传统上，塑料保鲜膜因其性能稳定、成本低廉而被用于果蔬及肉制品等食品的保鲜，但塑料保鲜膜存在降解性差、对人体有害等缺点[1]。近年来，可食性涂膜保鲜因具有诸多优良性能已成为食品保鲜领域的一种新型绿色保鲜技术，越来越受到人们的关注[2-5]。在保鲜膜中添加多糖[6-7]、蛋白质[8-9]、脂质[10-11]等天然生物聚合物可以显著提高可食性膜的生物活性及理化功能特性。然而，使用单一多糖制成的保鲜膜，其强度、阻隔性、稳定性等理化性能较差[12]。目前常用改善纯多糖可食性膜的理化性质方法是在膜中添加成膜剂、保湿剂等天然提取物，最终形成复合保鲜膜[13-15]。
油茶籽是山茶科（Camellia）油茶（Camellia oleifera Abel）树的种子，是中国特有的木本植物。油茶粕是油茶籽经榨油后的饼状残渣，中国每年生产油茶籽约100万t,副产物油茶粕高达68万t，然而油茶粕却经常被人们所忽视。研究发现，油茶粕的主要成分是多糖，含量为26.09%，另外还含有丰富的茶皂素、茶多酚、糖萜素、黄酮类等多种活性成分，具有良好的抗氧化、降血糖和抗肿瘤能力等保健作用和药用价值[16-18]。而对于鸡肉的保鲜技术也有所报道，其中杨金来等[19]发现肉桂醛具有抗癌、防治糖尿病、抗炎等药理活性，同时对鸡肉有保鲜功能；郑玉玺等[20]将解壳聚糖-荔枝木质精油应用到可食膜中对冷鲜鸡肉进行保鲜，结果表明添加荔枝木质精油的壳聚糖复合可食膜包裹保鲜鸡肉与普通保鲜膜包裹相比，可有效延长冷鲜鸡肉的货架期，具有更好的保鲜效果，但还未见以油茶粕多糖为主要材料，辅以高酰基结冷胶、甘油、普鲁兰多糖研制复合保鲜膜应用于鸡肉的相关研究。
本研究以油茶粕多糖为抗氧化剂和抑菌剂，以高酰基结冷胶和普鲁兰多糖为成膜剂，以甘油为保湿剂研制鸡肉复合保鲜涂膜。以鸡肉的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、pH 值、菌落总数值为考察指标，通过单因素及正交试验优化复合膜的最佳配比，为油茶粕多糖复合保鲜膜的产业化应用提供科学指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
油茶籽饼：广东友丰油茶科技有限公司；新鲜鸡胸肉：市售，用消毒过的刀具清理鸡肉上多余的脂肪和筋络，切分为20 g的小块；大肠杆菌（Escherichia coli，革兰阴性菌 G-）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革兰氏阳性菌G+）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）：韶关学院英东生物与农业学院微生物实验室；甘油、普鲁兰多糖：安徽中旭生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DHP-9052型恒温培养箱、DZD-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；FZ102-SIM型真空冷冻干燥设备：德国西门子公司；VER-TEX70型红外光谱分析仪：布鲁克（北京）科技有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海雅荣生化有限公司；FSH-2A型可调高速均质器：上海那艾精密仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 油茶粕多糖抑菌性分析
参考迪力努尔·阿不都热合曼等[21]的方法，采用滤纸片法，以抑菌圈直径和最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为指标，测定油茶粕多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉的抑菌活性。
1.3.2 油茶粕多糖抗氧化活性测定
参照Ajiboye等[22]的方法，以普通饼干为对照，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，根据如下公式计算DPPH自由基清除率，并计算IC50值。
式中：A1为样品组吸光值；A2为对照组吸光值；A0为空白组吸光值。
1.3.3 油茶粕多糖提取液制备
