鱿鱼作为十分重要的海洋经济产物[1]，2019年国内海洋捕捞量约为29万吨，其中江苏地区年产量为6838吨[2]。目前，国内鱿鱼的加工制品均为初加工产品，深加工的高值化产品较少，下脚料利用率低[3]。鱿鱼内脏约占鱿鱼体重的15%[4]，富含脂肪、蛋白质、矿物质元素等，具有良好开发前景[5]。
章鱼胺（octopamine，OA）作为一种天然存在的生物胺[6]，最早是从章鱼的唾液腺中分离[7]，类似于神经递质——去甲肾上腺素[8]。已有研究表明，章鱼胺可加强小鼠脂肪细胞的脂解作用、促进人脂肪细胞的葡萄糖吸收[9]，可见在治疗肥胖症和II型糖尿病方面，章鱼胺有潜在的应用价值，可以单独或与其它原料联合用于减肥与糖尿病的治疗，也可作为健康食品原料、食品乃至临床药物的辅助制剂[10-11]。章鱼胺的生物活性研究[12-13]以及检测方法[14-16]也受到广泛关注。
目前，鱼露和枳实是天然章鱼胺的主要来源[17]，但工艺相对复杂且提取量较少，开发程度相对有限[18]。本试验以提高章鱼胺得率为目标，采用5%三氯乙酸为提取剂提取鱿鱼内脏中的章鱼胺，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken中心组合法设计响应面试验，优化章鱼胺提取工艺条件，并以抗坏血酸为阳性对照，考察章鱼胺体外抗氧化活性，以期为海洋生物高值化利用和开发天然抗氧化剂提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱿鱼冻品：市售；章鱼胺盐酸盐标准品（≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane THAM，Tris]（ 均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正丁醇、氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸、磷酸二氢钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三氯甲烷（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；乙腈（色谱纯）：德国达姆施塔特公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Aglient 1260，配有紫外检测器）：美国Aglient公司；高剪切均质乳化机（D-500）：德国WIGGENS有限公司；分析天平（TP-4101）：美国丹佛仪器有限公司；叠加式恒温振荡器（IS-RDS3）：美国精骐有限公司；冷冻高速离心机（Allegra X-30R）：美国BECKMAN有限公司；快速混匀器（XK96-A）：江苏新康医疗器械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
鱿鱼解冻，取内脏，使用高剪切均质乳化机匀浆，置于-20℃冰箱中贮存。
1.3.2 章鱼胺提取
准确称取鱿鱼内脏匀浆10 g，加入适量的5%三氯乙酸，置于恒温振荡器进行振荡提取，5 000 r/min离心10 min，收集上清液。准确移取10 mL上清液于25 mL离心管中，调节溶液pH值为12，加入10 mL正丁醇/三氯甲烷（体积比1∶1）混合溶液，振荡萃取15 min，5 000 r/min离心10min，收集上清液。将所得萃取液进行浓缩，加入0.1mol/L盐酸振荡，过0.45μm微孔滤膜待测。
1.3.3 单因素试验
分别设置不同提取时间（1、2、3、4、5 h）、提取温度（20、30、40、50、60 ℃） 和料液比 [1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）]提取鱿鱼内脏中章鱼胺。以章鱼胺得率为评价指标，考察不同因素条件对鱿鱼内脏中章鱼胺得率的影响。
1.3.4 响应面优化试验
根据单因素试验结果，以鱿鱼内脏中章鱼胺得率（Y）为响应值，以提取时间、提取温度、料液比为考察因素进行响应面优化试验，采用Design-Expert 8.0.6.1软件，按照Box-Behnken中心组合法设计三因素三水平响应面试验。响应面试验因素及水平见表1。
表1 响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 因素A提取时间/hB提取温度/℃C料液比/（g/mL）-1 1 20 1∶4 0 2 30 1∶5 1 3 40 1∶6
1.3.5 章鱼胺含量测定
1.3.5.1 高效液相色谱条件
色谱柱：AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠（体积比40∶60），pH7.5；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；紫外检测波长：284 nm。
1.3.5.2 章鱼胺标准曲线绘制
准确称取章鱼胺标准品，用流动相溶解，获得浓度为1 mg/mL的母液。将母液稀释成不同倍数，配制成浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL的溶液。分别精确吸取10μL，在1.3.5.1条件下进行测定，以浓度为横坐标（X，μg/mL），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到章鱼胺回归方程为Y=5.689 4X-0.178 5（R2=0.999 8）。
1.3.5.3 章鱼胺得率计算
章鱼胺得率计算公式如下。
式中：Y为章鱼胺得率，mg/g；C为样品中章鱼胺的浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为称取鱿鱼内脏的质量，g。
1.3.6 章鱼胺体外抗氧化活性测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的测定
