有机饲养不仅是无人工化学合成物质投入的概念，也意味着更好的饲养条件和动物福利[1]。Scozzafava等[2]调研发现提供有关有机农业伦理信息，如动物福利和环境可持续性，可以促进消费者的购买意愿。然而有机乳价格较高，且缺乏统一的营养品质标准，因此对有机乳的鉴别显得尤为重要。Samarra等[3]提出通过氧脂素作为有机牛乳评估的生物标志物来区分有机和非有机乳。Liu等[4]报道便携式近红外光谱能够区分有机牛乳和普通牛乳。张鑫[5]根据主成分分析观察的自然聚类效果，推测利用脂肪酸指纹鉴别有机和非有机乳具有一定的可行性，但未建立验证判别模型。Chung等[6]研究发现测量碳氮同位素可能有助于确定有机乳的真实性。相关研究表明乳脂肪酸的含量和构成与家畜饲养模式密切相关[7-9]。Liu等[10]研究发现牛乳与饲草中脂肪酸存在特定的关系。白萨如拉[11]研究发现奶牛膳食中添加苜蓿和青贮可提高乳中C18∶2n6和α-C18∶3n3含量。杨炳壮等[12]研究发现日粮添加占精料2%的花生油会使牛乳中共轭亚油酸的含量提高。Bork等[13]发现饲料加入亚麻籽后牛乳α-C18∶3n3含量显著升高。
综上研究，对不同饲养模式下生产的乳及其相关食品营养和品质研究多使用传统的统计学手段，近十年食品特征研究评价和真实性判别中越来越多地引入聚类分析、分类分析、模式分析和判别分析等化学计量学原理和软件技术[14-15]。主成分分析（principal component analysis，PCA）虽然不是专门的聚类分析方法，但因PCA可以将每一个研究对象（即样本）以某一类营养素组或理化指标集投射到二维或三维空间的一个点，因此属于无监督的自然聚类观察方法，是直观观察样本集自然聚类或离散分布的理想策略和工具。而软独立建模分类（soft independent modeling of class analogies，SIMCA）是建立在PCA基础上专门的有监督的聚类和分类分析方法，目前在食品研究和应用领域使用比较广泛[16-18]。
目前国内关于有机与非有机乳，尤其是市售有机超高温灭菌（ultra-high temperature，UHT）乳脂肪酸（fatty acids，FAs）特征研究较少。本研究旨在系统地检测和比较国内大型乳品企业有机和普通（非有机）乳的FAs含量和比值，获得参考价值较高的有机和非有机乳FAs参数，而最根本的目标是观察有机乳和非有机乳以FAs指纹聚类的特征，以及企业品牌间的差异，并论证和尝试以FAs指纹建立模型判别市售有机和非有机UHT乳的可行性。
1 材料与方法
1.1 样品
采集荷斯坦牛乳样品共94份。原乳包括A和C两个乳品企业（简称乳企A、乳企C），乳企A牧场原乳共30份，其中有机牧场20份，非有机牧场10份，采样地为锡林郭勒盟和呼和浩特市周边；乳企C牧场原乳共29份，其中有机牧场14份，非有机牧场15份，采样地为巴彦卓尔盟和阿拉善，采样时间均为七月至十月的夏秋季节。荷斯坦牛UHT液态乳包括A、B和C 3个品牌。其中3个品牌有机UHT乳共15份，A和B两个品牌非有机UHT乳共20份，均为市售。本次采样没有涉及乳企B有机和非有机原乳及C品牌非有机UHT乳。原乳样品现场液氮迅速降温，-18℃冷冻保藏运输；UHT液态乳样品室温（16℃）存放。
1.2 试剂
甲醇（色谱纯）：北京迈瑞达科技有限公司；正庚烷、三氟化硼甲醇（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；十一碳酸甘油三酯标准品、37组分脂肪酸甲酯混合标准品：美国Sigma公司。
1.3 仪器设备
FL-9720型气相色谱仪、氢火焰离子检测器（hydrogen flame ionization detector，FID）：浙江福立分析仪器有限公司；T18均质机、旋转蒸发仪RV8：德国IKA公司。
1.4 检测方法
参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[19]中碱水解提取法对乳样脂肪酸进行测定，每个样品做两个平行。色谱条件：毛细管柱型号为 SP-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；使用程序升温：初始温度100℃，保持5 min，以4℃/min升温至240℃，保持30 min；进样口温度260℃；检测器温度260 ℃；载气：高纯氮气；分流式进样：分流比 20∶1；进样体积：1.0 μL。FL9720气相色谱工作站分析FAs色谱图，内标法计算脂肪酸含量。
