马铃薯作为中国五大主粮之一，地位仅次于小麦和玉米，其富含维生素、矿物质、蛋白质、微量元素、氨基酸等多种营养物质，在鲜切果蔬行业中有非常广阔的发展前景[1]。然而，在其加工运输过程中，由于存在机械损伤，容易发生氧化褐变，使得酚类物质被多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）氧化生成醌类物质，从而导致马铃薯组织黑色素沉积，发生软化、变色、失水以及微生物污染等问题，这大大缩短了鲜切马铃薯片的保质期，致使新鲜度降低，商品价值迅速下降，使得马铃薯产业的发展也受到很大程度的限制[2]。因此，保持马铃薯原有的营养品质，预防其褐变，对于马铃薯产业的发展具有重要意义[3]。
近年来，对于鲜切果蔬的保鲜主要包括物理保鲜和化学保鲜等技术，但这些技术存在成本高、安全性低的隐患。因此，开发一种天然无毒、成本低、安全性高的天然抗氧化褐变剂具有重大意义[4]。香椿作为楝科香椿属木本植物，具有很高的营养价值和生物活性[5]。Peng等[6]研究发现，香椿叶中含有萜类、苯丙烷类、酚类、蒽醌类、生物碱、苯丙素等多种活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降糖、抗炎等作用。Liu等[7]研究发现，山楂叶含有丰富的黄酮类和三萜类等化合物，具有很强的抗氧化、抗炎等作用。此外，Guo等[8]研究发现，葡萄籽中含有原花青素等化合物，具有良好的抗氧化活性和抑菌活性，其抗氧化能力是VC的20倍，被认为是目前新型的抗氧化剂之一。吴宁等[9]也发现，浓度为5 g/L的葡萄籽提取物能够延长香菇的保质期。添加单一的植物提取物，虽然可延长鲜切果蔬的保质期，但由于成分单一，保鲜效果不太理想。王佩华等[10]研究发现，当使用单一的抗氧化剂时，会出现用量过大的现象，使得抗氧化活性和抑菌效果均不太理想。郑贺云等[11]发现生姜提取物、柚皮提取物、荷叶提取物等复合天然提取物都有一定的防褐变作用，但使用香椿、葡萄籽、山楂叶提取物复合是否能够作为马铃薯保鲜剂的替代品，目前尚未研究。因此，本研究拟采用香椿叶、山楂叶、葡萄籽提取物为原料，以海藻酸钠为助剂，通过前期试验得到复合抗氧化剂配方，研究复合抗氧化剂对鲜切马铃薯片在储藏期间的抗氧化活性和抑菌活性的影响，以期为鲜切马铃薯货架期的延长和天然复合抗氧化剂的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香椿叶：天津科技大学香椿品种资源库科研基地；山楂叶提取物：南京草本源生物科技有限公司；葡萄籽提取物：天津尖峰天然产物研究开发有限公司；马铃薯：市售；大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌：天津科技大学食品生物技术实验室。
无水乙醇、碳酸钠（分析纯）：凯马特（天津）化工科技有限公司；海藻酸钠、氯化钙（食品级）：河南万邦实业有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）（>97%）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）（98%）：天津索罗门生物科技有限公司；福林酚：天津为科生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TGL-21高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；UV-1800紫外风光光度计：上海美谱达仪器有限公司；FD加热型冷冻干燥机：上海欣谕仪器有限公司；IKA RV 8旋转蒸发仪：瓦恩默电器股份有限公司；SB-5200DTD超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；AIphaCIean 1300超净工作台：力康精密科技（上海）有限公司；IS-RDD3恒温摇床振荡器：上海予卓仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 香椿叶提取物制备流程
鲜香椿叶→50℃低温烘干→粉碎、过筛（60目）→按照1∶15（g/mL，60%乙醇溶液）的料液比进行3次提取，合并滤液→浓缩冻干→香椿叶提取物。
1.3.2 天然复合抗氧化剂的制备
在单因素试验的基础上，以总色差△E、失重率、PPO和POD活性为考察指标，经前期试验确定原料添加比例（质量分数）为香椿叶提取物0.11%，山楂叶提取物0.06%，葡萄籽提取物0.011%，海藻酸钠0.052%。
1.3.3 马铃薯预处理
将新鲜的马铃薯经过清洗、去皮、切片，分别在浓度为0.05%的香椿叶提取物、山楂叶提取物、葡萄籽提取物、海藻酸钠以及天然复合抗氧化剂中浸泡3 min，对照组于蒸馏水中浸泡相同时间。马铃薯片自然风干后，分装于自封保鲜袋中，于4℃冰箱储藏8 d，每隔2 d测定其理化指标。
1.3.4 总酚含量的测定
取4g鲜切马铃薯，加入10 mL 60%的乙醇溶液，研磨匀浆，于4℃，10 000 r/min的条件下离心10 min，得到样品粗提液，总酚含量的测定参照Liu等[12]的方法，略作改动，取粗提液0.25 mL，加入0.8 mL浓度为20%的碳酸钠溶液，再向其中加入0.25 mL的福林酚，混匀，避光反应30 min，于760 nm处测定吸光值，总酚含量以每克马铃薯中所含的没食子酸当量表示，单位为mg/g。
