期为黄瓜皮的进一步加工利用提供一定技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄瓜：市售。95%乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（10万U/g）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子分析天平（ME54T）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9030MBE）：上海博迅实业有限公司；高速万能粉碎机（FW80）：北京市永光明医疗仪器厂；紫外分光光度计（UV-2600i）：岛津仪器（苏州）有限公司；高速台式离心机（5430R）：艾本德（上海）国际贸易有限公司；超声波恒温水浴（SCQHD300A）：上海声彦超声波仪器有限公司；恒温摇床（BILON-COS-100B）：上海比朗仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
挑选成熟度好且无损伤的新鲜黄瓜，充分清洗干净，并使其皮肉分离，在剔取黄瓜皮时应注意尽量减少黄瓜果肉的连带量，以减少测量误差；尽可能将得到的果皮切成小块（1 cm×1 cm）；然后将切好的黄瓜皮置于50℃的电热鼓风干燥箱中进行烘干，粉碎过筛（60目），得到黄瓜皮粉，并放入4℃冰箱保存。
1.3.2 提取色素方法
将制备好的黄瓜皮粉置于10 mL具塞玻璃试管中，加入9 mL 95%乙醇。悬浮液用超声波恒温水浴（超声温度30℃、超声功率250 W）提取，然后将纤维素酶溶解于其中，将获得的混合液在恒温培养摇床（温度50℃、120 r/min）中孵育20 min，再将该混合液离心（8 500 r/min、10 min），分层后取上清液，并将其放在4 ℃冰箱中避光浸提 24 h[12，19]。
1.3.3 色素含量及提取量的测定
1.3.3.1 黄瓜皮色素含量的测定
将浸提液置于离心机中离心（8500r/min、10min），取3 mL上清液，用紫外分光光度计，测定在649、665、470nm的吸光度[19]，并根据下列相关公式计算色素含量，单位为mg/L，公式如下。
式中：Chl a为黄瓜果皮中叶绿素a的含量，mg/L；Chl b为黄瓜果皮中叶绿素b的含量，mg/L；Car为黄瓜果皮中类胡萝卜素的含量，mg/L。
1.3.3.2 黄瓜皮色素提取量的计算
依照下列公式计算浸提液中黄瓜皮色素的提取量。
黄瓜皮色素提取量/（mg/g）=C×V/m
式中：C为提取液中黄瓜皮色素质量浓度，g/mL；V为提取液体积，mL；m为黄瓜皮的质量，g。
1.3.4 单因素试验
根据1.3.1制备黄瓜皮样品，分别精准称取0.1 g进行试验，按照1.3.2中的提取方法，对黄瓜皮中的色素进行浸提，并依照1.3.3中的方法及公式计算黄瓜皮色素的提取量，通过所得数据筛选出各单因素的最适条件。纤维素酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、料液比[1 ∶30、1 ∶50 、1 ∶70 、1 ∶90、1 ∶110（g/mL）]、乙醇体积分数（30%、45%、60%、75%、90%）以及超声时间（60、90、120、150、180 min）为所检测的因素。
1.3.5 正交试验
在单因素试验的基础上，对纤维素酶添加量、料液比、乙醇体积分数、超声时间4个因素分别取3个平，按照L9（34）正交表进行优化组合试验，正交试验因素与水平设计见表1。
表1 正交试验因素与水平设计
Table 1 Factors and horizontal design of orthogonal experiments
水平 A纤维素酶添加量/%C乙醇体积分数/%B料液比/（g/mL）D超声时间/min 1 0.6 1∶70 60 90 2 0.8 1∶90 75 120 3 1.0 1∶110 90 150
1.4 统计分析
本研究中所有试验各重复3次，所有数据用平均值±标准差表示，并使用SPSS 19.0软件进行统计学分析[20-21]。
2 结果与分析
2.1 纤维素酶添加量对黄瓜皮色素提取量的影响
纤维素酶添加量对黄瓜皮色素提取量的影响见图1。
图1 纤维素酶添加量对黄瓜皮色素提取量的影响
Fig.1 Effect of cellulase addition amount on extraction rates of pigment about cucumber peel
有研究表明，应用纤维素酶可以降解细胞壁成分，是一种高效温和的促进色素提取的方法。因为纤维素是植物细胞壁的关键组成，因此纤维素酶经常被使用。此外，该酶即使在环境温度和提取时间较短的情况下也能有效防止色素降解[22]。因此，利用纤维素酶能较充分地提取黄瓜皮中的色素。
