多酚具有较强的抗氧化作用[1-2]，近年来，国内外学者对富含多酚类物质的食物摄入量及一些慢性退行病的发生和发展关系进行研究，并揭示了它们的负相关关系[3-5]，有关多酚的研究越来越多。植物多酚可分为游离酚和结合酚[6]。游离酚在细胞质中游离，溶解性好，可直接用水或有机溶剂提取；而结合酚则由于与蛋白质、糖类、纤维素等通过氢键、疏水相互作用、共价键等方式结合[7]，不能用有机溶剂直接提取，只能通过加酶酶解或加强酸强碱溶液水解才能释放出来，所以常被忽略。这使多酚整体上存在着提取率和利用率不高的问题[8-9]。近年来，关于植物结合酚水解释放的工艺研究逐渐受到关注[10-13]，其中碱水解法可以同时释放通过糖苷键和酯键结合的多酚，酸水解主要通过破坏糖苷键释放结合酚[8]。与碱水解和酸水解法相比，酶水解法不使用腐蚀性的强酸强碱，提取条件更加温和有效[14]。张金宏等[15]比较了3种水解方式对苹果渣中结合酚类物质的提取效果，表明单宁酶法水解得到的没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸及根皮素提取率最高；98%阿魏酸在燕麦中以结合态存在；Bei等[16]研究表明纤维素酶可使燕麦中更多的结合酚水解释放；陈东方等[17]采用纤维素酶水解处理燕麦粉，阿魏酸含量提高了24倍；吕俊丽等[18]通过对莜麦多酚淀粉酶和纤维素酶复合酶解提取进行研究，其多酚得率显著高于微波辅助提取法。
甘薯富含钾、铁、硒等多种微量元素，以及丰富的多酚物质[19-21]。相较于其他植物，还含有丰富的淀粉、果胶、纤维素、蛋白质等，这些物质都可能与酚类物质结合导致其处于结合态。我国的甘薯产量始终稳居世界首位[22]。如能将甘薯的结合酚进一步提取并加以研究利用，对我国甘薯资源的综合加工利用将起到有力的推动作用。
本研究在选取适宜甘薯结合酚释放的水解酶基础上，对甘薯结合酚进行复合酶水解释放。确定其最适反应条件，旨在获得令甘薯结合酚水解释放的最佳酶水解条件，为生产制备甘薯结合酚以及进一步研究利用等方面提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
“辽薯20”甘薯品种：辽宁省农科院提供；无水乙醇、乙酸、甲醇、乙酸乙酯、碳酸钠、磷酸氢二钠、福林酚试剂、氢氧化钠、磷酸、乙酸钠（均为分析纯）：沈阳化学试剂厂。
果胶酶（500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500U/mg）、纤维素酶（50U/mg）、胰蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、α-淀粉酶（枯草杆菌中提取）（4 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（MP2002）、pH计（PB-10型）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限公司；电热恒温培养箱（HH.B11.420-BS）：上海龙跃仪器设备有限公司；循环水真空泵[SHZ-D(Ⅲ)型]：邦西仪器科技(上海)有限公司；旋转蒸发器（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；冷冻离心机（GR21G）：日立有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6型）：国华电器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料处理
参照谭畅[23]的方法处理甘薯：将甘薯洗净、削皮并切成约1 cm3的块状，冷冻干燥后用粉碎机粉碎，过60目筛。根据苏佳怡[24]的方法处理甘薯粉。称取甘薯粉50 g，加入400 mL 60%乙醇溶液，在50℃下水浴2 h提取游离酚，在4℃、8 000 r/min条件下离心25 min，收集弃去上清液的滤渣，按上述条件反复提取3次～4次，提取后的滤渣置于40℃烘箱中干燥至恒重，粉碎后密封并置于4℃冰箱中备用。
1.3.2 提取结合酚
参照冯悦等[25]的方法提取结合酚。称取1.3.1中收集的干燥薯渣粉2 g，加入酶溶液，在37℃下于水浴锅中水解，水解结束后在4℃、10 000 r/min条件下离心20 min，取上清液并将pH值中和至7，加入等体积的乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，40℃旋转蒸发浓缩，后取50%甲醇溶液超声溶解并定容至10 mL，密封保存在-20℃冰箱中以进行结合酚含量的测定。
1.3.3 水解酶的筛选
以液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g,分别加入不同酶液，在其最适pH值和温度条件下作用相同时间，通过检测不同水解酶作用下结合酚的提取量，确定适宜的水解酶进行复合。各酶反应具体条件如表1所示。
表1 单一酶水解试验设计
Table 1 Experimental design for single enzymolysis
