高尿酸血症是嘌呤代谢异常引起的一种代谢紊乱疾病。由于生活水平的提高，饮食的多元化与不平衡化往往伴随着风险，2021年我国高尿酸血症总体患病率已达13.3%，并且发病患者平均年龄呈降低趋势。高尿酸血症的发生不仅与易感基因有关，同时与体内尿酸生成过多和排泄不足有关[1]。针对此类代谢紊乱性疾病，药物治疗与饮食干预往往缺一不可。治疗高尿酸的传统药物往往伴随着严重的副作用，饮食干预或将成为高尿酸血症治疗的有效手段[2]。因此，研发出适合饮食干预高尿酸血症的食品具有十分广阔的市场前景。
壳寡糖复合固体饮料（KSP）是以壳寡糖、海洋鱼低聚肽（鹅肌肽）、樱桃粉、茯苓粉为主要活性成分制成的复合固体饮料。其中壳寡糖由壳聚糖降解而来，已被批准为“新食品原料”[3]。壳聚糖虽然具有良好的吸附性，但难以被人体消化吸收[3]。研究表明，壳寡糖不仅具有抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗2型糖尿病等生物活性，而且可以被肠上皮细胞吸收[4]。近年来，也有研究提示壳寡糖可能具有降低尿酸的作用[5]。鹅肌肽则被证实可以通过促进尿酸排泄缓解高尿酸血症[6]。除此之外，有研究表明樱桃粉的摄入可能会降低痛风风险[7]。茯苓粉则具有药食同源性，且有研究表明茯苓水提物可以通过调节高尿酸血症大鼠肾脏组织中尿酸转运蛋白 1（urate transporter 1，URAT1）、有机阴离子转运蛋白 1（organic anion transporter 1，OAT1）、有机阳离子转运蛋白 2（organic cation transporter 2，OCT2）的表达促进尿酸的排泄[8]。
近年来肠道菌群作为科研工作者研究的热门方向，为许多疾病的治疗提供了新的思路。研究表明，肠道菌群在调节高尿酸血症宿主内环境平衡发挥了重要作用[9]。与此同时，越来越多益生元的发现为肠道菌群干预高尿酸血症的研究提供了新的方向。在此前的研究中，已经发现壳寡糖可以有效调节肠道菌群并影响宿主的代谢过程[10-11]，这为探究壳寡糖复合固体饮料对高尿酸血症小鼠肠道菌群的作用研究提供了理论支持。本文通过建立高尿酸小鼠模型，利用16S rDNA高通量测序等技术探究以壳寡糖等活性成分组成的复合固体饮料对高尿酸血症小鼠肠道微生态的影响，为研发饮食干预高尿酸血症的食品提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
KM 小鼠：3周～4周龄，体重 20 g～24 g，SPF 级雄性，中国食品药品检定研究院；壳寡糖复合固体饮料：新优蓝健康科技有限公司；酵母膏：北京索莱宝科技有限公司；乙酸乙酯（色谱纯）、氧嗪酸钾（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司；尿酸测试盒：南京建成生物工程研究所；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸（均为色谱纯）、别嘌呤醇：上海麦克林生化科技有限公司；硫酸（分析纯）：天津市化学试剂三厂；滤膜：天津市津腾实验设备有限公司；进样针（Agilent 5181-1267）：安捷伦科技有限公司。
1.2 仪器与设备
全波长酶标仪（SpecturaMax190）：美国分子仪器公司；超低温冰箱（Forma 700系列）：赛默飞世尔科技公司；台式微量高速离心机（H1650-W）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；气相色谱仪（9001171，色谱柱型号为123-3262 DB-FFAP）：安捷伦科技有限公司；电子天平（BSA223S）：德国赛多利斯公司；恒温磁力搅拌器（85-2型）：天津市华仪鑫达仪表有限公司；液氮罐（YDS-50B-20）：四川亚西机器有限公司；电泳仪（Tanon EPS 300）：上海天能科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物实验
60只KM小鼠按体重随机分为6组，每组10只，组间小鼠体重均一。包括正常对照组（normal control group，NC）、高尿酸血症模型组（model group，M）、低剂量固体饮料组（low-dose group，LKSP）、中剂量固体饮料组（middle-dose group，MKSP）、高剂量固体饮料组（high-dosegroup，HKSP）、别嘌呤醇组（allopurinolgroup，AP）。普通饲料适应性喂养7 d后，模型组与给药组小鼠灌胃10 g/（kg·d）酵母膏，腹腔注射300 mg/（kg·d）氧嗪酸钾建立高尿酸血症小鼠模型。造模1 h后灌胃30 mg/（kg·d）别嘌呤醇，正常对照组灌胃磷酸盐缓冲液。KSP处理组小鼠给予含1.6%、2.6%、3.6% KSP的饲料[对应壳寡糖含量为150、250、350 mg/（kg·d）]，其余组正常饮食，均自由饮水。造模21 d后，摘眼球取血并处死小鼠，解剖取其盲肠内容物、结肠内容物置于超低温冰箱保存备用。血液样品3000r/min离心15min取血清，利用尿酸测试盒检测血清尿酸（uric acid，UA）水平。
