红枣原产于中国，距今已有4 000多年的历史[1]。我国红枣种植面积较广，产量居世界第一[2]，主要分布于新疆、河北和陕西等地。新疆由于降雨量少，日照充足，有利于红枣中糖分的积累[3-4]。红枣具有较高的营养价值和药用价值[5]，其不仅有较强的抗氧化能力[2]，还具有抗癌、保肝护肝、美容养颜等功效[6]。许多研究表明，红枣具有多种功效的原因是枣肉和枣皮中含有多种化学成分，包括三萜类化合物、多酚、矿物质、氨基酸和多糖等[7]。
目前，国内外对红枣的研究主要集中于多糖等功能成分的提取分析，对红枣中总三萜的提取及抗氧化和抗增殖活性报道较少。三萜类化合物具有良好的抗肿瘤作用[8]，可应用于食品或制药行业中[9]，提高红枣产业经济效益[10]。
枣渣是三萜类化合物的良好来源[11]，但在红枣加工过程中常被当作废弃物直接丢弃或掩埋，这种处理方式不仅会造成三萜类化合物的浪费，还会造成环境污染[12-13]。因此，为了提高枣渣的利用率，充分挖掘其潜在价值，本试验将超声辅助技术应用于枣渣总三萜的提取，并通过响应面法对枣渣中总三萜的提取条件进行优化并研究其抗氧化和抗增殖活性，为枣渣的深度利用提供参考依据，提高废物资源利用率。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与设备
1.1.1 枣渣的制备
枣（Ziziphus jujuba Mill.cv.Junzao）：市售。枣用去离子水清洗后，去核，捣碎，分离枣渣并冻干，-18℃保存，以备进一步试验。
1.1.2 试剂
2，2'-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑-6）磺酸（2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、2，2-二苯基-1 苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picryl Hydrazyl，DPPH）、抗坏血酸：北京索莱宝有限公司；齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸、麦珠子酸、山楂酸：上海安普实验技术有限公司；RPMI 1640培养基：美国GIBCO公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国 Sigma-Aldrich公司。
1.1.3 仪器与设备
XS-O4多功能粉碎机：上海兆中科技有限公司；DZKW-D2恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；BGZ-246电热鼓风干燥机：上海博迅实业有限公司；超声清洗槽（SK5200GT）：上海科道仪器有限公司;TDL-4A低速多管大容量离心机：上海非恰尔分析仪器有限公司；摇床（SHZ-A）：常州诺佳仪器有限公司；JO-060S超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；LE-203E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；J6紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；Synergy H1多功能酶标仪：美国博腾仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 超声辅助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）
精密称取一定量红枣渣冻干粉，置于锥形瓶中，分别设置不同提取温度、提取时间、液固比和乙醇浓度对枣渣样品（2.5 g）中的三萜进行超声辅助提取，收集滤液，并用相同体积的溶剂重复萃取（2个循环），合并滤液，浓缩并冷冻干燥。
1.2.2 常规振动提取（conventional vibrate extraction，CVE）
将样品（2.5 g）与 85 mL乙醇（64%，体积分数）混合并放置在锥形瓶中，然后使用摇床进行辅助提取。提取温度60℃，转速260 r/min，持续72 min，离心收集上清液，浓缩并冻干。
1.2.3 单因素试验
分别称取枣渣粉末 2.5 g，设置液固比 35∶1（mL/g），乙醇浓度60%（体积分数），超声温度50℃，考察超声时间分别为 20、30、40、50、60 min 时对总三萜含量（total triterpene content，TTC）的影响；设置超声时间40 min，温度 50 ℃，液固比 35∶1（mL/g），考察乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%时对总三萜含量的影响；设置液固比 35∶1（mL/g），超声时间 40 min，乙醇浓度 60%，考察超声温度分别为 40、50、60、70、80℃时对总三萜的影响；设置乙醇浓度60%，超声温度50℃，超声时间 40 min，考察液固比分别为 25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）时对总三萜含量的影响。