参照文献[19]中DPPH自由基清除能力的测定方法。用乙醇分别配制 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章鱼胺样品待测液。取2 mL不同浓度的样品溶液和1 mmol/L的DPPH溶液1 mL，充分摇匀后避光放置30 min，在517 nm测定其吸光度A1；以2 mL无水乙醇和1 mL DPPH溶液按上述方法操作测定其吸光度A0，用作空白对照；将2 mL样品和1 mL乙醇溶液混合，按上述方法操作测定其吸光度A2。配制相同浓度的VC溶液用作阳性对照。不同浓度的样品对DPPH自由基的清除率根据下列公式计算。
1.3.6.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定
参照文献[20]中超氧阴离子自由基清除能力的测定方法。用乙醇分别配制 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章鱼胺样品待测液。取2.6 mL 50 mmol/L的Tris-HCl、0.5 mL 10 mmol/L的邻苯三酚溶液于试管中，加入样品溶液1 mL，快速混匀并于20℃水浴锅中反应5 min，325 nm下测其吸光度A1；以1 mL无水乙醇代替样品溶液按上述方法操作测定其吸光度A0，用作空白对照；用0.5 mL乙醇溶液替代10 mmol/L邻苯三酚溶液，按上述方法操作测定其吸光度A2。配制相同浓度的VC溶液用作阳性对照。不同浓度的样品对超氧阴离子自由基的清除率根据下列公式计算。
1.3.6.3 羟自由基清除能力的测定
参照文献[21]中羟自由基清除能力的测定方法。用乙醇分别配制 0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mg/mL章鱼胺样品待测溶液。向试管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，10 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL，2 mL不同浓度的样品溶液，最后加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL开始反应，充分摇匀后，置于37℃水浴锅中保温反应30 min，在510 nm测定其吸光度A1；以2 mL无水乙醇代替样品溶液按上述方法操作测定其吸光度A0，用作空白对照；用1 mL乙醇溶液替代6 mmol/L H2O2溶液，按上述方法操作测定其吸光度A2。配制相同浓度的VC溶液用作阳性对照。不同浓度的样品对羟自由基的清除率根据下列公式计算。
1.4 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行响应面试验设计及分析，运用Origin 2018软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
提取时间对章鱼胺得率的影响见图1。
图1 提取时间对章鱼胺得率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of octopamine
由图1可知，当提取时间为2 h时，章鱼胺得率达到最大。但随着提取时间的继续延长，章鱼胺得率下降，这可能是由于提取时间过长导致章鱼胺降解，得率下降。因此选择提取时间1、2、3 h进行后续试验。
提取温度对章鱼胺得率的影响见图2。
图2 提取温度对章鱼胺得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction yield of octopaminea
由图2可知，章鱼胺的得率随着提取温度的升高，呈现先上升后下降的趋势。提取温度为30℃时，章鱼胺得率达到最大值。继续升高提取温度会使章鱼胺得率下降，这是因为在提取的过程中，温度的升高会使章鱼胺分解。因此选择提取温度20、30、40℃进行后续试验。
料液比对章鱼胺得率的影响见图3。
图3 料液比对章鱼胺得率的影响
Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of octopamine
由图 3 可以看出，当料液比为 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）时，章鱼胺得率随着溶剂体积的增加而增大，随后，再增加溶剂体积，得率减小。这可能是溶剂达到一定量时，溶剂中的章鱼胺浓度达到饱和，进一步增大溶剂体积可能导致其他物质的溶出。因此选择料液比1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）进行后续试验。
2.2 响应面优化试验结果
依照单因素试验的结果，选取提取时间、提取温度、料液比这3个因素作为自变量，章鱼胺得率为响应值，进行响应面分析设计试验。试验结果如表2所示。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test
试验号 因素 Y章鱼胺得率/（mg/g）A提取时间 B提取温度 C料液比1 1 0-1 2.03 2 0 0 1 5.68 3 3.87 4 1 1 0 4.00 1 0 1 5 5.90 6 0 0 0 6.60 0 0 0 7-1 3.39 8 1-1 0 3.08 0 1 4.79 10 0 -1 1 3.08 11 -1 0 -1 2.78 12 0 0 0 6.40 13 0 -1 -1 1.99 14 -1 1 0 3.94 15 0 0 0 5.62 16 -1 0 1 2.97 17 -1 -1 0 3.07 9 0 1 1
经多元拟合，得到章鱼胺得率的二次多项回归方程：Y=6.04+0.037A+0.78B+0.62C+0.012AB+0.41AC+0.078BC-1.46A2-1.06B2-1.67C2。
回归模型方差分析结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model
注：** 差异极显著，P＜0.01；* 差异显著，P＜0.05。