由图1可知，类胡萝卜素、叶绿素b和叶绿素a的变化情况大致相同，随着纤维素酶添加量的升高，色素提取量呈现出先增后减的趋势，当纤维素酶添加量为0.8%时，提取量达到顶点，3种色素提取量分别为132.04（类胡萝卜素）、66.31（叶绿素 b）、73.35 mg/g（叶绿素a），但当纤维素酶添加量超过0.8%时，色素提取量均下降。这说明，适量添加纤维素酶可以提高黄瓜皮的色素提取量，且纤维素酶添加量为0.8%时，纤维素酶对黄瓜皮的细胞壁破坏最严重。鲁青等[23]研究当纤维酶添加量为0.2%时，其对火龙果皮中甜菜红素的提取非常有效，其提取量达到最高（37.22%），该研究表明，火龙果皮的色素提取率与纤维素酶添加量不会呈显著的正相关，其研究与本研究的结果一致。酶解反应不彻底是由于纤维素酶添加量过低而引起的，只有适当提高纤维素酶添加量，才能使反应进行彻底，但纤维素酶添加量过大，反而约束酶发挥其效应[24]。故本研究最适纤维素酶添加量为0.8%。
2.2 料液比对黄瓜皮色素提取量的影响
料液比不同会影响提取液中提取剂的用量，料液比会使传质推动力有所差异，提取剂用量大就会使传质推动力大，则提取更快，提取量更高，因此，料液比对色素提取量有重要的作用。料液比对黄瓜皮色素提取量的影响见图2。
图2 料液比对黄瓜皮色素提取量的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rates of pigment about cucumber peel
由图2可知，随着溶液体积的增大，黄瓜皮的色素提取量先增后减，当料液比为1∶90（g/mL）时，获得最大提取量，分别为169.12（类胡萝卜素）、68.04（叶绿素b）、91.81 mg/g（叶绿素 a），当料液比为1 ∶110（g/mL）时，3种色素提取量均下降。张丽等[24]利用纤维素酶辅助超声波法提取茄子皮中的色素，其研究表明，随着料液比的降低，茄子皮色素的提取量提升，当料液比为1∶60（g/mL）时达到顶峰，但超过该值，茄子皮色素提取量反而下降，其结果与本试验结果一致。产生上述结果的原因是由于料液比过大会稀释色素的浓度，因而会使色素的提取量降低。故本研究中的料液比应控制在 1∶90（g/mL）为宜。
2.3 乙醇体积分数对黄瓜皮色素提取量的影响
相比于甲醇、丙酮等，乙醇为绿色环保有机溶剂，不污染环境且对人体健康无害，提取效率高，价格低廉，因此非常适合用作食品色素提取剂。乙醇体积分数对黄瓜皮色素提取量的影响见图3。
图3 乙醇体积分数对黄瓜皮色素提取量的影响
Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rates of pigment about cucumber peel
由图3可知，类胡萝卜素、叶绿素b和叶绿素a的变化趋势一样，当其他条件维持不变时，随着乙醇体积分数增大，3种色素提取量均显示出先增后减的结果。当乙醇体积分数为75%时，类胡萝卜素、叶绿素b及叶绿素a的提取量均达到最大值（186.69、69.94、117.34 mg/g）。然而一旦乙醇的体积分数超过75%，黄瓜皮的色素提取量均降低。该结果与俞腾飞等[25]报道的乙醇体积分数对葡萄籽花青素提取的研究相同，说明当乙醇体积分数超过其适宜范围时，会导致出现一些醇溶性杂质，其与乙醇、水分子等结合后，会与色素的溶解形成竞争，从而引起色素提取量的降低[19]。上述结果显示，乙醇体积分数为75%时提取色素的效率最佳。
2.4 超声时间对黄瓜皮色素提取量的影响
据报道，超声波在食品加工中的应用可提高色素提取量，因为它能有效地增加传质传热。事实上，由于空化现象[26]，随着细胞壁的破坏和细胞材料的释放，萃取过程可以得到加强。超声时间对黄瓜皮色素提取量的影响如图4所示。
图4 超声时间对黄瓜皮色素提取量的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rates of pigment about cucumber peel
由图4可知，类胡萝卜素、叶绿素b和叶绿素a的变化趋势类似，在其他条件保持恒定时，若超声时间延长，色素提取量会表现出先增后减的趋势，超声时间在120min处可达到最高值。本研究结果与罗璇等[27]、东子珺等[28]的研究结果一致，说明超声时间过长或过短均会对植物的色素提取造成不良影响。若时间太短，则会致使提取不充分，甚至不会激活酶的活性；若时间太长，会导致色素损失，两者均会降低色素提取效果。综上所述，超声时间最好维持在120 min左右。
2.5 正交试验结果分析
以各单因素试验（纤维素酶添加量、料液比、乙醇体积分数、超声时间）为基础，对黄瓜皮的3种色素提取量进行L9（34）正交试验见表2。
表2 黄瓜皮色素提取的正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiments for extracted pigment of cucumber peel