1.3.5 抗氧化活性的测定
样品粗提液制备见1.3.4方法。DPPH·清除率的测定参照Wang等[13]的方法，ABTS+·清除率的测定参照Zhao等[14]的方法，略作改动。具体方法：1 mL样品溶液加入3 mL DPPH溶液，以蒸馏水代替样品溶液为对照组，于517 nm下测定吸光值。1 mL样品溶液加入4 mL ABTS工作液，以样品溶剂代替样品溶液为对照组，于734 nm下测定吸光值，上述反应均避光30 min。
1.3.6 抑菌活性的测定
菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法进行测定，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度测定参照倍比稀释法[15]进行测定。
1.4 数据分析
全部数据均重复测量3次，采用统计学软件SPSS Statistics 25进行统计学分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义，采用Origin2019进行绘图。
2 结果与分析
2.1 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯保鲜效果的影响
不同抗氧化剂对鲜切马铃薯片保鲜效果见图1。
图1 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯的保鲜效果
Fig.1 Effect of different antioxidants on the preservation of fresh-cut potato
鲜切果蔬的色泽是反映鲜切果蔬褐变程度的关键指标。在Zhou等[16]的研究中也发现，色泽可以直观的反映出一种食品的质量与特性。在对鲜切马铃薯片储藏期的观察记录中可以看出，随着储藏时间的延长，各试验组与对照组相比，对鲜切马铃薯均有一定的保鲜作用。其中，对照组随着时间的延长，颜色加深，褐变加重，而天然复合抗氧化剂试验组的色泽和亮度均好于单独处理和对照组。从色泽可以直观看出，不同处理组对其保鲜效果的程度，由强到弱依次为天然复合抗氧化剂＞山楂叶提取物＞香椿叶提取物＞海藻酸钠＞葡萄籽提取物＞对照组。
2.2 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯抗氧化活性的影响
2.2.1 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯总酚含量的影响
酚类化合物作为鲜切果蔬重要的抗氧化物质之一，是酶促褐变的主要底物，其含量越高，褐变越严重[17]。不同抗氧化剂对鲜切马铃薯总酚含量的影响见图2。
图2 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯总酚含量的影响
Fig.2 Effect of different antioxidants on total phenols content of fresh-cut potato
不同小写字母表示各试验组与对照组之间的差异显著，P＜0.05。
由图2可知，在整个储藏期间总酚含量整体上呈现先上升后下降的趋势，且试验组与对照组之间差异显著（P＜0.05）。在第4天时，总酚含量达到峰值，后期又逐渐降低，造成此现象的原因可能是由于苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）作为植物体内一种重要的防御酶，在马铃薯切片过程中受到机械性损伤时，其防御系统开启，使得PAL酶活力增加，从而诱导苯丙类化合物向酚类化合物的转化，引起总酚含量的积累[18]。后期由于PPO和POD两种酶不断氧化酚类物质，使得试验组马铃薯合成酚类物质的速率小于PPO和POD氧化酚类物质的速率，导致其总酚含量降低[19]。此外，也可能有一部分酚类物质被用于保持鲜切马铃薯的抗氧化活性。储藏期间，试验组总酚含量始终低于对照组，且天然复合抗氧化剂处理组能够更好地抑制总酚含量的增加，其中，试验组保持了较低的总酚含量，这与Liu等[20]的研究结果一致，可能是试验组中外源性酚类化合物抑制了马铃薯中内源性酚类化合物的生成。
2.2.2 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯DPPH·清除率的影响
抗氧化能力的强弱是衡量果蔬货架期以及生理状态的重要指标之一，也是评价果蔬非酶抗氧化活性的常用方法[21]。不同抗氧化剂对鲜切马铃薯DPPH·清除率的影响见图3。
图3 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯DPPH·清除率的影响
Fig.3 Effects of different antioxidants on DPPH·clearance rate of fresh-cut potato
不同小写字母表示试验组与对照组之间的差异显著，P＜0.05。
从图3分析看出，在整个储藏期间，各试验组对DPPH·的清除率整体上呈现先升高后下降的趋势，且与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05）。在第4天时，达到峰值，后期逐渐下降。此结果与Qiao等[22]的研究一致，其原因可能与不同处理组在储藏期内总酚含量的合成与积累有关。由于储藏前期有大量的酚类物质被积累，使得DPPH·清除率增强，后期随着储藏时间的延长，酚类物质被PPO和POD两种酶不断氧化，使其含量减少，导致对DPPH·清除率逐渐降低。对照组中，积累的酚类物质大多转化为醌类物质，加剧了黑色素的生成，使得马铃薯褐变加重，抗氧化活性降低。在本研究中，各试验组均能够保持较高的DPPH·清除率，且天然复合抗氧化剂处理能够更好的保持鲜切马铃薯的抗氧化活性。