采用水提醇沉法提取油茶粕多糖。由于油茶多糖的提取液呈褐棕色影响使用效果，因此需对多糖提取液进行脱色处理。脱色方法参考蒋海明[23]的方法：油茶粕多糖 →[料液比 1∶15（g/mL）]加入蒸馏水于 75 ℃下浸提2 h→过滤取清液→加入3%的颗粒活性炭-白土混合脱色剂（颗粒活性炭占10%）→70℃水浴25 min→3 500 r/min离心20 min→上清液为脱色的油茶粕多糖提取液。
1.3.4 复合保鲜涂膜单因素试验
复合保鲜膜制备：将油茶粕多糖提取液与高酰基结冷胶、甘油、普鲁兰多糖混合，加去离子水至30 mL，在90℃下，不断搅拌至完全溶解得到复合保鲜膜液，然后倒入无菌培养皿冷却凝固即得复合保鲜膜。
1.3.4.1 油茶粕多糖提取液添加量对鸡肉保鲜的影响
取甘油0.3 g，高酰基结冷胶0.15 g，普鲁兰多糖0.1 g，油茶粕多糖提取液添加量分别为0%、5%、10%、15%、20%，制得复合保鲜膜液，然后涂抹于鸡肉表面，将鸡肉置于4℃冰箱保存，5 d后取出抽取样品进行分析测定。以鸡肉的挥发性盐基氮值、pH值、菌落总数值为指标，确定油茶粕多糖提取液最适添加量。
1.3.4.2 高酰基结冷胶添加量对鸡肉保鲜的影响
取甘油0.3 g，油茶粕多糖提取液15%，普鲁兰多糖0.1 g，高酰基结冷胶添加量分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g，其余操作同1.3.4.1，确定高酰基结冷胶最适添加量。
1.3.4.3 甘油添加量对鸡肉保鲜的影响
油茶粕多糖提取液15%，高酰基结冷胶0.15 g，普鲁兰多糖 0.1 g，甘油添加量分别为 0、0.2、0.3、0.4、0.5 g，其余操作同1.3.4.1，确定甘油最适添加量。
1.3.4.4 普鲁兰多糖添加量对鸡肉保鲜的影响
取甘油0.3 g，油茶粕多糖提取液15%，高酰基结冷胶0.15 g，普鲁兰多糖添加量分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20 g，其余操作同1.3.4.1，确定普鲁兰多糖最适添加量。
1.3.5 分析测定
1.3.5.1 菌落总数的测定
按照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》方法测定[24]。其评定标准为一级鲜肉细菌总数≤106CFU/g，二级鲜肉细菌总数≤108CFU/g，变质肉细菌总数＞108CFU/g。
1.3.5.2 挥发性盐基氮的测定
按照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》方法测定[25]，采取半微量定氮法测定，其评价标准：一级鲜度≤15 mg/100 g，二级鲜度≤25 mg/100 g，变质肉＞25 mg/100 g。
1.3.5.3 pH值的测定
将鸡肉切碎并浸泡在100 mL蒸馏水中并过滤，然后用pH计测量鸡肉碎滤液的pH值。pH值可以表示肉的新鲜度标准：pH5.18～6.12为一级鲜度，pH6.13～6.16为二级鲜度，pH6.17以上为变质肉[26]。
1.4 数据分析
运用EXCEL和SPSS17.0软件进行数据分析，测定结果以平均值±标准差表示，并采用GraphPad Prism5.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 油茶粕多糖的抑菌性
油茶粕多糖对供试菌种抑菌活性的影响见表1。
表1 油茶粕多糖对供试菌种抑菌活性
Table 1 Antibacterial activity of polysaccharide from camellia meal on tested strains
注：同列不同字母代表显著差异，p＜0.05。
受试微生物 抑菌圈直径/mm MIC/%酵母菌 22.73±0.02d 0.14黑曲霉 19.62±0.02c 0.39大肠杆菌（G-） 13.85±0.03b 0.52金黄色葡萄球菌（G+） 11.25±0.03a 0.67
由表1可知，油茶粕多糖对酵母菌的抑菌作用最大，对黑曲霉、大肠杆菌的抑菌作用次之，对金黄色葡萄球菌作用最小，最小抑菌浓度分别为0.14%、0.39%、0.52%、0.67%。油茶粕多糖既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌，具有广谱抑菌性。
2.2 油茶粕多糖抗氧化活性
油茶粕多糖对DPPH自由基清除能力见图1。
图1 油茶粕多糖对DPPH自由基清除能力
Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of camellia meal polysaccharide