序号叶绿素a提取量/（mg/g）1 1 1 1 1 49.20 12.33 17.12 2 1 2 2 2 60.33 12.82 22.54 3 1 3 3 3 43.91 11.39 20.21 4 2 1 2 3 33.97 10.20 16.44 5 2 2 3 1 137.83 69.52 76.54 6 2 3 1 2 92.49 24.23 39.16 7 3 1 3 2 97.58 23.64 41.65 8 3 2 1 3 89.77 27.40 33.07 9 3 3 2 1 75.73 14.78 32.76 K1 153.44 180.75 231.46 262.76 K2 264.29 287.93 170.03 250.4 K3 263.08 212.13 279.32 167.65 k1 51.15 60.25 77.15 87.59 k2 88.10 95.98 56.68 83.47 k3 87.69 70.71 93.11 55.88 R 110.85 107.18 109.29 95.11 K1b 36.54 46.17 63.96 96.63 K2b 103.95 109.74 37.80 60.69 K3b 65.82 50.40 104.55 48.99 k1b 12.18 15.39 21.32 32.21 k2b 34.65 36.58 12.60 20.23 k3b 21.94 16.80 34.85 16.33 Rb 67.41 63.57 66.75 47.64 K1a 59.87 75.21 89.35 126.42 K2a 132.14 132.15 71.74 103.35 K3a 107.48 92.13 138.4 69.72 k1a 19.96 25.07 29.78 42.14 k2a 44.05 44.05 23.91 34.45 k3a 35.83 30.71 46.13 23.24 Ra 72.27 56.94 66.66 56.70 A纤维素酶添加量B料液比C乙醇体积分数D超声时间类胡萝卜素提取量/（mg/g）叶绿素b提取量/（mg/g）
由表2可知，虽然各因素对黄瓜皮色素的提取量趋势相同，但基于R值，A、B、C、D 4个因素对黄瓜皮色素提取量的影响效果不同，结果表明，其主次顺序为A>C>B>D，即对黄瓜皮色素提取量影响最显著的是纤维素酶添加量，其次是乙醇体积分数、料液比，而超声时间对其色素提取量影响微弱。黄瓜皮色素的最优提取工艺条件为A2B2C3D1，在该条件下黄瓜皮色素的提取量分别为137.83（类胡萝卜素）、69.52（叶绿素b）、76.54 mg/g（叶绿素 a）。
综上所述，在黄瓜皮色素提取过程中，考虑到成本和提取效果问题，应该选择在最适合的条件下进行试验，即纤维素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇体积分数90%、超声时间90 min。为确保试验的精准性，对上述最优提取工艺条件（A2B2C3D1）进行了3次重复，黄瓜皮的类胡萝卜素提取量分别为136.92、137.24、138.45 mg/g，平均值为137.54 mg/g；叶绿素b的提取量分别为 69.03、69.24、69.80 mg/g，平均值为69.36 mg/g；叶绿素a的提取量分别为76.00、76.23、76.85 mg/g，平均值为76.36 mg/g，以上数据同正交试验结果基本一致，因此该正交试验结果可信。
3 结论
本文通过对纤维素酶添加量、料液比、乙醇体积分数以及超声时间的综合优化，确定了最佳提取条件为纤维素酶添加量0.8%、料液比1∶90（g/mL）、乙醇体积分数90%、超声时间90 min。其影响效果依次为：纤维素酶添加量>乙醇体积分数>料液比>超声时间。在此条件下从黄瓜皮中提取得到的类胡萝卜素含量为137.54 mg/g，叶绿素b含量为69.36 mg/g，叶绿素a含量为76.36 mg/g。分别比优化前增加了5.79、3.21、3.19 mg/g。
本研究采用了绿色新型、对人体健康无害的技术——超声波辅助纤维素酶法提取黄瓜皮中的色素（类胡萝卜素、叶绿素b、叶绿素a），该法被认为是一种合适的工业方法，可获得较高的提取量。此外，从廉价的加工废弃物中生产天然有价值的着色剂，可能会产生可观的经济和环境效益。
[1] ZAKI N A M,JAI J.Plant-based pigments:Challenges and future perspective for natural food colourants[J].Malaysian Journal of Chemical Engineering and Technology,2020,3(1):44.