1.2.4 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken响应面试验设计[14]。对4个影响因素进行四因素三水平试验，以总三萜含量作为响应值，探究枣渣总三萜的最佳提取工艺条件。利用Design-Expert V8.0.6软件进行分析，建立数学回归模型，以得到最佳提取工艺，响应面因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
水平 X1乙醇浓度/%X4超声时间/min-1 60 30 0 70 40 1 80 50 X2液固比/（mL/g）25∶1 35∶1 45∶1 X3超声温度/℃40 50 60
1.2.5 总三萜含量的测定
1.2.5.1 标准曲线的绘制
参照文献[15]绘制标准曲线，得到的线性回归方程为y=25.296x-0.011，相关系数R2=0.999 3。
1.2.5.2 样品总三萜含量的测定
准确称量50.0 mg齐墩果酸标准品，用60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL的标准溶液。取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的标准溶液于具塞试管中，100℃水浴挥干，依次加入5%香草醛-冰乙酸0.4 mL，高氯酸 1.6 mL[16]。65℃水浴加热 45 min，冷却至室温，用冰乙酸定容至10.0 mL，摇匀后静置15 min。以0管为对照溶液，在548 nm处测其吸光值，按照式（1）计算总三萜含量。
式中：W为提取率，mg/g；c为计算的总三萜浓度，mg/mL；n为稀释倍数；v为样品溶液体积，mL；m为样品质量，g
1.2.6 枣渣总三萜提取物的抗氧化评价
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力
参考文献[17]的方法，分别准确吸取不同浓度待测样品2 mL，再吸取2 mL DPPH标准乙醇溶液加入到10 mL的试管中摇匀，室温（25℃）避光30 min后在517 nm处测定吸光值。重复3次，取平均值。DPPH自由基清除能力按公式（2）计算。
式中：A0为DPPH溶液的吸光度；A1为被测样品存在时的吸光度。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力
参考文献[18]略有改动，配制ABTS工作液，分别取工作液0.5 mL于试管中，依次加入不同浓度的样品溶液（浓度由低到高）0.5 mL，充分混合后反应6 min，在734 nm波长处测其吸光值。按公式（3）计算ABTS+自由基的清除能力。
式中：A1为样品吸光度；A0为空白样品吸光度。
1.2.6.3 羟基自由基清除能力
羟基自由基的清除能力按照文献[19]进行测定。样品配制浓度分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，然后各取1.0 mL分别与2 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液和2 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液混合。混合均匀后，加入1 mL 9 mmol/L过氧化氢溶液，37℃静置30 min，在510 nm处测定吸光值。羟基自由基清除能力按公式（4）计算。
式中：A2为样品吸光度；A0为空白样品吸光度；A1为超纯水代替双氧水的吸光度。
1.2.7 抗增殖活性
采用cell counting kit-8（CCK-8）试验评价枣渣总三萜抗增殖效果。A549细胞于RPMI 1640培养基中，温度37℃，5% CO2条件下培养。细胞（2×104Cells/mL）在96孔组织培养板中培养24 h，用20 μL样品（浓度为 0、0.1、0.5、1.0 mg/mL）在溶剂（0.1% DMSO）中处理48 h[20]。每个浓度试验重复3次。抑制率按公式（5）计算。
式中：A0为对照品的吸光度；A1为样品的吸光度。
1.2.8 扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析
对干燥后的样品表面进行真空喷金溅射，用扫描电子显微镜在15 kV加速电压下测定冻干枣渣样品的微观结构。
