甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）为菊科（Compositae）斯台比亚属（Stevia）多年生草本植物，因叶片中含有低热值和高甜度的甜菊糖苷（steviol glycosides，SGs）而得到人们的高度关注[1]。SGs是一类二萜糖苷类化合物的总称，甜度约为蔗糖甜度的300倍，因而作为一种天然来源的“甜味剂”被广泛应用于食品和饮料工业[2]。SGs还可治疗糖尿病、牙科疾病、肥胖病、高血压和癌症等疾病[3-4]。甜叶菊中含有30多种浓度各异的SGs，其中甜菊苷（stevioside，St）和瑞鲍迪苷A（rebaudiosideA，RA）含量最丰富[5]。研究表明，酚类是甜叶菊中另一类含量丰富的活性物质，甜叶菊中酚类主要有酚酸和类黄酮两类，而酚酸主要包括绿原酸类化合物[6]。国内对甜叶菊酚类的研究多集中在叶片绿原酸类化合物含量的测定方面[7-9]，而有关类黄酮成分分析及含量测定研究较少。
甜叶菊属于短日照植物，在长日照下只有长茎叶进行营养生长。当日照逐渐缩短，其才能现蕾开花进入生殖生长阶段[10]。以St含量高的甜叶菊品种为材料的研究表明SGs含量在现蕾初期达到最高，开花后SGs含量明显下降[11]，因此甜叶菊产地多以田间群体10%～20%的植株现蕾作为最适采收期[12]，因而产业界至今未挖掘甜叶菊花的经济价值。上世纪末，甜叶菊栽培品种随着市场需求经历了从高St向高RA含量及高RA/St比的品种更替，罗庆云等[11]的研究结果表明高RA甜叶菊品种叶的采收可在现蕾至种子成熟时段进行。作为植物精华的鲜花除具有观赏价值外，还含有丰富的类黄酮、酚酸、氨基酸、微量元素和维生素等活性成分，具有食用和药用价值[13]。本文以甜叶菊的花和叶为研究对象，鉴定其酚类成分并测定含量，为建立甜叶菊多指标质量评价体系和扩大甜叶菊开发应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甜叶菊花（去苞片）、叶片：江苏宝莲生物科技有限公司甜叶菊种植基地，55℃过夜烘干后研磨成细粉，过50目筛，备用。
1.2 试剂与仪器
新绿原酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品：成都曼思特生物科技有限公司；槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品：上海源叶生物科技有限公司；木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷对照品：索莱宝生物科技有限公司；绿原酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芦丁对照品：成都瑞芬思生物科技有限公司；槲皮素-3-O-木糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-阿拉伯糖苷对照品：四川省维克奇生物科技有限公司。以上对照品均为色谱纯（质量分数均大于98%）。甲酸（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：瑞典OCEANPAK公司；甲醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；固相萃取试剂盒（2 mL）：安捷伦科技有限公司。
高效液相色谱（1260）-串联四极杆质谱分析仪（6460Triple Quad LC/MS）、高效液相色谱仪（1200）：安捷伦科技有限公司；电子天平（AL204）：梅特勒-托利多公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9141A）：德国美墨尔特公司；冰冻离心机（5804R）：德国艾本德公司。
1.3 试验方法
1.3.1 供试品溶液
分别称取甜叶菊的花粉末5.00 g和叶粉末1.00 g，各加入30 mL甲醇，超声辅助浸提30 min，6 000 r/min离心10 min，取上清，沉淀加入30 mL甲醇超声辅助重复浸提2次，每次30 min，合并3次浸提的上清液并定容至100 mL，得甲醇浸提液。取1 mL浸提液置于固相萃取试剂盒中旋涡振荡3 min，9 000 r/min离心8 min，取上清用10%乙腈稀释至合适的浓度，过0.22 μm微孔滤膜，得供试品溶液。
1.3.2 高效液相色谱-质谱鉴定酚类化合物
1）液相色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水（B），梯度洗脱程序（0～5 min，5%～10%A；5 min～40 min：10%～34%A；40 min～45 min，34%～95%A；45 min～47min，95%A；47 min～48 min，95%～5%A；48 min～60 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2）质谱条件：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），正/负离子扫描检测模式；扫描范围 m/z：50～1 000；毛细管电压：4 kV（正）、3.5 kV（负）；干燥气体温度：300℃，干燥气体流速：10 L/min；鞘气温度：132℃，鞘气流速：7 L/min；雾化器压力：103 kPa。