2.2.3 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯ABTS+·清除率的影响
不同抗氧化剂对鲜切鲜切马铃薯ABTS+·清除率的影响见图4。
图4 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯ABTS+·清除率的影响
Fig.4 Effects of different antioxidants on ABTS+·clearance rate of fresh-cut potato
不同小写字母表示试验组与对照组之间的差异显著，P＜0.05。
由图4可知，相同储藏时间，各试验组与对照组之间呈现出显著性差异（P＜0.05），且均能够有效地延缓ABTS+·清除率的降低。其中，天然复合抗氧化剂试验组对其清除率的延缓效果更佳，能够较好地保持鲜切马铃薯的品质。但本研究中，在4 d之前，DPPH·与ABTS+·清除率呈现相反趋势，这与Sun等[23]的研究结果相似。此外，Siddiq等[24]研究也发现相似的现象，可能是因为在温度、pH值、提取方法以及反应的时间等诸多因素的影响下，ABTS+·发生了一定程度的降解，使得ABTS+·清除率呈现下降趋势。
2.3 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯抑菌活性的影响
2.3.1 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯菌落总数的影响
果蔬在鲜切过程中会导致组织损伤，使得微生物大量繁殖，导致鲜切果蔬品质下降。因此，菌落总数是衡量果蔬微生物污染程度的重要指标[25]。不同抗氧化剂对鲜切马铃薯菌落总数的影响见图5。
图5 不同抗氧化剂对鲜切马铃薯菌落总数的影响
Fig.5 Effects of different antioxidants on the total bacterial count of fresh-cut potato
不同小写字母表示试验组与对照组之间的差异显著，P＜0.05。
从图5可以看出，在储藏期间，各处理组菌落总数均低于对照组，从第2天起，对照组与试验组之间差异显著（P＜0.05），且天然复合抗氧化剂能够更好地抑制菌落总数的增加。这与Wong等[26]的研究结果一致，可能是由于提取物中多酚、原花青素等活性化合物具有一定的抑菌效果。李晓雁等[27]研究发现，海藻酸钠具有一定的成膜性，与其它多糖类物质联合使用时，可提高膜的强度。天然复合抗氧化剂试验组具有抑菌活性成分和海藻酸钠成膜性的双重作用，限制了微生物生长所需的条件，能够更加有效地抑制鲜切马铃薯表面微生物的生长。
2.3.2 最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）的确定
不同抗氧化剂对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度测定见表1～表3。
表1 不同抗氧化剂对沙门氏菌的最小抑菌浓度测定
Table 1 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Salmonella
注：++表示菌落数≥5，+++表示菌落数＞10，++++表示菌落数＞15，-表示无菌生长。
沙门氏菌不同抗氧化剂溶液浓度/（mg/mL）0.01 0.02 0.031 25 0.062 5 0.125 0.25 0.5 1 1.25 2.5 5 10香椿叶提取物 +++ ++ - - - - - - - - - -山楂叶提取物 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ - -葡萄籽提取物 +++ +++ - - - - - - - - - -天然复合抗氧化剂 ++ - - - - - - - - - - -
表2 不同抗氧化剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度测定
Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Escherichia coli
注：++表示菌落数≥5，+++表示菌落数＞10，++++表示菌落数＞15，-表示无菌生长。
大肠杆菌不同抗氧化剂溶液浓度/（mg/mL）0.003 13 0.006 3 0.012 5 0.025 0.05 0.1 0.5 1香椿叶提取物 ++++ +++ - - - - - -山楂叶提取物 ++++ +++ - - - - - -葡萄籽提取物 ++++ +++ - - - - - -天然复合抗氧化剂 +++ ++ - - - - - -
表3 不同抗氧化剂对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度测定
Table 3 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Staphylococcus aureus