1.3.2 肠道菌群测序
取小鼠盲肠内容物，DNA提取试剂盒提取其微生物总DNA。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增其16SrDNA的V3+V4区。上下游特异性引物序列为338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）；806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR 反应体系为高保真FastPfu聚合酶体系。PCR反应过程条件为95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s；循环数27个、72℃、10 min。2%琼脂凝胶电泳检测PCR产物。利用切胶回收试剂盒回收目的片段，定量后与纯化的扩增产物等量混合，然后连接测序接头，构建测序文库，应用Hiseq2500 PE250上机测序。
1.3.3 短链脂肪酸测定
取100 mg小鼠结肠内容物，加入1 mL双蒸水涡旋振荡，13000r/min离心10min，取上清，加入100μL10%硫酸摇匀，加入1 mL乙酸乙酯涡旋振荡5 min。振荡结束后13 000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm滤膜，置于气相小瓶使用气相色谱仪检测。
1.3.4 数据统计
测序所得的原始数据预处理后，进行操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）聚类，计算得出每个OTU在各个样品中的绝对丰度。利用Greengene数据库、Krona软件包等进行分类与丰度可视化。同时对样品进行进一步的物种注释、群落多样性、群落差异和群落组成分析等。测序及数据处理平台由上海美吉生物有限公司提供（http：//www.majorbio.com/）。其余数据处理与统计使用GraphPad Prism 5.0软件进行，使用One-Way ANOVA进行组间差异分析，数据结果以平均值±标准差表示，当P＜0.05时认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 KSP对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响
KSP对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响见图1。
由图1可知，与NC组相比，M组血清尿酸高度显著增加（P＜0.001）。与M组相比，AP组血清尿酸高度显著降低（P＜0.001），HKSP组血清尿酸显著降低（P＜0.05）。随着KSP剂量增加，LKSP组、MKSP组、HKSP组血清尿酸与NC组相比差异逐渐减小，HKSP组小鼠血清尿酸与NC组相比差异性不显著。因此，KSP可以缓解高尿酸血症。
图1 KSP对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响
Fig.1 The effect of KSP on the serum UA of hyperuricemia mice
*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）；***表示差异高度显著（P＜0.001）。
2.2 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群多样性指数的影响
在OTU水平上，KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群多样性指数的影响见表1。表中涉及的群落多样性指数包括反映肠道菌群丰富度的Sobs指数、Chao指数、Ace指数，反映肠道菌群多样性的Shannon、Simpson指数，以及评价测序样本群落覆盖率的Coverage指数。
表1 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群多样性指数的影响
Table 1 Effect of KSP on the diversity index of intestinal flora in hyperuricemia mice
Simpson指数NC组 0.998 9 269.50 303.72 294.41 3.83 0.05 M组 0.998 7 353.00 387.93 378.89 4.38 0.03 LKSP组 0.998 5 348.75 389.54 382.03 4.06 0.06 MKSP组 0.998 8 357.75 385.57 381.43 4.37 0.03 HKSP组 0.998 9 384.00 408.44 403.28 4.50 0.02 AP组 0.998 8 350.75 378.60 373.19 4.22 0.03组别 Coverage指数Sobs指数Chao指数Ace指数Shannon指数