[2]ESPADA-BELLIDO E,FERREIRO-GONZÁLEZ M,CARRERA C,etal.Extraction of antioxidants from blackberry (Rubus ulmifoliusL.):Comparison between ultrasound-and microwave-assisted extraction techniques[J].Agronomy,2019,9(11):745.
[3]PARRA-CAMPOS A,ORDÓÑEZ-SANTOS L E.Natural pigment extraction optimization from coffee exocarp and its use as a natural dye in French meringue[J].Food Chemistry,2019,285:59-66.
[4]SARABANDI K,JAFARI S M,MAHOONAK A S,et al.Application of gum Arabic and maltodextrin for encapsulation of eggplant peel extract as a natural antioxidant and color source[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,140:59-68.
[5]GHOSH S,CHATTERJEE J K,CHALKROBORTY B,et al.Estimation of beta carotene from fruit peel wastes by high performance thin layer chromatography[J].Journal of Pharmacognosy Phytochemistry,2019,8(1):2598-2600.
[6]SHARMAM,USMANIZ,GUPTAVK,etal.Valorization of fruits and vegetable wastes and by-products to produce natural pigments[J].Critical Reviews in Biotechnology,2021,41(4):535-563.
[7]TIWARI S,UPADHYAY N,SINGH A K,et al.Organic solvent-free extraction of carotenoids from carrot bio-waste and its physicochemical properties[J].Journal of Food Science and Technology,2019,56(10):4678-4687.
[8] 金思,马空军.超声波辅助提取类胡萝卜素研究进展[J].食品研究与开发,2017,38(9):192-197.JIN Si,MA Kongjun.Research progress in ultrasound-assisted extraction of carotenoids[J].Food Research and Development,2017,38(9):192-197.
[9]CUBAS C,LOBO M G,GONZÁLEZ M.Optimization of the extraction of chlorophylls in green beans(Phaseolus vulgaris L.)by N,N-dimethylformamide using response surface methodology[J].Journal of Food Composition and Analysis,2008,21(2):125-133.
[10]张志忠,朱书芳,宋鹏,等.从三叶草中提取叶绿素的工艺研究[J].中国食品添加剂,2012(5):115-118.ZHANG Zhizhong,ZHU Shufang,SONG Peng,et al.Study on extraction technology of clover chlorophyll[J].China Food Additives,2012(5):115-118.
[11]NGAMWONGLUMLERTL,DEVAHASTINS,CHIEWCHANN.Natural colorants:Pigment stability and extraction yield enhancement via utilization of appropriate pretreatment and extraction methods[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2017,57(15):3243-3259.
[12]RAHIMPOUR S,TAGHIAN DINANI S.Lycopene extraction from tomato processing waste using ultrasound and cell-wall degrading enzymes[J].Journal of Food Measurement and Characterization,2018,12(4):2394-2403.
[13]韩立宏,马涛.超声波辅助纤维素酶-碱液提取大枣皮红色素工艺的响应面优化研究[J].食品科学,2008,29(7):221-225.HAN Lihong,MA Tao.Study on optimization of extraction of red pigment from jujube peel with ultrasonic-assisted cellulase-alkaline solution by response surface analysis[J].Food Science,2008,29(7):221-225.
[14]张吉祥,赵文静,白晓杰,等.正交试验法优化黑米黑色素的超声辅助提取工艺[J].食品科学,2010,31(4):39-41.ZHANG Jixiang,ZHAO Wenjing,BAI Xiajie,et al.Orthogonal array design tests for optimizing ultrasound-assisted extraction of black rice pigment[J].Food Science,2010,31(4):39-41.