1.5 统计分析
使用化学计量学软件Pirouette 4.5进行PCA分析，进行数据降维和无监督的聚类分析，观察有机和非有机牛乳FAs指纹的自然聚类特征，再结合描述性统计评价有机和非有机乳，以及不同乳企有机和非有机乳FAs的整体差异。建立SIMCA判别模型进一步论证以FAs指纹判别有机乳和非有机乳的可行性，并评价了SIMCA模型的判别准确率。利用IBM-SPSS 23.0对FAs数据进行描述性统计比较，结果以平均值±标准差表示；每一种FAs的差异进行独立样本t检验，FAs的整体差异进行配对t检验。不同企业/品牌有机乳对非有机乳FAs的差异比值用“有机乳脂肪酸/非有机乳脂肪酸”表示，脂肪酸比值1.0以上为增加，1.0以下为减少。
2 结果与分析
全部有机和非有机乳FAs指纹PCA分析中有分离趋势，但二者交叉和胶着部分较多。鉴于热稳定试验中原乳和UHT乳指纹有分离，因此对有机与非有机原乳、有机与非有机UHT乳分别进行研究。
2.1 有机与非有机牧场原乳FAs指纹特征
乳企A和乳企C两个有机与非有机牧场原乳FAs指纹PCA结果见图1～图3。乳企A和乳企C有机与非有机原乳FAs描述性统计结果见表1。
图1 乳企A和乳企C有机与非有机牧场原乳FAs指纹PCA分析图
Fig.1 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A and C dairy
图2 乳企A有机与非有机牧场原乳FAs指纹PCA分析图
Fig.2 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A dairy
图3 乳企C有机与非有机牧场原乳FAs指纹PCA分析图
Fig.3 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of C dairy
表1 有机与非有机原乳FAs描述性统计结果
Table 1 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic raw milk g/100 g
注：同一企业有机与非有机乳FAs小写字母不同，表示独立样本t检验差异显著（P＜0.05）。
脂肪酸 乳企A 乳企C 乳企A（有机）∶乳企C（有机）有机（N=20）非有机（N=10） 有机∶非有机 有机（N=14）非有机（N=15） 有机∶非有机饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA） 58.69±1.95b 60.35±1.92a 1.0 60.99±2.21a 59.31±2.03b 1.0 1.0单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）23.15±2.63b 24.17±2.28a 1.0 22.93±2.16b 24.02±1.35a 1.0 1.0多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）4.04±0.46a 2.83±0.85b 1.4 2.86±0.18b 2.99±0.33a 1.0 1.4反式脂肪酸（trans fatty acids，TFA） 2.74±0.59 2.57±0.77 1.1 1.47±0.24b 1.76±0.46a 0.8 1.9 n-3 0.57±0.10a 0.40±0.22b 1.4 0.23±0.05a 0.19±0.03b 1.2 2.5 n-6 3.48±0.42a 2.44±0.84b 1.4 2.63±0.19b 2.80±0.33a 0.9 1.3 C14∶0 9.93±0.72 10.23±1.27 1.0 9.39±1.16a 8.60±0.86b 1.1 1.1 C16∶0 27.21±1.70b 29.49±2.80a 0.9 31.64±1.64a 29.48±0.75b 1.1 0.9 C18∶0 12.01±0.82a 10.71±1.62b 1.1 10.33±1.68b 12.22±0.82a 0.8 1.2 C14∶1 0.69±0.21 0.75±0.28 0.9 0.72±0.15a 0.59±0.12b 1.2 1.0 C16∶1 1.08±0.23b 1.27±0.18a 0.9 1.47±0.10a 1.36±0.11b 1.1 0.7 C18∶1n9t 2.47±0.57 2.35±0.78 1.1 1.47±0.24b 1.76±0.46a 0.8 1.7 C18∶1n9c 20.75±2.67b 21.5±2.37a 1.0 20.48±2.32b 21.8±1.41a 0.9 1.0 C18∶2n6c 3.12±0.42a 2.10±0.85b 1.5 2.49±0.20b 2.67±0.33a 0.9 1.3 α-C18∶3n3 0.49±0.07a 0.31±0.16b 1.6 0.22±0.04a 0.18±0.02b 1.2 2.2