由表1可知，所有组别Coverage指数均在0.998以上，证明此次样本测序量合理，几乎覆盖了样本所包含的所有菌群。与NC组相比，其他各组Sobs指数、Chao指数、Ace指数均高于NC组，证明高尿酸血症小鼠的肠道菌群丰富度增加。其中HKSP组Sobs指数、Chao指数、Ace指数均高于M组，表明高剂量的KSP增加了高尿酸血症小鼠的肠道菌群丰富度。Shannon指数的变化趋势与Sobs指数、Chao指数、Ace指数类似，但Simpson指数的结果似乎与Shannon指数变化相反。推测是由于Simpson指数更加偏向于描述物种的相对丰度，而Shannon指数更加偏向于描述物种的绝对丰度。
2.3 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群的影响
2.3.1 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群组成差异的影响
KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群组成差异的影响见图2。
图2 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群组成差异的影响
Fig.2 Effect of KSP on the composition differences of intestinal flora in hyperuricemia mice
由图2a可知，6组样本共有OTU个数为355个。NC组含独有OTU 8个，M组含独有OTU 9个，LKSP组含独有OTU 6个，MKSP组含独有OTU 10个，HKSP组含独有OTU 13个。这说明在OTU水平上，各组样品肠道菌群具有相似性。影响样本群落组成差异的潜在主成分由主坐标分析图（principal co-ordinates analysis，PCoA）中各组代表点的距离表示，距离越远，差异越大。由图2b可知，在OTU水平上，NC组与M组代表点距离远，这说明M组与NC组相比，在影响样本群落组成差异的潜在主成分上具有明显差异。除此之外，KSP处理组与M组代表点也存在一定距离，其中LKSP组代表点与M组代表点距离最远，这说明相比于M组，影响KSP处理组样本群落组成差异的潜在主成分也发生了变化，其中LKSP组变化最大。然而，AP组与M组代表点距离近，这表明AP组与M组样本中影响群落组成差异的潜在主成分并没有明显差异，这与KSP处理组的结果不同。
2.3.2 KSP对高尿酸血症小鼠肠道菌群组成的影响
KSP对高尿酸血症小鼠门水平肠道菌群组成的影响见图3。
图3 KSP对高尿酸血症小鼠门水平肠道菌群组成的影响
Fig.3 Effect of KSP on flora community composition at phylum level in hyperuricemia mice
由图3可知，各组群落丰度占比最大的四类菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）与放线菌门（Actinobacteriota）。与NC组相比，其他各组厚壁菌门的群落丰度占比下降，拟杆菌门的群落丰度占比升高。这说明高尿酸血症小鼠肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度降低，拟杆菌门的相对丰度升高，KSP与AP处理均未改善高尿酸血症小鼠肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的丰度。与NC组相比，M组疣微菌门群落丰度升高。与M组相比，LKSP、MKSP组疣微菌门群落丰度升高，尤其是LKSP组疣微菌门丰度高于其他所有组，但HKSP组疣微菌门丰度有所下降。这说明高尿酸血症小鼠肠道菌群中疣微菌门的相对丰度升高，高剂量的KSP可以使其相对丰度下降。相比于NC组，M组放线菌门的相对丰度下降。相比于M组，LKSP、MKSP和HKSP组放线菌门相对丰度没有产生明显变化，AP组放线菌门相对丰度有所升高。这说明KSP不能改善高尿酸血症小鼠疣微菌门相对丰度的降低，而AP可以使其相对丰度升高。
KSP对高尿酸血症小鼠属水平肠道菌群组成的影响见图4。
图4 KSP对高尿酸血症小鼠属水平肠道菌群组成的影响
Fig.4 Effect of KSP on flora community composition at genus level in hyperuricemia mice
由图4可知，相比于NC组，M组拟杆菌属（Bacteroides）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、普雷沃氏菌科 UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae 的相对丰 度升高。相比于M组，KSP处理组Bacteroides、Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG-001、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae相对丰度降低。这说明高尿酸血症小鼠肠道Bacteroides、Prevotellaceae_UCG-001、norank_f_Ruminococcaceae、norank_f_Oscillospiraceae菌属相对丰度增高，KSP可以调节其相对丰度。