方差来源 总和 自由度 均方模型 34.490 9 3.830 A 5.420×10-3 1 5.42×10-3 B 3.000 1 3.000 C 2.570 1 2.570 AB 5.73×10-4 1 5.73×10-4 AC 0.680 1 0.680 BC 0.024 1 0.024 A2 8.940 1 8.940 B2 4.720 1 4.720 C2 11.700 1 11.700残差 1.030 7 0.150失拟项 0.240 3 0.082纯误差 0.780 4 0.200总误差 35.510 16 F值26.11 0.037 20.45 17.48 3.90×10-3 4.64 0.17 60.93 32.15 79.75 P值0.000 1 0.853 1 0.002 7 0.004 1 0.951 9 0.068 1 0.696 0 0.000 1 0.000 8＜0.000 1显著性************0.420.751 0
由表3可知，该模型的P=0.000 1＜0.01，失拟项P=0.751 0＞0.05，表明该回归模型极显著，拟合度高，误差小，可以用来对不同条件下章鱼胺提取效果进行预测和分析。一次项B和C影响均为极显著，另外，A2、B2、C2影响均为极显著，交互项AB、AC、BC均不显著。从F值可以得出3个因素对章鱼胺得率影响大小顺序：提取温度B＞料液比C＞提取时间A。该试验模型回归方程的 R2=0.978 0、R2Adj=0.911 9、信噪比为 10.46 6，C.V.=10.87%，表明该模型回归方程可靠性和可信度较高，能解释91.19%的响应值变化，方程合理。
2.3 交互作用分析
3个因素交互作用的响应面图及等高线图如图4～图6所示，曲线梯度反映各交互作用对章鱼胺得率的影响程度，响应面越陡峭则表示该交互作用对章鱼胺得率的影响越大[22-23]。
图4 提取时间和提取温度交互作用对章鱼胺得率影响的响应面图与等高线图
Fig.4 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction time and extraction temperature on the extraction yield of octopamine
图5 提取时间和料液比交互作用对章鱼胺得率影响的响应面图与等高线图
Fig.5 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction time and material-to-liquid ratio on the extraction yield of octopamine
图6 提取温度和料液比交互作用对章鱼胺得率的响应面图与等高线
Fig.6 Response surface plot and contour plot of the interaction effect of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the extraction yield of octopamine
由图4～图6可知，等高线图均接近圆形，相应曲面坡度较平缓，可见章鱼胺得率受提取时间、提取温度、料液比两两交互作用的影响较小。
2.4 最优工艺及验证试验
通过软件分析预测得到章鱼胺最佳提取条件：提取时间 2.04 h、提取温度 33.75℃、料液比 1∶5.2（g/mL），此时章鱼胺得率为6.25 mg/g。为验证该试验的可行性，结合实际操作，将试验条件分别修正为提取时间2.0 h、提取温度 33 ℃，料液比 1∶5.2（g/mL），进行 3 次平行验证试验，得到章鱼胺得率为6.51 mg/g，与预测值接近。
2.5 章鱼胺体外抗氧化活性测定结果
DPPH自由基清除率测定结果见图7。
图7 章鱼胺和VC对DPPH自由基的清除作用
Fig.7 The scavenging effects of DPPH free radicals by octopamine and VC
由图7可知，章鱼胺对DPPH自由基清除能力较强。在一定质量浓度范围内，随着章鱼胺和VC溶液的质量浓度增大，对DPPH自由基清除能力逐渐增强，呈现剂量效应关系。当章鱼胺的质量浓度大于1.1 mg/mL时，章鱼胺的DPPH自由基清除率趋于平缓。章鱼胺具有良好的DPPH自由基清除能力。
超氧阴离子自由基清除率测定结果见图8。
图8 章鱼胺和VC对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.8 The scavenging effects of super-oxygen anions free radicals by octopamine and VC
由图8可知，当章鱼胺和VC质量浓度增加时，其超氧阴离子自由基清除率也在持续增大。当质量浓度达到1.1 mg/mL时，章鱼胺的超氧阴离子自由基清除率为62.0%。以样品质量浓度对超氧阴离子自由基清除率作图并进行线性拟合后，计算得到章鱼胺和VC的IC50值分别为0.774 3 mg/mL和0.624 7 mg/mL。
羟自由基清除率测定结果见图9。
图9 章鱼胺和VC对羟自由基的清除作用
Fig.9 The scavenging effects of hydroxyl free radicals by octopamine and VC
由图9可知，在0.1mg/mL～1.5 mg/mL质量浓度范围内，章鱼胺和VC对羟自由基清除率随着浓度的增加而增大，当质量浓度为1.5 mg/mL时，章鱼胺的羟自由基清除率达到50%左右。虽然章鱼胺对羟自由基的清除能力明显弱于VC（VC的IC50值为0.7411 mg/mL），但是仍可以表明章鱼胺具有一定的羟自由基清除能力。
3 结论
本试验采用5%三氯乙酸提取鱿鱼内脏中的章鱼胺，在单因素试验基础上，采用响应面法优化章鱼胺提取工艺，得到最佳提取工艺条件为提取时间2.0 h、提取温度为 33 ℃、液料比 1∶5.2（g/mL），所得章鱼胺得率为6.51 mg/g，与预测值6.25 mg/g较为接近，误差较小。抗氧化试验结果表明，章鱼胺对DPPH自由基、超氧阴离子自由基以及羟自由基的清除能力均与质量浓度呈现正相关，当章鱼胺质量浓度为1.1 mg/mL时，对DPPH自由基清除率达到50%左右；章鱼胺质量浓度为1.5 mg/mL时，对羟自由基的清除率达到50%左右；章鱼胺质量浓度为1.1 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率达到60%以上。
章鱼胺作为天然产物，具有较高的安全性，本试验可为提升鱿鱼资源的利用效率、章鱼胺工业化生产以及生产天然抗氧化剂提供依据。
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