1.3.3 高效液相色谱法检测酚类含量
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱：SepaxGP-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序（0～5 min，5%～10%B；5 min～40 min：10%～34%B；40min～44min，34%～95%B；44min～48 min，95%～5%B）；流速：0.9 mL/min；检测波长：330 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
1.3.3.2 线性关系
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、异绿原酸B、异绿原酸A、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、异绿原酸C、山奈酚-3-O-鼠李糖苷15个对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇超声辅助溶解定容后得混合对照品溶液，用10%乙腈溶液按比例稀释成相应的浓度梯度进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。
1.3.3.3 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验
取“1.3.3.2”项下制备混合对照品溶液重复进样5次，以峰面积计算15种酚类的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值评估仪器精密度。取甜叶菊样品按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，平行5份，按“1.3.3.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积计算15种酚类的RSD值评估该方法重复性。取甜叶菊供试品溶液，分别于 0、4、8、12、24 h 进行测定，以峰面积计算 15种酚类的RSD值评估供试品溶液稳定性。精密称取已知含量的同一批样品适量，共9份，每3份为一组，分别精确加入低、中、高浓度的对照品溶液适量，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，再按“1.3.3.1”项下色谱条件进行测定并计算加样回收率。
1.3.3.4 甜叶菊花和叶中酚类含量测定
以2019年种植的甜叶菊一新品种盛花期（生长160 d）10个植株混合叶和混合花为材料，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，并按“1.3.3.1”项下色谱条件进行测定，采用外标法计算酚类含量（平行测定3份，取平均值）。因无木犀草素-7-O-芸香糖苷的对照品，其含量的计算以木犀草素-7-O-葡萄糖苷的峰面积及浓度为基准，计算公式如下。
含量/（mg/g）=（C/W）×（A2/A1）×1.33
式中：C为木犀草素-7-O-葡萄糖苷对照品的浓度，mg/mL；A1为木犀草素-7-O-葡萄糖苷对照品峰面积；W为样品的干质量，g；A2为样品中木犀草素-7-O-芸香糖苷峰面积；1.33为木犀草素-7-O-芸香糖苷与木犀草素-7-O-葡萄糖苷分子质量之比。
1.4 数据处理
试验数据使用Microsoft excel软件和SPSS16.0统计分析软件进行整理与分析。
2 结果与讨论
2.1 甜叶菊中酚类物质的鉴定
试验采用正/负离子模式对甜叶菊的叶和花中提取成分进行扫描，图1是样品在正/负模式下的质谱总离子流图（total ion chromatogram，TIC）。
图1 甜叶菊供试品总离子流图
Fig.1 TIC of sample of Stevia rebaudiana Bertoni
峰1～16为供试品中检测出的酚类化合物。
峰1、2和3的分子离子峰[M-H]-均为m/z 353，初步判断为单咖啡酰奎宁酸。3个峰的特征离子m/z191和m/z179分别为失去咖啡酸部分和奎宁酸部分的碎片离子，m/z 173为奎宁酸进一步失去H2O的碎片离子；咖啡酸可以和奎宁酸的1、3、4和5位上的羟基（-OH）脱水缩合，形成4种单咖啡酰奎宁酸。峰4、10、11和15的分子离子峰 [M-H]-均为m/z 515，特征离子m/z 353为失去咖啡酸及进一步失去H2O的碎片离子，初步判断这4个峰均为二咖啡酰奎宁酸；两分子咖啡酸与奎宁酸脱水缩合，理论上与奎宁酸羟基（-OH）结合位置可能有 1，3-、1，4-、1，5-、3，4-、3，5-和 4，5-六种[14]。通过参阅参考文献[1-2,6]及对照品确定峰1、2、3、10、11、15分别为新绿原酸（3-咖啡酰奎宁酸）、绿原酸（5-咖啡酰奎宁酸）、隐绿原酸（4-咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸 B（3，4-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸 A（3，5-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸C（4，5-二咖啡酰奎宁酸）。另外，根据张维冰等[14]的文献、峰的保留时间及对照品确定峰4为1，3-二咖啡酰奎宁酸。在以往的研究中尚未见甜叶菊中含有1，3-二咖啡酰奎宁酸的报道[1,2,6-9]。