PCA得分向量图（图1a）显示原乳按有机和非有机饲养模式分开聚类，两个乳企有机乳分布在图中左右两边，非有机乳集中分布在中间位置，说明有机与非有机牧场原乳的FAs指纹存在差异；图2a和图3a显示两个乳企有机和非有机牧场原乳在三维空间聚类位置缺乏一致性，说明两个企业奶牛饲养模式标准及饲料配比等都存在较大差异。
由表1可知，两个乳企有机与非有机牧场乳原乳中大部分FAs独立样本t检验差异显著（P＜0.05），少数 FAs差异不显著（P＞0.05）；但整体上 FAs配对 t检验无显著差异（P＞0.05），说明传统差异检验不能区分有机与非有机牧场原乳FAs复杂的整体差异。
由图1b、图2b和图3b结合描述统计（表1）可知，对有机和非有机牧场原乳分离贡献大的特征FAs有PUFA、n-3PUFA（α-C18∶3n3）、n-6PUFA（C18∶2n6c）以及 C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c 等，其中 n-3PUFA（α-C18∶3n3）在两个乳企有机乳中含量均较高。两个乳企的特征FAs含量比值（有机乳脂肪酸/非有机乳脂肪酸）不同，说明不同企业有机饲料、饲养标准和动物福利等因素可能不同[20-21]。
2.2 有机与非有机UHT乳FAs指纹特征
3个品牌有机与非有机UHT乳FAs指纹PCA结果见图4、图5和图6，FAs描述性统计结果见表2。
图4 3个品牌有机与非有机UHT乳FAs指纹PCA分析图
Fig.4 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of three brands
图5 品牌A有机与非有机UHT乳FAs指纹PCA分析图
Fig.5 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of A brand
图6 品牌B有机与非有机UHT乳FAs指纹PCA分析图
Fig.6 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of B brand
图4a显示UHT乳按有机与非有机分开聚类趋势明显，有机乳聚类在分割线左侧，非有机乳聚类在分割线右侧；A和C品牌有机与非有机聚类明显分离，但B品牌有机与非有机有所交叉，说明有机与非有机UHT乳的FAs指纹不同，提示以有机和非有机UHT乳建模可行，但建模时需要分析剔除可能不严格的有机产品；A与B和C两个品牌有机UHT乳有明显的分离，但B和C品牌聚类较近，并有部分交叉，说明不同品牌有机UHT乳FAs指纹不同，即有机饲养模式或标准有差异。B和C有交叉，说明两个品牌乳源相近。总之不同企业品牌UHT乳FAs指纹有差异，可以作为UHT乳品牌鉴别的方法。图5a和图6a显示单一品牌有机和非有机UHT乳完全分开聚类，再次证明有机和非有机UHT乳可以鉴别；两个品牌UHT乳有机和非有机聚类基本都是左右分开聚类，分离位置和趋势有一致，这可能与UHT乳生产使用大罐多牧场混合原奶及标准化工艺有关，但也再次证明有机和非有机UHT乳的鉴别会比较稳健。
表2 有机与非有机UHT乳FAs描述性统计结果
Table 2 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic UHT milk g/100 g
注：同一品牌有机与非有机乳FAs小写字母不同，表示独立样本t检验差异显著（P＜0.05）。