注：＋＋＋表示菌落数＞10，＋＋＋＋表示菌落数＞15，－表示无菌生长。
不同抗氧化剂溶液浓度/（mg/mL）0.003 13 0.006 3 0.012 5 0.025 0.05 0.1 0.5 1香椿叶提取物 ++++ +++ － － － － － －山楂叶提取物 ++++ +++ － － － － － －葡萄籽提取物 ++++ +++ － － － － － －天然复合抗氧化剂 +++ － － － － － － －金黄色葡萄球菌
由表1和表2可知，香椿叶、山楂叶、葡萄籽提取物以及天然复合抗氧化剂处理对沙门氏菌和大肠杆菌两种革兰氏阴性菌均有一定程度的抑制作用。其中，香椿叶、山楂叶、葡萄籽提取物以及天然复合抗氧化剂处理对沙门氏菌最小抑菌浓度分别为0.031 25、5、0.031 25、0.02 mg/mL；对大肠杆菌的最小抑菌浓度均为0.012 5 mg/mL；整体来说不同抗氧化剂对大肠杆菌的抑制作用较明显。对于沙门氏菌，山楂叶提取物抑菌效果较差，天然复合抗氧化剂处理好于香椿叶和葡萄籽提取物。
从表3可知，不同抗氧化剂对金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中，香椿叶、山楂叶、葡萄籽提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度相同，均为0.012 5 mg/mL。天然复合抗氧化剂处理对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度浓度为0.006 3 mg/mL，抑制效果更佳。且与沙门氏菌相比，各试验组对于金黄色葡萄球菌的抑制效果更好。
2.3.3 生长曲线的测定
2.3.3.1 大肠杆菌生长曲线的测定
选取浓度为2MIC的各试验组，研究其对大肠杆生长的影响。不同抗氧化剂对大肠杆菌生长曲线的影响见图6。
图6 不同抗氧化剂对大肠杆菌生长曲线的影响
Fig.6 Effects of different antioxidants on the growth curve of Escherichia coli
由图6可知，与对照组相比，各试验组均对大肠杆菌的生长有一定的抑制作用。在0～12 h，大肠杆菌生长速率呈现上升趋势，进入对数期，12 h以后进入稳定期。可以看出，加入香椿叶、葡萄籽、山楂叶提取物以及天然复合抗氧化剂的试验组均抑制了大肠杆菌的生长速率，且加入天然复合抗氧化剂对大肠杆菌有更好的抑制作用。此现象与任国媛等[28]的研究结果相似，说明样品中的有些物质抑制了大肠杆菌的正常生长和繁殖，使得菌体数量下降，从而达到一定的抑菌效果。
2.3.3.2 沙门氏菌生长曲线的测定
选取浓度为2MIC的各试验组，研究其对沙门氏菌生长的影响。不同抗氧化剂对沙门氏菌生长曲线的影响见图7。
图7 不同抗氧化剂对沙门氏菌生长曲线的影响
Fig.7 Effects of different antioxidants on the growth curve of Salmonella
由图7可知，各试验组对沙门氏菌均有一定程度的抑制作用，在0～12 h，沙门氏菌生长进入对数期，12 h之后，进入稳定期。当加入各种抗氧化剂时，沙门氏菌的生长受到一定程度的抑制，不同的试验组均延缓了沙门氏菌的生长速率。其中，天然复合抗氧化剂相比于单一抗氧化剂对沙门氏菌有更好的抑制效果。此现象与周倩倩等[29]用异硫氰酸酯类香料处理沙门氏菌的抑菌结果相似。
2.3.3.3 金黄色葡萄球菌生长曲线的测定
选取浓度为2MIC的各试验组，研究其对金黄色葡萄球菌生长的影响。不同抗氧化剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图8。
图8 不同抗氧化剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
Fig.8 Effects of different antioxidants on the growth curve of Staphylococcus aureus
从图8中可以看出，加入香椿叶、葡萄籽、山楂叶提取物及天然复合抗氧化剂均使得金黄色葡萄球菌的生长得到抑制，其抑菌效果由强到弱依次为天然复合抗氧化剂＞山楂叶提取物＞葡萄籽提取物＞香椿叶提取物＞对照组。整体来说，天然复合抗氧化剂抑菌效果好于单一抗氧化剂。此抑菌结果与王岩等[30]研究结果相似，说明不同试验组中有抑菌活性物质，抑制了金黄色葡萄球菌菌体生长。
3 结论
本研究中，在储藏期内，试验组鲜切马铃薯片的总酚含量、菌落总数均低于对照组，且有显著差异（P＜0.05），并且各试验组均能够对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制，其中，天然复合抗氧化剂的效果更佳。说明天然复合抗氧化剂能够抑制引起马铃薯褐变的底物，控制微生物数量的增加，从而较好地保持鲜切马铃薯的色泽和营养物质。随着储藏时间的延长，不同试验组的DPPH·和ABTS+·清除率也均高于对照组。其中，天然复合抗氧化剂能够更好地保持鲜切果蔬的抗氧化活性。综上所述，天然复合抗氧化剂能够抑制马铃薯褐变的相关底物，减少组织内有害物质的产生，能够较好地保持鲜切马铃薯片的营养和品质。
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