1.3 数据处理
运用Design-Expert V8.0.6进行响应面优化处理，采用Origin2019b软件进行数据分析并绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声温度对总三萜含量的影响
超声温度对总三萜含量的影响见图1。
图1 超声温度对总三萜含量的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenoid content
由图1可以得出，总三萜得率随着超声温度的增大而不断增大，50℃时得率最高，为15.7 mg/g，继续升高温度至80℃过程中，总三萜含量逐渐下降。在一定范围内，提高超声波温度有利于三萜类化合物的浸出，但过高的温度会降低三萜类化合物的稳定性，加速破坏三萜类化合物[21]。还有一方面原因是温度较高，溶剂挥发严重，其它物质也会随之溶出[22]。故选取超声温度为50℃最合适。
2.1.2 超声时间对总三萜含量的影响
超声时间对总三萜含量的影响见图2。
图2 超声时间对总三萜含量的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on total triterpenoid content
由图2可知，在超声时间从20 min增加至40 min的过程中，总三萜含量不断增大，可能的原因是随着时间的增加使得溶质和乙醇充分接触，三萜的提取率升高[23]；当提取时间为40 min时，总三萜提取率最大，为15 mg/g；之后，随着超声时间逐渐增加至60 min，提取率缓慢下降，原因是细胞内外浓度达到平衡[24]，待析出物质减少，提取速率降低[23]。
2.1.3 液固比对总三萜含量的影响
液固比对总三萜含量的影响见图3。
图3 液固比对总三萜含量的影响
Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on total triterpenoid content
如图 3 所示，当液固比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）时，总三萜含量随着液固比的增大而增大，原因是一定范围内溶剂量的增大使得三萜类物质能更好地释放[25]，但当液固比大于 35∶1（mL/g）时，总三萜含量开始降低，可能的原因是溶剂用量增大，超声波与枣渣粉之间作用减弱，导致总三萜得率下降[26]。考虑提取率及经济效益，选取最佳液固比为 35∶1（mL/g）。
2.1.4 乙醇浓度对总三萜含量的影响
乙醇浓度对总三萜的影响见图4。
图4 乙醇浓度对总三萜含量的影响
Fig.4 Effect of ethanol concentration on total triterpenoid content
由图4可知，乙酸浓度为40%～60%时，随着乙醇浓度的增大，总三萜含量不断增大；当乙醇浓度为60%时，总三萜得率最大，为14 mg/g；乙醇浓度继续增大时，总三萜含量开始下降，可能的原因是色素及亲脂性强的成分溶出，从而导致枣渣总三萜的含量降低[27]。其次，总三萜通常以苷或苷元存在，苷易溶于水，苷元易溶于醇，乙醇浓度过高或过低都不利于二者的充分提取[28]。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面设计结果
响应面试验能够考察多因子之间的影响，得到的三维立体图形在反映因变量变化程度的同时，通过自变量的相互影响确定因变量的最佳条件。本试验中，利用响应面软件Design-Expert V8.0.6设计四因素三水平的试验，设计方案与结果见表2，回归模型方差分析见表3。
表2 枣渣中TTC提取的响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface design and results of extraction of total triterpenoids from jujube residue
序号 X1超声温度/°C Y总三萜含量/（mg/g）1 50 60 25∶1 70 10.400 2 50 80 35∶1 70 12.400 3 59 80 25∶1 60 11.420 4 50 60 35∶1 80 10.400 5 50 80 25∶1 80 9.200 6 50 80 35∶1 70 12.700 7 60 80 45∶1 70 12.400 8 40 60 35∶1 70 15.570 9 60 100 35∶1 70 9.600 10 50 80 35∶1 70 13.000 11 40 80 25∶1 70 13.200 12 50 80 45∶1 80 10.800 13 50 60 45∶1 