由图1可知，油茶粕多糖对DPPH自由基清除能力呈剂量效应关系。油茶粕多糖对DPPH·的清除能力的IC50为（2.44±0.16）mg/mL，清除能力弱于 VC[IC50＝（0.36±0.08）mg/mL]。油茶粕多糖有一定的抗氧化活性。
2.3 复合涂膜保鲜工艺单因素试验结果
各因素对保鲜膜保鲜效果的影响见图2～图5。
图2 多糖提取液添加量对保鲜膜保鲜效果的影响
Fig.2 Effect of additive amount of polysaccharide extract
图3 高酰基结冷胶添加量对保鲜膜保鲜效果的影响
Fig.3 Effect of additive amount of gella gum
图4 甘油添加量对保鲜膜保鲜效果的影响
Fig.4 Effect of additive amount of glycerin
图5 普鲁兰多糖对保鲜膜保鲜效果的影响
Fig.5 Effect of additive amount of pullulan polysaccharide
由图2可知，油茶粕多糖提取液的添加量为15%时，TVB-N值和菌落总数值最小，即新鲜程度最好，抑菌效果也最好，此时pH值为5.33，属于一级鲜肉范围，因此选择油茶粕多糖提取液最适添加量为15%；由图3可知，当高酰基结冷胶添加量为0.20 g时，菌落总数达到最小值，pH值为5.24，当高酰基结冷胶添加量为0.25 g时，TVB-N值最小。但是由于当高酰基结冷胶添加量为0.25 g时，膜液里会含有未能完全溶解的颗粒，影响成膜效果，故选择高酰基结冷胶最适添加量为0.20 g；从图4看出，当甘油的添加量为0.4 g时，TVB-N值和菌落总数值达到最小值，pH值为5.33，属于一级鲜肉范围，此时抑菌效果最好，因此选择甘油的最适添加量为0.4 g；从图5看出，当普鲁兰多糖的添加量为0.15 g时，TVB-N值和菌落总数值达到最低，pH值为5.33，属于一级鲜肉范围，此时新鲜度最好，抑菌效果最好，因此确定普鲁兰多糖的最适添加量为0.15 g。
从以上结果看出，成膜剂、油茶多糖、甘油及普鲁兰多糖的添加量无论增大还是减少，而包膜后的新鲜鸡肉pH值基本在4～6，没有超过一级鲜肉规定的范围值，因此可忽略涂膜对鸡肉pH值的影响。故在正交试验中以TVB-N值、菌落总数为考察指标。
2.4 复合涂膜保鲜工艺正交优化试验结果
正交试验结果见表2。方差分析结果见表3～表4。
表2 复合涂膜保鲜工艺优化正交试验结果
Table 2 Orthogonal experiment results for the optimization of composite coating fresh-keeping process
考察指标 试验序号 因素 TVB-N值/（mg/100 g）菌落总数/（CFU/g）A油茶粕多糖提取液添加量/%B高酰基结冷胶添加量/g C甘油添加量/g D普鲁兰多糖添加量/g 1 1（10） 1（0.15） 1（0.2） 1（0.10） 12.8 121 000 2 1 2（0.20） 2（0.3） 2（0.15） 11.4 86 300 3 3（0.25） 3（0.4） 3（0.20） 11.6 88 100 4 2（15） 1 2 3 5.9 50 200 5 2 2 3 1 6.5 57 500 1 6 6.2 52 000 7 3（20） 1 3 2 6.2 39 400 8 3 2 1 3 7.4 44 500 2 3 1 2 9 3 3 2 1 7.9 48 600 TVB-N值 K1 35.8 24.9 26.4 27.2 K2 18.6 25.3 25.2 23.8 K3 21.5 25.7 24.3 24.9 R 17.200 0.800 2.100 3.400最优组合 A2B1C3D2主次因素 A>D>C>B菌落总数 K1 295 400 210 600 217 500 227 100 K2 159 700 188 300 185 100 177 700 K3 132 500 188 700 185 000 185 000 R 162 900 22 300 32 500 49 400最优组合 A3B2C3D2主次因素 A>D>C>B
表3 以TVB-N值为指标的正交试验方差分析
Table 3 Variance of orthogonal experimental analysis with TVB-N value as index