序号 酶种类 加酶量/水解时间/h 1 纤维素酶 500 5 50 20 2 果胶酶 500 5 50 20 3 α-淀粉酶 500 5 65 20 4 中性蛋白酶 500 7 50 20 5 胃蛋白酶 500 2 37 20 6 胰蛋白酶 500 7 37 20（U/g） pH值 水解温度/℃
1.3.4 复合酶水解结合酚单因素试验
分别以pH值、水解温度、液料比、水解酶用量、水解时间为考察对象，设计单因素试验，对不同条件下甘薯结合酚提取量进行研究。
在液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、水解温度50℃、水解时间20 h的条件下，考察pH值（3、4、5、6、7）对结合酚提取量的影响。
在液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、pH6、水解时间 20 h 的条件下，考察水解温度（45、50、55、60、65℃）对结合酚提取量的影响。
在水解时间20 h、加酶量500 U/g、pH6、水解温度55 ℃的条件下，考察液料比[5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1（mL/g）]对结合酚提取量的影响。
在液料比 10 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、pH6、温度 55 ℃的条件下，考察水解时间（5、10、15、20、25 h）对结合酚提取量的影响。
在液料比 10∶1（mL/g）、水解温度 55℃、水解时间 20 h、pH5的条件下，依次考察加入 300、400、500、600、700 U/g的中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶后结合酚的提取量，探究不同加酶量对甘薯结合酚提取量的影响。
1.3.5 复合酶水解的响应面试验
复合酶水解释放甘薯结合酚的响应面试验设计（re sponse surface methodology，RSM）优化采用 Design-Expert10软件，筛选出液料比、pH值、水解温度、水解时间4个条件进行响应面试验，响应面因素与水平见表2。
表2 复合酶水解响应面试验因素水平
Table 2 Factors and levels used in response surface methodology for compound enzymolysis
水平编码因素A液料比/（mL/g）B水解时间/h C水解温度/℃ D pH值-1 5∶1 10 50 5 0 10∶1 15 55 6 1 15∶1 20 60 7
1.3.6 多酚含量测定
参考Grace等[26]的方法并稍加改动。准确称取10 mg没食子酸，加蒸馏水定容到10 mL，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL没食子酸标准溶液于10 mL离心管中，加蒸馏水定容，充分混匀。分别吸取0.5 mL于10 mL离心管中，蒸馏水定容到5 mL，加入0.5 mL福林酚试剂，加入0.5 mol/L碳酸钠溶液1 mL，混匀。避光静置1 h，于725 nm下测定吸光度。
标准曲线回归方程为 y=4.690 9x－0.011 8，R2=0.999 5，式中：y为样品在725 nm处的吸光度，x为样品中多酚的质量浓度（mg/mL）。
取对应样液0.5 mL，按照上述多酚含量测定方法进行测定，参照标准曲线计算其甘薯多酚提取量。提取量计算公式如下。
1.4 数据处理
利用Design-Expert 10.0软件对3个水平的响应面进行试验设计、数据处理及模型建立，且所有试验数据均为3次重复试验结果平均值。采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 不同水解酶作用下的结合酚提取量
不同水解酶作用下的结合酚提取量见图1。
图1 不同水解酶作用下的结合酚提取量
Fig.1 Effect of different enzymolysis on the yield of bound phenol
由图1可知，不同水解酶作用下的结合酚提取量不同。在所考察的6种酶中，以α-淀粉酶作用下的结合酚提取量最多，其次为果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶作用相当，而胃蛋白酶作用下的结合酚提取量相对较少。说明甘薯中结合酚主要是以与淀粉、果胶呈结合态形式存在，另有少部分以与纤维素和蛋白质结合形式存在。试验进一步选取α-淀粉酶、果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶进行复合，对甘薯结合态多酚进行水解释放。
2.2 复合酶水解单因素试验
2.2.1 pH值对结合酚提取量的影响
pH值对结合酚提取量的影响见图2。
图2 pH值对结合酚提取量的影响
Fig.2 Effect of pH on the yield of bound phenol