峰5、6、9和12均含有特征离子m/z 303，推测是槲皮素糖苷化合物。峰5的分子离子峰 [M-H]-为m/z 609，特征离子m/z 611和m/z303分别为[M+H]+和失去了芸香糖（葡萄糖+鼠李糖）的碎片离子；峰6分子离子峰[M-H]-为m/z 463，特征离子m/z 465和m/z303分别为[M+H]+和失去了半乳糖或葡萄糖的碎片离子；峰9分子离子峰[M-H]-为m/z 433，特征离子m/z 303为[M+H]+失去了木糖的碎片离子；峰12分子离子峰[M-H]-为m/z 447，特征离子m/z 449和m/z303为[M+H]+和失去了鼠李糖的碎片离子。Barroso等[6]通过高效液相色谱串联质谱技术鉴定到了葡萄牙产甜叶菊中槲皮素糖苷化合物包括芦丁、槲皮素-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷。
峰7、8、14和16的均含有特征离子m/z 287，推测可能是木犀草素或山奈酚糖苷化合物。由于木犀草素的极性大于山奈酚的极性，所以在反相液相色谱分离中，一般木犀草素糖苷化合物的保留时间小于山奈酚糖苷化合物的保留时间，因此可以初步判断峰7和8为木犀草素糖苷化合物。峰7的分子离子峰[M-H]-为m/z 447，特征离子m/z 287为[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片离子。峰8的分子离子峰[M-H]-为m/z 593，特征离子m/z 595和m/z287分别为[M+H]+和失去了双糖的碎片离子。Ciulu等[2]在甜叶菊的酚类鉴定研究中推测[M-H]-为m/z 593的分子离子峰可能是木犀草素-7-O-芸香糖苷或山奈酚-3-O-芸香糖苷，本研究以分子量同为594的木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品进行HPLC分析，山奈酚-3-O-芸香糖苷峰的出峰时间比峰8的出峰时间滞后2.175 min，而木犀草素-7-O-新橙皮糖苷比峰8的出峰时间提前0.971 min，因此判断峰8应为木犀草素-7-O-芸香糖苷。峰14和16的分子离子峰[M-H]-分别为m/z 417和m/z 431，特征离子m/z 287为[M+H]+失去了阿拉伯糖和[M+H]+失去了鼠李糖的碎片离子。峰13的分子离子峰[M-H]-为m/z 431，特征离子m/z 271为[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片离子。
本研究通过对照品确定峰 5、6、7、8、9、12、13、14、16分别为芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷。
2.2 色谱条件的选择
鉴于植物提取物成分多而复杂，为了有效进行组分分离，必须对分离条件进行优化，不同的分离参数包括色谱柱、流动相组成和检测波长等需通过试验确定。本试验比较了Agilent Eclipse XDB、Dubhe、Sepax GP、Welch Ultimate XB、Thermo scientific ODS Hypersil、DikMa Diamonsil等C18色谱柱的分离效果，结果表明采用Sepax GP-C18色谱柱，分离效果最好。从正/负离子模式下甜叶菊样品的总离子流图中提取200 nm～440 nm波长范围内的色谱图进行比较，如图2所示。
图2 对照品和甜叶菊供试品高效液相色谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances and Stevia rebaudiana Bertoni samples
1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.1，3-二咖啡酰奎宁酸；5.芦丁；6.槲皮素-7-O-葡萄糖苷；7.木犀草素-7-O-葡萄糖苷；8.木犀草素-7-O-芸香糖苷；9.槲皮素-3-O-木糖苷；10.异绿原酸 B；11.异绿原酸 A；12.槲皮素-3-O-鼠李糖苷；13.芹菜素-7-O-葡萄糖苷；14.山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷；15.异绿原酸C；16.山奈酚-3-O-鼠李糖苷。
由图2可知，大多数峰在330nm处有最大吸收。对高效液相流动相的组成进行考察，结果表明使用乙腈-水溶液作为流动相组成比甲醇-水溶液流动相组成的分离效果好，在流动相中加入少量的甲酸，色谱峰更尖锐，并能有效减少色谱峰拖尾现象的产生。以乙腈-0.5%甲酸作为流动相，调整流动相比例，在40 min内可以实现多种成分的有效分离。
2.3 线性关系考察