70 10.000 14 60 80 35∶1 80 10.000 15 50 80 35∶1 70 13.540 16 60 60 35∶1 70 11.700 17 50 80 35∶1 70 12.600 18 60 80 25∶1 70 11.600 19 60 80 35∶1 60 12.940 20 50 100 25∶1 70 10.000 21 50 100 45∶1 70 9.380 22 40 80 45∶1 70 15.580 23 50 100 35∶1 60 10.800 24 40 80 35∶1 80 11.510 25 40 100 35∶1 70 11.000 26 50 60 35∶1 60 9.200 27 40 80 35∶1 60 15.512 28 50 80 45∶1 60 10.400 29 50 100 35∶1 80 8.400 X2超声时间/min X3液固比/（mL/g）X4乙醇浓度/%
表3 枣渣TTC的二次模型方差分析结果
Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for quadratic models on total triterpenoids of jujube residue
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 74.51 14 5.32 45.14 ＜0.000 1 **X1 20.59 1 20.59 174.66 ＜0.000 1 **X2 0.16 1 0.16 1.33 0.268 7 X3 0.034 1 0.034 0.29 ＜0.000 1 **X4 1.11 1 1.11 9.42 0.008 3 X1X2 2.64 1 2.64 22.39 0.000 3 **X1X3 0.36 1 0.36 3.05 0.000 3 **X1X4 2.64 1 2.64 22.39 0.000 3 **X2X3 0.37 1 0.37 3.16 0.097 4 X2X4 3.24 1 3.24 27.48 0.000 1 **X3X4 1.72 1 1.72 14.55 0.000 3 **X12 5.07 1 5.07 43.02 ＜0.000 1 **X22 18.19 1 18.19 154.23 ＜0.000 1 **X32 10.39 1 10.39 88.12 ＜0.000 1 **X42 7.95 1 7.95 67.40 ＜0.000 1 **残差 1.65 14 0.12失拟项 1.45 10 0.14 2.87 0.160 9纯误差 0.20 4 0.051 R2 0.978 3
如表2所示，枣渣提取物的TTC为8.400 mg/g～15.580mg/g，对数据进行回归拟合得到TTC含量的二阶多项式方程：Y=12.65-1.31X1-0.11X2-0.053X3-0.30X4-0.81X1X2-0.30X1X3-0.81X1X4-0.30X2X3-0.90X2X4+0.66X3X4+0.88X12-1.67X22-1.27X32-1.11X42。
采用方差分析和决定系数（R2）来检验TTC的响应面法模型的充分性。表3显著性结果表明，总三萜含量的回归模型差异为极显著（P＜0.000 1），总三萜含量与X1（温度）、X3（液固比）2个因素之间的线性关系极显著，回归模型的失拟项为0.160 9，不显著（P＞0.05）。模型的校正决定系数为0.956 6，说明有4.34%的情况不能以此模型进行解释，相关系数为0.978 3，综上，该模型与实际试验拟合程度较高，可以较为合理地表述响应值和4个因素之间存在的线性关系。因此，该回归方程适用于此模型。在此试验中，还可以通过各因素F值来推断该因素对试验结果的重要性，因素的F值越大，则对该模型结果影响也越大。由表3可知，各因素对试验结果的影响大小依次为X1＞X4＞X2＞X3，即超声温度＞乙醇浓度＞超声时间＞液固比。
2.2.2 响应面的分析及优化
图5表示各因素交互作用对总三萜含量的影响，随着各变量的增加，总三萜含量呈现先增大后逐渐减小的变化趋势，说明这些变量的交互作用对总三萜含量的影响也比较大，有相关研究表明，液固比和乙醇浓度是影响响应面法提取三萜类化合物最佳工艺条件的重要因素[29]。除此之外，等高线的图形均为椭圆形，说明各变量的交互作用显著[30]。
图5 超声时间、液固比和乙醇浓度对TTC影响的响应面图和等高线图
Fig.5 Surface plot and contour plot of the effects of ultrasonic time，liquid-to-solid ratio，and ethanol concentration on total triterpenoid content