由图2可知，pH值由4升至6，结合酚提取量明显增加，pH值为6时达到最大。pH值增加到7时，结合酚提取量迅速降低。说明pH 5～6的弱酸性条件下复合酶活力强，有利于其将结合酚释放出来，而强酸和中性条件下复合酶活力受到抑制，不利于其发挥作用。
2.2.2 水解温度对结合酚提取量的影响
水解温度对结合酚提取量的影响见图3。
图3 水解温度对结合酚提取量的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the yield of bound phenol
由图3可知，在45℃～65℃时，随着水解温度的升高，结合酚提取量升高，水解温度达到55℃时，结合酚提取量最大，说明55℃为复合酶最适作用温度。水解温度继续升高，结合酚提取量缓慢下降，可能是水解温度升高酶活受到抑制，高温条件下导致释放出的结合酚结构被破坏。
2.2.3 液料比对结合酚提取量的影响
液料比对结合酚提取量的影响见图4。
图4 液料比对结合酚提取量的影响
Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of bound phenol
由图4可知，随着液料比由5∶1（mL/g）增加到10∶1（mL/g），结合酚提取量增加迅速，表明液料比的增加促进了酶对结合酚的水解释放。当溶液体积继续增加，结合酚提取量反而减少，可能是由于液体体积的增加，增大了与空气之间的接触面积从而使释放出的结合酚氧化，因此选择液料比10∶1（mL/g）进行后续试验。
2.2.4 水解时间对结合酚提取量的影响
水解时间对结合酚提取量的影响见图5。
图5 水解时间对结合酚提取量的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of bound phenol
由图5可知，当水解时间不断延长，结合酚提取量迅速增加，水解15 h后，结合酚提取量趋于平缓，可能因为溶液中结合酚溶解量已达饱和，水解20 h后，结合酚提取量略有下降，可能是水解时间的延长使释放出的高浓度的结合酚与氧气接触机会增大，导致氧化而发生含量下降。
2.2.5 不同酶种类和用量对结合酚提取量的影响
不同酶种类和用量对结合酚提取量的影响见图6～图9。
图6 中性蛋白酶用量对结合酚提取量的影响
Fig.6 Effect of neutral protease dosage on the yield of bound phenol
图7 纤维素酶用量对结合酚提取量的影响
Fig.7 Effect of cellulase dosage on the yield of bound phenol
图8 α-淀粉酶用量对结合酚提取量的影响
Fig.8 Effect of α-amylase dosage on the yield of bound phenol
图9 果胶酶用量对结合酚提取量的影响
Fig.9 Effect of pectinase dosage on the yield of bound phenol
共价键与食品基质相结合是食品中结合酚的结合方式。其中，与多酚结合的细胞壁物质主要包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶[10]，因此，加入相应酶类对这些细胞壁物质进行水解，可分解细胞壁组织，使得与其结合的多酚释放出来。而淀粉酶的水解作用则可使淀粉链伸展，破坏其网状结构并水解糖苷键，促使与淀粉结合的多酚有效释放[20]。由图6～图9可知，当各酶加酶量为果胶酶600 U/g、纤维素酶600 U/g、α-淀粉酶400 U/g和中性蛋白酶600 U/g时，该复合酶配比能使酶解作用发挥到最大。继续增加各酶量，结合酚提取量不再增加，说明水解作用基本趋于饱和。同时，加酶量增加，也会使释放的淀粉、蛋白质这样的大分子增加，导致溶液黏度增加，反而不利于结合酚的提取，导致提取量迅速下降。
2.3 甘薯结合酚提取响应面试验及结果分析
2.3.1 响应模型的建立与分析
响应面分析设计及试验结果见表3。方差分析见表4。
表4 方差分析
Table 4 Variance analysis
注：* 表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 0.015 14 4.381×10-3 16.04 ＜0.000 1 **A 0.011 1 0.011 154.88 ＜0.000 1 **B 4.941×10-4 1 4.941×10-4 7.28 0.017 3 *C 6.750×10-6 1 6.750×10-6 0.100 0.707 0 D 1.408×10-5 1 1.408×10-5 0.21 0.655 6 AB 8.100×10-5 1 8.100×10-5 1.19 0.292 9 AC 1.735×10-18 1 1.735×10-182.558×10-141.000 0 AD 2.025×10-5 1 2.025×10-5 0.30 0.593 3 BC 1.735×10-18 1 1.735×10-182.559×10-141.000 0 