将15种酚类对照品混合溶液配制成相应的浓度梯度后，进样分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制系列标准曲线，15种酚类的相关系数R2为0.999 0～1，线性良好，结果见表1。
表1 15种酚类化合物的回归方程、相关系数和线性范围
Table 1 Regression equation，correlation coefficien and linear range of fifteen phenolic compounds
序号中文名称英文名称回归方程相关系数R2线性范围/（μg/mL）1新绿原酸 neochlorogenic acid y=99.026x-2.602 5 1 0.22～56.00 2绿原酸 chlorogenic acid y=88.903x+28.839 0.999 8 0.50～128.00 3隐绿原酸 cryptochlorogenic acid y=66.784x+1.546 0.999 9 0.25～16.00 4 1,3-二咖啡酰奎宁酸 1,3-dicaffeoylquinic acid y=88.252x+5.608 0.999 6 0.28～18.00 5芦丁 rutin y=28.742x+7.291 4 0.999 4 0.34～22.00 6 槲皮素-7-O-葡萄糖苷 quercetin-7-O-glucoside y=32.616x+8.171 8 0.999 0 0.28～18.00 7 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 luteolin-7-O-glucoside y=65.065x+28.511 0.999 3 0.37～24.00 8 槲皮素-3-O-木糖苷 quercetin-3-O-xyloside y=49.04x+10.582 0.999 6 0.25～16.00 9异绿原酸B isochlorogenic acid B y=79.678x+10.822 0.999 8 0.50～32.00 10 异绿原酸A isochlorogenic acid A y=101.16x+21.561 0.999 9 1.50～96.00 11 槲皮素-3-O-鼠李糖苷 quercetin-3-O-rhamnoside y=44.904x+18.61 0.999 5 0.50～32.00 12 芹菜素-7-O-葡萄糖苷 apigenin-7-O-glucoside y=80.553x+25.106 0.999 3 0.28～18.00 13 山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷 kaempferol-3-O-arabinoside y=51.982x+15.069 0.999 2 0.25～16.00 14 异绿原酸C isochlorogenic acid C y=101.36x+40.797 0.999 8 1.37～88.00 15 山奈酚-3-O-鼠李糖苷 kaempferol-3-O-rhamnoside y=50.103x+13.541 0.999 1 0.28～18.00
2.4 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验
精密度试验中15种酚类的RSD值在0.17%～1.56%之间，表明该仪器精密度良好；重复性试验中15种酚类的RSD值在0.80%～1.35%之间，表明该方法重复性良好；稳定性试验中该15种酚类的RSD值在0.76%～2.31%之间，表明供试品溶液在24 h内保持稳定；加样回收率试验中15种酚类的平均回收率在85.60%～98.80%之间。
2.5 甜叶菊花和叶中酚类化合物含量测定
甜叶菊花和叶中酚类化合物含量的检测结果见表2。
表2 甜叶菊花和叶中酚类化合物含量的检测结果
Table 2 Detection results of phenolic compounds contained in flower and leaf of Stevia rebaudiana Bertoni
酚类中文名称英文名称含量/（mg/g）花叶酚酸 新绿原酸 neochlorogenic acid 0.29±0.01 1.09±0.15绿原酸 chlorogenic acid 2.59±0.03 16.51±1.44隐绿原酸 cryptochlorogenic acid 0.10±0.01 0.60±0.08 1,3-二咖啡酰奎宁酸 1,3-dicaffeoylquinic acid 0.05±0.00 0.01±0.00异绿原酸 B isochlorogenic acid B 0.90±0.03 1.87±0.01异绿原酸 A isochlorogenic acid A 9.76±0.10 41.88±2.77异绿原酸 C isochlorogenic acid C 0.92±0.04 9.46±0.91类黄酮 芦丁 rutin 0.34±0.02 2.68±0.14槲皮素-7-O-葡萄糖苷 quercetin-7-O-glucoside 0.37±0.02 0.99±0.11木犀草素-7-O-葡萄糖苷 luteolin-7-O-glucoside 0.20±0.01 2.03±0.10木犀草素-7-O-芸香糖苷 