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A 3 215.235 2 3 626.20 19.00 显著B 0.107 2 0.12 19.00 不显著C 0.74 2 0.83 19.00 不显著D 2.007 2 2.26 19.00 不显著误差 0.887 2
表4 以菌落总数为指标的正交试验方差分析
Table 4 Variance of orthogonal experimental analysis with aerobic bacterial count as index
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A 5 076 748 888.89 2 21.49 19 显著B 108 562 222.22 2 0.46 19 不显著C 234 002 222.22 2 0.99 19 不显著D 761 815 555.56 2 3.22 19 不显著误差 236 282 222.22 2
以TVB-N值来看，影响的主次因素顺序：A>D>C>B，以油茶粕多糖提取液的添加量的影响为显著，其次是普鲁兰多糖，再为甘油的添加量，影响最小的为高酰基结冷胶的添加量。最优组合为A2B1C3D2（油茶粕多糖提取液添加量为15%，普鲁兰多糖添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4 g，高酰基结冷胶的添加量为0.15 g）；从菌落总数来看，影响的主次因素顺序为A>D>C>B，以油茶粕多糖提取液的添加量的影响为显著，其次是普鲁兰多糖，再为甘油的添加量，影响最小的为高酰基结冷胶的添加量。最优组合为A3B2C3D2（油茶粕多糖提取液的添加量为20%，普鲁兰多糖的添加量为0.15g，甘油的添加量为0.4 g，高酰基结冷胶的添加量为0.2 g）。
2.5 验证试验
由正交试验得到油茶粕复合保鲜膜配方最优组合为A2B1C3D2和A3B2C3D2，每组组合做分别做3组平行试验。以TVB-N值和菌落总数为考察指标，在4℃条件下贮藏12 d，最终选择保鲜效果最好的一组为最优组合。A2D2C3B1（油茶粕多糖添加量为15%，普鲁兰多糖添加量为0.15 g，甘油的添加量为0.4 g，高酰基结冷胶的添加量为0.15 g）为试验组1，A3D2C3B2（油茶多糖的添加量为20%，普鲁兰多糖的添加量为0.15 g，甘油的添加量为0.4 g，高酰基结冷胶的添加量为0.2g）为试验组2。
验证试验结果见表5。
表5 验证试验比较分析
Table 5 Comparative analysis of verification tests
序号TVB-N值/（mg/100 g）菌落总数/（CFU/g）5 d 5 d 12 d 1 5.9 44 600 179 600 2 5.4 40 100 131 000 12 d 15.6 13.2
由表5可知，结果表明试验组2保鲜效果好。故油茶粕复合保鲜膜配方：油茶多糖的添加量为20%，普鲁兰多糖的添加量为0.15 g，甘油的添加量为0.4 g，成膜剂的添加量为0.2 g。在此条件下，对新鲜鸡肉进行涂膜，在4℃条件下贮藏12 d后的菌落总数为131 000 CFU/g，仍然符合一级鲜肉质量指标。
3 结论
油茶粕多糖对酵母菌的抑菌作用最大，对黑曲霉、大肠杆菌的抑菌作用次之，对金黄色葡萄球菌作用最小，抑菌圈大小分别为（22.73±0.02）、（19.62±0.03）、（13.85±0.02）、（11.25±0.03）mm，最小抑菌浓度分别为0.14%、0.39%、0.52%、0.67%；油茶粕多糖对DPPH自由基清除能力的IC50值为（2.44±0.16）mg/mL，大于 VC的（0.36±0.08）mg/mL，结果表明：油茶粕多糖有一定广谱抑菌性及抗氧化活性。利用油茶粕多糖为抑菌剂，辅以成膜材料及辅料制作复合保鲜膜，通过单因素及正交试验得到复合保鲜膜的最优配方：油茶粕多糖提取液添加量20%，普鲁兰多糖的添加量0.15 g，甘油的添加量0.4 g，高酰基结冷胶的添加量0.2 g，利用此条件下得到的复合保鲜膜涂抹鸡肉，在4℃条件下贮藏12 d后的菌落总数为131 000 CFU/g，符合一级鲜肉质量指标，表明复合保鲜膜具有良好的保鲜作用。
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