BD 2.025×10-5 1 8.100×10-5 0.30 0.5933 CD 2.500×10-7 1 0.000 3.687×10-30.952 4 A2 4.066×10-3 1 0.016 59.07 ＜0.000 1 **B2 2.220×10-5 1 1.294×10-4 0.33 0.576 3 C2 1.090×10-4 1 4.514×10-4 1.61 0.225 4 D2 3.582×10-5 1 1.765×10-4 0.53 0.479 3残差 9.493×10-4 14 2.570×10-4失拟项 8.065×10-4 10 8.065×10-5 2.26 0.224 5纯误差 1.428×10-4 4 3.570×10-5总和 0.016 28
采用Design-Expert 10软件对表3中的数据进行多元回归拟合，获得响应值结合酚提取量（Y）对各因素真实值的二次回归模型方程为Y=0.13+0.030A+0.006 417B+0.000 75C+0.001 083D+0.004 5AB+0.000AC-0.002 25AD+0.000BC-0.002 25BD-0.025A2-0.00185B2-0.004 1C2-0.002 35D2。
表3 响应面分析设计及试验结果
Table 3 Program and experimental results of RSM
试验号 A液料比 B水解时间 温度 D pH值 Y结合酚提取量/（g/100 g）1 0 -1 0 -1 0.115 2 1 1 0 0 0.142 3 0 -1 1 0 0.114 4 1 -1 0 0 0.132 5 1 0 0 -1 0.143 6 0 -1 0 1 0.128 7 0 1 1 0 0.142 8 0 0 -1 -1 0.123 9 0 0 1 -1 0.123 10 0 0 0 0 0.137 11 1 0 -1 0 0.131 12 0 0 1 1 0.133 13 1 0 0 1 0.126 14 -1 0 0 -1 0.078 15 -1 0 0 1 0.070 16 0 1 0 1 0.133 17 0 -1 -1 0 0.109 18 0 0 0 0 0.123 19 0 0 0 0 0.132 20 0 0 0 0 0.131 21 -1 1 0 0 0.075 22 0 1 0 -1 0.129 23 1 0 1 0 0.131 24 0 0 0 0 0.136 25 0 0 -1 1 0.134 26 -1 0 -1 0 0.072 27 -1 -1 0 0 0.083 28 0 1 -1 0 0.137 29 -1 0 1 0 0.072 C水解
由表4可知，变量模型P<0.01，达到极显著水平，回归方程失拟项P=0.224 5，差异不显著，R2=0.882 6，表明88.26%的数据可以用此方程解释。方差分析结果表明，方程中A、A2对结合酚提取量的影响极显著，B对结合酚提取量的影响显著，各因素交互项对响应值的影响不显著。
2.3.2 响应曲面分析
各因素交互作用对结合酚提取量影响的响应曲面及等高线图见图10。
图10 各因素交互作用对结合酚提取量影响的响应曲面及等高线图
Fig.10 Responsive surfaces and contour maps for each factor interaction effect on the amount of bound phenol extraction
由图10可知，随溶液体积的增加，结合酚提取量表现出先增加后下降的趋势；随水解时间的延长，呈现逐渐增加后趋于平缓的趋势；随水解温度的升高，呈现先增加后下降的趋势；随水解温度的升高，呈现先增加后下降的趋势。由此可见，各因素之间交互作用对结合酚提取量的影响不大。
2.3.3 验证试验
以响应面优化得到的最佳工艺参数结合实际操作调整参数，即液料比 15 ∶1（mL/g）、水解时间 16 h、水解温度53℃、pH值为6，进行复合酶水解法释放甘薯结合酚，实际测得结合酚提取量为（0.140±0.002）g/100 g，达到预测值（0.143 g/100 g）的97.55%，说明了回归模型的可靠性。该条件下结合酚提取量是单一纤维素酶、单一中性蛋白酶作用下提取量的2.63倍，单一果胶酶作用下提取量的2.11倍，单一α-淀粉酶作用下提取量的1.42倍。
3 结论
以α-淀粉酶（用量400U/g）、果胶酶（用量600U/g）、纤维素酶（用量600 U/g）、中性蛋白酶（用量600 U/g）4种酶复合对甘薯结合酚进行水解释放，最佳工艺条件为液料比 15∶1（mL/g）、水解时间 16 h、水解温度 53℃、pH6，此时结合酚提取量为0.140 g/100 g，达到预测值0.143 g/100 g的97.55%，说明了该工艺的可行性。该工艺所得结合酚提取量是仅使用单种酶类进行水解所得结合酚提取量的1.42倍～2.63倍，由此可见，运用酶解法提取甘薯结合酚，复合酶水解释放的效果优于单一酶的效果。
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