luteolin-7-O-rutinoside 1.21±0.05 1.40±0.07槲皮素-3-O-木糖苷 quercetin-3-O-xyloside 0.23±0.01 0.45±0.03槲皮素-3-O-鼠李糖苷 quercetin-3-O-rhamnoside 2.44±0.06 8.19±0.21芹菜素-7-O-葡萄糖苷 apigenin-7-O-glucoside 0.18±0.03 1.86±0.01山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷 kaempferol-3-O-arabinoside 0.89±0.04 0.62±0.04山奈酚-3-O-鼠李糖苷 kaempferol-3-O-rhamnoside 1.84±0.03 1.47±0.09酚酸总量 total content of phenolic acids 14.61±0.25 71.42±2.01类黄酮总量 total content of flavonoids 7.70±0.26 19.69±0.31酚类总量 total content of phenolic ompounds 22.31±0.51 91.11±2.32
由表2可以看出，甜叶菊叶片中含量最高的酚酸化合物为异绿原酸A，其次是绿原酸，而异绿原酸B、新绿原酸、隐绿原酸含量较少，1，3-二咖啡酰奎宁酸含量最低；花中同样是异绿原酸A含量最高，绿原酸的含量次之，而异绿原酸C和异绿原酸B的含量相当，隐绿原酸和1，3-二咖啡酰奎宁酸含量较少。花和叶中酚酸总量分别达到（14.61±0.25）mg/g和（71.42±2.01）mg/g。
甜叶菊花和叶的类黄酮主要以类黄酮苷的形式存在，为槲皮素、木犀草素、山奈酚以及芹菜素的糖苷衍生物。在叶片中，除了山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷和山奈酚-3-O-鼠李糖苷的含量少于花中的含量，其他7种黄酮苷的含量均高于花中的含量，花和叶均以槲皮素-3-鼠李糖苷的含量最高。花和叶中类黄酮总量分别达（7.70±0.26）mg/g和（19.69±0.31）mg/g。
自Karaköse等[15]采用液相色谱串联质谱在甜叶菊叶发现了24种酚类化合物后，Barroso等[6]采用HPLC法测定葡萄牙产甜叶菊叶片中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量分别为 0.55%、5.10%、0.29%、0.55%、4.92%、1.08%，绿原酸类总量达12.49%；郭志龙等[9]采用HPLC检测国内14个甜叶菊品种叶片中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的最高含量分别为 0.46%、3.29%、0.31%、0.32%、5.43%、1.95%，绿原酸类成分总量最高的品种可达9.78%。上述研究均显示甜叶菊中酚酸化合物主要包括6种绿原酸类，其中主要成分均为绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C，绿原酸类成分是甜叶菊中一类含量较高的次生代谢产物，这一结论在本研究的甜叶菊品种中也成立（表2）。关于甜叶菊类黄酮化合物，Barroso等[6]通过HPLC-质谱鉴定出了芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，推测了1种槲皮素糖苷化合物及4种山奈酚糖苷化合物，并指出类黄酮化合物中以槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量最高（9.29 mg/g），这一结果在本研究中得以验证；本研究除了同样鉴定出了芦丁、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷外，还鉴定出了2种山奈酚、2种木犀草素和1种芹菜素的糖苷化合物，但没有鉴定出槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，这或许是甜叶菊品种的差异所导致的。
3 结论
本研究通过高效液相色谱串联质谱鉴定了甜叶菊花和叶中的16种酚类物质，包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等7种酚酸化合物和芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷等9种类黄酮化合物。
本研究建立了HPLC同时测定甜叶菊花和叶中16种酚类含量的方法，运用该方法测定了花和叶中的酚类化合物的含量。花和叶中酚酸化合物均以异绿原酸A的含量最高，1，3-二咖啡酰奎宁酸含量最少。花和叶中类黄酮化合物均以槲皮素-3-O-鼠李糖苷的含量最高，花中以芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量最少，而叶中以槲皮素-3-O-木糖苷含量最少。花和叶中含有丰富的酚类化合物，甜叶菊的叶可以作为提取酚类成分的原料，而甜叶菊的花可以开发成为新型保健食品。
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