相比于NC组，M组阿克曼氏菌属（Akkermansia）的相对丰度有所升高。相比于M组，LKSP组Akkermansia的相对丰度升高，随着KSP剂量的升高其相对丰度逐渐降低。这说明KSP可以调节高尿酸血症小鼠肠道Akkermansia的相对丰度使其趋于正常小鼠肠道菌群组成。相比于NC组，M组乳酸菌属（Lactobacillus）的相对丰度降低，相比于M组，KSP组Lactobacillus的相对丰度增加。这说明高尿酸血症小鼠肠道Lactobacillus相对丰度降低，KSP可以增加其相对丰度。
2.4 KSP对高尿酸血症小鼠短链脂肪酸的影响
短链脂肪酸在维持肠道内环境以及机体发挥免疫功能方面存在重要作用[12]。本研究检测小鼠结肠内容物中所含乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸的含量。KSP对高尿酸血症小鼠短链脂肪酸的影响见图5。
图5 KSP对高尿酸血症小鼠短链脂肪酸的影响
Fig.5 Effect of KSP on short-chain fatty acid（SCFA）in hyperuricemia mice
由图5可知，与NC组相比，其余各组乙酸水平均无明显变化。与NC组相比，M组丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸水平呈上升趋势，但差异不明显。相比于M组，KSP处理组丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸水平呈下降趋势，且随着KSP剂量的增加，逐渐下降至正常水平，其中HKSP组丁酸、戊酸、异戊酸的水平与M组差异显著（P＜0.05）。这说明高尿酸血症小鼠肠道丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸异常升高，KSP可以改善这种增高使其趋于正常水平。
3 讨论与结论
一种可治疗痛风和高尿酸血症的传统中药配方可以改善高尿酸血症，同时调节高尿酸血症小鼠肠道菌群组成的变化，尤其是可以降低Bacteroides、Alloprevotella的相对丰度[13]。在本实验中，高尿酸血症小鼠肠道Bacteroides、Alloprevotella相对丰度升高，KSP处理可以使其相对丰度下降，这与传统中药配方调节高尿酸血症小鼠肠道菌群结果具有相似性。逍遥散与KSP均含茯苓。逍遥散可以通过调节晚期糖基化蛋白终产物的炎症相关受体发挥抗抑郁作用，从而降低抑郁小鼠肠道Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度[14-15]，并且Prevotellaceae_UCG-001在偶氮甲烷诱导的结肠炎小鼠肠道菌群中相对丰度也会提高[16]。本研究中，M组Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度增加，KSP处理后其相对丰度下降，因此KSP可能通过缓解炎症调节肠道菌群中Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度。
Lactobacillus作为益生菌已经被广泛应用于食品、医药及其他健康产业[17]。研究表明灌胃Lactobacillus可以缓解高尿酸血症大鼠血清尿酸升高[18]，并且也有研究表明Lactobacillus在发挥降尿酸作用的同时不会产生毒性[19]。在本研究中，M组小鼠肠道Lactobacillus的相对丰度下降，KSP处理可以增加肠道中Lactobacillus的相对丰度，这说明KSP可能通过增加肠道中Lactobacillus的相对丰度发挥降尿酸作用。
短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）是肠上皮细胞的重要燃料，可以影响肠道运动并增强肠道屏障功能以及宿主代谢[20-21]。本研究表明高尿酸血症小鼠结肠内容物丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸异常升高，KSP处理组可以缓解SCFA异常升高。这证明KSP可以调节高尿酸小鼠的代谢紊乱，且极有可能通过调节肠道屏障与短链脂肪酸的生成发挥降尿酸作用。
高尿酸血症小鼠肠道菌群丰富度升高。KSP可以调节高尿酸血症小鼠肠道菌群的组成，尤其是KSP可以降低高尿酸血症小鼠肠道中Bacteroides、Alloprevotella、Prevotellaceae_UGG-001的相对丰度，同时增加有益菌属Lactobacillus的丰度。除此之外，KSP可以影响高尿酸血症小鼠短链脂肪酸的生成。因此，KSP不仅可以发挥降尿酸作用，还能改善高尿酸血症小鼠肠道微生态。
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