有机（N=5） 非有机（N=10） 有机∶非有机 有机（N=5） 非有机（N=10） 有机∶非有机 有机（N=5）SFA 58.87±1.50b 61.61±1.58a 1.0 60.49±0.51 60.22±1.64 1.0 59.46±0.98 1.0∶1.0∶1.0 MUFA 23.82±1.19 23.21±1.34 1.0 23.56±1.20 24.01±1.37 1.0 24.07±0.57 1.0∶1.0∶1.0 PUFA 4.38±0.55a 3.15±0.29b 1.4 3.61±0.44a 3.04±0.72b 1.2 3.85±0.20 1.0∶0.8∶0.9 TFA 2.58±0.27a 1.92±0.33b 1.3 2.22±0.18b 2.54±0.84a 0.9 2.37±0.36 1.0∶0.9∶0.9 n-3 0.48±0.08a 0.3±0.11b 1.6 0.33±0.05a 0.28±0.08b 1.2 0.40±0.07 1.0∶0.7∶0.8 n-6 3.90±0.48a 2.85±0.23b 1.4 3.27±0.42a 2.76±0.64b 1.2 3.45±0.19 1.0∶0.8∶0.9 C14∶0 10.26±0.36a 9.82±0.58b 1.0 9.62±0.20a 9.25±1.01b 1.0 9.47±0.35 1.0∶0.9∶0.9 C16∶0 27.08±1.91b 31.69±1.65a 0.9 30.12±0.98b 31.22±1.06a 1.0 28.88±1.48 1.0∶1.1∶1.1 C18∶0 11.22±0.95a 10.3±0.81b 1.1 11.31±0.95 10.89±1.08 1.0 11.92±1.30 1.0∶1.0∶1.1 C14∶1 0.71±0.08 0.71±0.12 1.0 0.67±0.06 0.66±0.09 1.0 0.64±0.09 1.0∶0.9∶0.9 C16∶1 1.14±0.23b 1.37±0.15a 0.8 1.23±0.16b 1.37±0.22a 0.9 1.17±0.12 1.0∶1.1∶1.0 C18∶1n9t 2.32±0.28a 1.70±0.27b 1.4 1.95±0.17b 2.28±0.79a 0.9 2.11±0.32 1.0∶0.8∶0.9 C18∶1n9c 21.39±1.05a 20.61±1.35b 1.0 21.20±1.05 21.48±1.25 1.0 21.77±0.59 1.0∶1.0∶1.0 C18∶2n6c 3.54±0.47a 2.50±0.16b 1.4 2.93±0.39a 2.45±0.62b 1.2 3.09±0.20 1.0∶0.8∶0.9脂肪酸 A品牌 B品牌 C品牌 A品牌（有机）∶B品牌（有机）∶C品牌（有机）α-C18∶3n3 0.42±0.07a 0.25±0.10b 1.7 0.28±0.06a 0.23±0.06b 1.2 0.32±0.03 1.0∶0.7∶0.8
由表2可知，两个品牌有机与非有机UHT乳多数FAs差异显著（P＜0.05），少数FAs差异不显著（P＞0.05），但整体上FAs配对样本t检验无显著差异（P＞0.05），说明传统检验不能区分有机与非有机UHT乳FAs构成的整体差异。
由图4b、图5b和图6b结合描述统计（表2）可知，形成有机与非有机UHT乳分离的特征FAs，C18∶2n6c和α-C18∶3n3含量在有机UHT乳中显著高于非有机UHT 乳；C16∶0 和C16∶1 含量在非有机 UHT 乳中显著高于有机UHT乳。复合指标中PUFA、n-3系PUFA、n-6系PUFA含量在有机UHT乳中显著高于非有机UHT乳。3个品牌有机UHT乳中关键FAs含量有较大差别，如A、B和C品牌有机UHT乳中α-C18∶3n3含量比值为 1∶0.7∶0.8；A 品牌有机 UHT 乳中 α-C18∶3n3和C18∶2n6c相对于非有机乳的比值高于B品牌，这可能是因为不同企业饲养模式标准的差异。
2.3 有机与非有机UHT乳SIMCA模型的建立及判别
为进一步论证以FAs指纹鉴别市售有机和非有机UHT乳的可行性，建立和评价基于在PCA分析基础上发展起来的SIMCA判别模型，结果见图7。
图7 有机与非有机UHT乳FAs指纹SIMCA模型
Fig.7 SIMCA model for organic and non-organic UHT milk by FAs fingerprint
图7显示，有机与非有机UHT乳聚类云有明显分离，有机UHT乳的云图分布在三维图左上方，非有机UHT乳的云图分布在三维图右下方，与PCA分析结果一致。
SIMCA模型内部验证和外部验证的样本集及结果见表3。
表3 SIMCA验证内部和外部模型
Table 3 Internal and external verification on SIMCA model