[15]张康逸,范运乾,康志敏,等.超声波辅助纤维素酶法提取紫玉米芯色素工艺研究[J].河南农业科学,2013,42(6):152-155.ZHANG Kangyi,FAN Yunqian,KANG Zhimin,et al.Study on optimum extraction technology of purple pigment from purple corn cob by ultrasonic-enzyme synergistic method[J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2013,42(6):152-155.
[16]VALCÁRCEL J V,PEIRÓ R M,PÉREZ-DE-CASTRO A,et al.Morphological characterization of the cucumber(Cucumis sativus L.)collection of the COMAV's genebank[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2018,65(4):1293-1306.
[17]BASUM,GUHAAK,RAYL.Adsorption of lead on cucumber peel[J].Journal of Cleaner Production,2017,151:603-615.
[18]MALLEK-AYADI S,BAHLOUL N,KECHAOU N.Chemical composition and bioactive compounds of Cucumis melo L.seeds:Potential source for new trends of plant oils[J].Process Safety and Environmental Protection,2018,113:68-77.
[19]GAOYF,FENGJ,LVJP,etal.Physiological changes of Parachlorella kessleri TY02 in lipid accumulation under nitrogen stress[J].International Journal of Environmental Research and Public Health,2019,16(7):1188.
[20]李红,郑春芳,陈继浓,等.不同温度下秋茄树幼苗叶绿素荧光参数对光强的响应[J].浙江林业科技,2020,40(2):17-22.LI Hong,ZHENG Chunfang,CHEN Jinong,et al.Response of chlorophyll fluorescence parameters of Kandelia obovata seedlings to light intensity in incubator with different temperature[J].Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology,2020,40(2):17-22.
[21]邓代信,邓代宇,刘进平,等.田间试验多重比较结果字母标记的差值计数法及其字母精简[J].种子,2018,37(5):131-132.DENG Daixin,DENG Daiyu,LIU Jinping,et al.Field trial multiple comparison results alphabetic difference counting method and its letter abbreviation[J].Seed,2018,37(5):131-132.
[22]MAIER T,GÖPPERT A,KAMMERER D R,et al.Optimization of a process for enzyme-assisted pigment extraction from grape(Vitis vinifera L.)pomace[J].European Food Research and Technology,2008,227(1):267-275.
[23]鲁青,张超凤,严美婷,等.超声波-酶解辅助提取火龙果皮色素的工艺优化[J].食品研究与开发,2019,49(17):68-72.LU Qing,ZHANG Chaofeng,YAN Meiting,et al.Optimization of ultrasonic-enzymatic hydrolysis assisted extraction process of pigment from pitaya peel[J].Food Research and Development,2019,49(17):68-72.
[24]张丽,牛丽丽,刘娜,等.纤维素酶辅助超声波法优化茄子皮色素提取工艺研究[J].中国调味品,2021,46(6):154-159.ZHANG Li,NIU Lili,LIU Na,et al.Optimization of extraction technology of pigment from eggplant skin by cellulase-assisted ultrasonic method[J].China Condiment,2021,46(6):154-159.
[25]俞腾飞,裴允彤,张傑.纤维素酶-超声波辅助法提取葡萄籽原花青素的工艺研究[J].农产品加工,2018(1):18-21,27.YU Tengfei,PEI Yuntong,ZHANG Jie.Study on the extraction process of proanthocyanidins from grape deeds by cellulase-ultrasound assisted method[J].Farm Products Processing,2018(1):18-21,27.
[26]ZOU Y,XIE C Y,FAN G J,et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of melanin from Auricularia auricula fruit bodies[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2010,11(4):611-615.
[27]罗璇,何景.超声辅助提取花生红衣色素工艺的优化[J].食品与机械,2016,32(9):172-176,236.LUO Xuan,HE Jing.The optimization of ultrasonic assisted extraction of pigment from peanut skin[J].Food&Machinery,2016,32(9):172-176,236.
[28]东子珺,徐晓萍.超声波-生物酶协同提取紫薯色素工艺优化[J].天津农业科学,2020,26(5):65-70.DONG Zijun,XU Xiaoping.Optimization of ultrasonic-enzymatic synergy extraction of purple potato pigment[J].Tianjin Agricultural Sciences,2020,26(5):65-70.