2.2.3 模型验证
响应面模型优化的最佳工艺为超声温度60℃，超声时间 42.04 min，液固比 34.34∶1（mL/g），乙醇浓度63.35%，为了便于工业操作，确定的最终工艺为超声温度 60 ℃，超声时间 42 min，液固比 34∶1（mL/g），乙醇浓度64%，此条件下总三萜得率为15.854 mg/g，与模型预测值的相对误差（15.799 mg/g）为0.35%。因此，该优化提取条件是可行的，具有实际应用价值。
2.3 抗氧化试验结果
枣渣总三萜提取物抗氧化试验结果见图6。
图6 枣渣总三萜提取物体外抗氧化活性
Fig.6 Antioxidant activity of total triterpenoid extract from jujube residue in vitro
a.DPPH自由基清除能力；b.ABTS+自由基清除能力；c.羟基自由基清除能力。
由图6可知，通过DPPH、ABTS+和羟基自由基清除活性测试，UAE提取物的IC50值分别为0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取 物的 IC50值分别为1.000、0.665、1.043 mg/mL。在本研究中，UAE 提取物的抗氧化能力明显高于CVE提取物，这可能是红枣渣中富含三萜类化合物，由于超声波的作用使其更大程度地释放，具有更好的自由基清除活性[31-32]。此外，有报道表明酚酸中的没食子酸也具有较强的抗氧化性能[33]。
2.4 抗A549细胞增殖试验结果
CVE和UAE提取物对A549癌细胞增殖的影响结果见表4。
表4 枣渣中三萜类对A549癌细胞增殖的影响
Table 4 Effect of jujube residue extract on proliferation of A549 cancer cells
注：同行不同字母表示显著差异（p＜0.05）。
浓度/（mg/mL）抑制率/%VC CVE提取物 UAE提取物0 0 0 0 0.25 19.55a±0.82 12.52c±0.89 16.86b±0.84 0.50 35.22a±0.92 19.82c±0.84 26.24b±1.18 1.00 59.16a±1.21 27.18c±1.18 37.62b±0.97
如表4所示，不同浓度提取物对A549细胞的增殖率均有不同程度的抑制作用，且抑制率随提取物浓度的增加而增加。当浓度为1 mg/mL时，CVE和UAE的抑制率分别为27.18%和37.62%，UAE提取物的抑制率仅次于VC。相关研究表明，含有乙酰基的三萜类化合物能够有效抑制A549癌细胞的增殖[20]。
2.5 SEM分析
原样及两种方式提取三萜类化合物后枣渣扫描电镜图见图7。
图7 枣渣扫描电镜图
Fig.7 Scanning electron microscope photos of jujube residue
a.原样对照;b.CVE处理样品;c.UAE处理样品。
由图7发现，不同处理方法下枣渣的微观结构有显着差异。未处理的样品表面光滑且密度大（图7a）。CVE处理的（图7b）枣渣微观结构相对均匀，细胞壁受损较少；超声波预处理则导致细胞产生大量的缺口，细胞壁破坏严重（图7c）。据报道，超声处理会导致细胞壁塌陷，其原理是在超声波作用下，空化产生大量小气泡，气泡破裂扩大孔径并形成微观通道，从而在更大程度上损害细胞[16]，使活性成分得到更多地释放。
3 结论
在单因素试验基础上，运用响应面优化超声波辅助提取枣渣中总三萜的试验参数并建立其提取工艺二次多项式理论模型，模型拟合度良好。得到最佳提取条件：超声温度60℃，超声时间42 min，液固比34∶1（mL/g），乙醇浓度 64%，此条件下得到的总三萜含量最高，为15.854 mg/g，与模型预测结果接近，说明此优化工艺参数可靠。与振荡提取法对比，超声辅助处理的样品总三萜含量较高，通过扫描电镜分析，UAE处理的细胞壁被严重破坏，而CVE处理的细胞表面相对较为平滑。对两种提取物进行抗氧化评价，得出超声辅助提取物清除DPPH、ABTS+和羟基自由基的IC50值分别为 0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取物的 IC50值分别为1.000、0.665、1.043 mg/mL。当提取物浓度为1 mg/mL时，两者对A549癌细胞的抑制率分别为37.62%和27.18%，UAE提取物的抗氧化能力和抗增殖能力明显高于CVE提取物。枣渣中总三萜含量较为丰富，这些低成本的可再生资源若能得到较好的开发，并应用于医疗和食品行业，提高其利用价值的同时将对经济和环境产生积极的影响。
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