项目 内部验证 外部验证验证样本量 验证样本量 判断正确量A品牌有机 10 15 15 B品牌有机 6 10 10 C品牌有机 10 13 13 A品牌非有机 19 20 19 B品牌非有机 20 26 19合计 65 84 76判断正确量10 6 10 19 20 65
由表3可知，内部验证，用35份乳样平行测定结果建立的模型逐一对每个样品判别，判断正确率为100%；外部验证，每次人工随机抽出2～7套样本FAs数据组，用其余样本数据组建模，对抽出的样本数据进行判别；这种随机组合建模验证重复20次，累计84个验证样本量，判别正确率为90.5%，其中B品牌非有机UHT乳判别错误次数较多，再次说明不同企业饲养模式标准不同。考虑本次建模训练样本集数量较小，但已达到较为理想的判别正确率，若后续扩大样本量，调整模型参与判别的因子数量并对SIMCA模型进行反复的“训练”，可建立更稳健的模型，达到更准确的判别结果。
本次建模选取含量0.5 g/100 g乳脂肪以上的16种FAs，每一种FAs对建立SIMCA模型的贡献率见图8。
图8 各种脂肪酸对SIMCA模型建立的贡献率
Fig.8 Contribution percentage of various FAs to the SIMCA model
由图8可知，造成有机和非有机UHT乳差异的主要 FAs中C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c对 SIMCA 模型建立的贡献率均高于80%，且本次参与建模的16种FAs中12种FAs的贡献率均高于50%，说明这几种FAs均为构建SIMCA模型的重要指标。
3 讨论
有机饲养不仅意味着更好的动物福利和更优良的饲养条件，还意味着食品更安全和更营养。研究表明不同饲养模式对乳FAs有决定或影响的作用，不同饲养模式乳FAs差异主要与饲料组成及配比的不同有关[7-9]。本研究PCA结果显示，有机和非有机乳以FAs指纹各自聚类；不同企业有机与非有机牧场原乳聚类位置缺乏一致性，不同企业有机和非有机UHT乳分开聚类的位置和趋势存在一致性。原乳聚类位置缺乏一致性的可能的原因是不同企业有机标准、日粮组成及动物福利等状况和待遇不同；而UHT乳聚类位置和趋势的一致性可能与UHT乳生产中使用大罐多牧场混合原奶以及标准化等工艺有关。另外不同企业关键乳FAs含量比值（有机乳FAs/非有机乳FAs）的不同，同样也可以对饲养的效果及科学性进行评价。
化学计量学多变量分析策略、原理及方法是解析多指标内外变化规律和模式的理想工具，PCA是一种最常用的化学计量学方法，普遍用于多指标数据集结构和内在数据结构或模式的解析，可对样品进行无监督的聚类、分类和模式分析[22-25]，可以直观观测多个样本在二维或三维空间的聚类或离散分布状况，并观察样本所归属的簇/群，通过观察载荷图可以找出对分类贡献大的因素。传统统计结果中多数FAs在有机与非有机乳间存在显著或极显著差异，但单指标的孤立分析不足以证明不同饲养模式会产生特征性作用，即传统统计和差异检验对多变量分析能力存在缺陷[14-15]，因此需要结合化学计量学对乳FAs复杂的变化模式进行区分。化学计量学分析手段与传统描述性统计相辅相成，为评价有机乳制品真实性鉴别方面提供了创新的策略、原理和方法。
食品完整性和真实性不仅关系消费者健康、权益和尊严，而且关乎市场竞争秩序和行业的健康发展。近年来判别分析已逐步应用于食品真实性研究方面，如对乳制品和肉类的研究。本研究构建有机与非有机UHT乳SIMCA模型，平行测定数据一并纳入聚类分析，提高了模型的稳健度。乳样的聚类符合有机与非有机分类，结果与PCA一致。内部和外部验证准确率分别为100%和90.5%，证明利用FAs指纹建立有机与非有机UHT乳真实性判别模型具有可行性。外部验证错误主要出现在B品牌非有机UHT乳判别中，可能是因为不同品牌饲养模式或饲料等标准有差异。当然还应继续加大其他符合有机饲养条件的有机乳产品，进行验证和优化，以增强模型判别的稳健性。
4 结论
PCA分析可实现有机和非有机乳FAs差异的可视化观察，乳样可以根据有机和非有机自然聚类，但有机和非有机乳差异的全面评价也不能忽略描述性统计。不同企业有机和非有机乳之间关键FAs的比值不同，不同企业奶牛的有机饲养模式或标准存在差异。FAs指纹建模判别有机与非有机UHT乳可行，可获得较高的判别准确率。
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