沙棘、胡萝卜和黑枣广泛种植于我国北方地区，三者的果实中富含多种碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸和多种微量元素，并含有大量的黄酮和多酚等生物活性物质[1-4]。综合三者的成分对人体十分有益，具有抗氧化、抗突变、保护胃肠道、保护肝脏、增强免疫力等作用[2-4]。这三者通常都被生食或榨汁，但由于其酸味和涩味明显而不被人们所接受，亟需加大三者的综合加工，提高产品的附加值。研究三者的加工工艺对于果蔬加工产业的可持续发展具有重要意义。
益生菌具有抗氧化、抗菌、抗炎及一些其它益生特性，可为宿主带来多种益处[5]。通过发酵技术将这一至关重要的益生功能传递给宿主是一个非常有前景的应用。使用益生菌发酵技术研发具有保健功能的发酵果蔬汁，不仅可以增加果蔬制品的种类，还有助于提高果蔬制品的保健功效[6]。含酵母自溶物的果蔬经乳酸菌发酵后，发酵产品中矿物质、β-胡萝卜素、甜菜苷、维生素和一些其它营养物质的含量显著高于未发酵的果蔬[7]。此外，乳酸菌发酵橙汁可增加类胡萝卜素和黄酮的含量[8]。
目前，对于益生菌发酵果蔬的研究报道较多，但以沙棘、胡萝卜和黑枣为原料发酵复合果蔬汁的研究鲜有报道，且不同益生菌发酵剂及其组合对该复合果蔬汁的影响也未知。本研究以沙棘、胡萝卜和黑枣为主要原料，基于现代发酵技术，接种不同益生菌发酵剂进行发酵，探究发酵过程中体外抗氧化能力、益生菌菌落总数、主要理化指标（pH值、总酸、可溶性蛋白、还原糖）、有机酸和活性成分（总黄酮和总多酚）含量的变化规律，同时利用相关性分析对各品质指标进行分析，为复合果蔬汁的综合开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘原浆：吕梁野山坡食品有限责任公司；胡萝卜汁、黑枣汁：福建绿泉食品有限公司。
乳酸细菌培养基、羟自由基清除能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、乙酸锌、亚铁氰化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、富马酸、丙酮酸标准品（色谱纯）：国家食品药品检测中心；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ZHJH-C1109C型无菌操作台：上海智城分析仪器制造有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机：长沙平凡仪器厂；AB-50型电子分析天平、FE28型pH计：瑞士Mettler-Toledo公司；UV1800型紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；Agilent 1260型液相色谱仪：美国Agilent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌悬液制备
试验所用益生菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LR）均来自食品与药品工程微生物实验室。将乳酸菌接入乳酸细菌液体培养基进行活化，37℃培养24 h，4 500 r/min离心15 min，用无菌生理盐水清洗沉淀，将其溶于生理盐水中，配制成活菌数为2.1×107CFU/mL左右的菌悬液。
1.3.2 复合果蔬汁发酵工艺
将沙棘原浆、胡萝卜汁和黑枣汁按一定比例混合，115℃灭菌20 min，冷却至室温（25℃）后装入3L已灭菌玻璃瓶中，分别接种植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和它们的组合[1∶1（体积比），LP+LR]，接种量为2%菌悬液，混匀后37℃静置发酵36 h，每隔6 h进行取样，并立即置于-20℃保存。
1.3.3 益生菌菌落总数的测定
参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》测定益生菌菌落总数[9]。
1.3.4 发酵过程中pH值、总酸、可溶性蛋白和还原糖的测定
使用pH计直接测定pH值；参照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》测定总滴定酸的含量（以乳酸计）[10]；采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白的含量[11]；参照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》测定还原糖的含量（以葡萄糖计）[12]。
1.3.5 发酵过程中有机酸的测定
用高效液相色谱法测定复合果蔬汁中有机酸的含量[13]。取适量复合果蔬汁发酵液，4 500 r/min离心10 min，将离心后的上清液稀释5倍微滤（0.45μm）过膜后待用。采用AgilentC18色谱柱，进样量为10μL，流动相为甲醇-水-磷酸溶液（A体积比80∶15∶5；B体积比为 5∶90∶5），柱温 30℃，柱流速 0.5 mL/min，检测波长210nm[13]。流动相梯度洗脱条件：0～5min，A∶B=0∶100；15min，A ∶B=10 ∶90；45min～55 min，A∶B=100 ∶0；65 min～75 min，A ∶B=0 ∶100[13]。
1.3.6 发酵过程中总黄酮和总多酚含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量[14]，总黄酮含量用芦丁当量表示；采用Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚的含量[15]，总多酚含量用没食子酸当量表示。
1.3.7 发酵过程中体外抗氧化能力的测定
DPPH自由基清除能力测定参考王储炎等[16]的方法，取适量复合果蔬汁发酵液，4 500 r/min离心10 min，将 100 μL上清液加入到 100 μL 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液，混匀后置于黑暗条件下反应30 min，于517 nm下测定吸光度，分别以80%甲醇溶液和纯水代替样品作阳性对照和空白对照。DPPH自由基清除率计算公式如下。
DPPH 自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
式中：A0、A1和A2分别为空白、样品和对照的吸光度值。
羟自由基清除能力测定参考LIU等[17]的方法，根据试剂盒的相应步骤进行测定。羟自由基清除率计算公式如下。
羟自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
式中：A0、A1和A2分别为空白、样品和对照的吸光度值。
1.4 数据分析
每组试验均重复3次，采用Origin 9.0软件绘图，方差分析（ANOVA）用于分析组间差异，SPSS 19.0软件进行ANOVA和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中乳酸菌菌落总数的变化
复合果蔬汁发酵过程中乳酸菌菌落总数的变化见图1。
图1 复合果蔬汁发酵过程中乳酸菌菌落总数的变化
Fig.1 Changes in the total numbers of colonies during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
字母、数字和罗马数字不同表示显著差异（P<0.05）；大写字母代表LP组；小写字母代表LR；数字代表LP+LR；罗马数字代表同一发酵时间。
由图1可知，复合果蔬汁发酵过程中乳酸菌菌落总数呈现先增加后趋于平缓的趋势，与吴万林等[18]得出的结论一致。其中，LP组在发酵6 h时乳酸菌菌落总数迅速增加至6.12lg（CFU/mL），远高于LR组[5.54 lg（CFU/mL）]和LP+LR组[5.92 lg（CFU/mL）]（P<0.05），说明复合果蔬汁中营养物质充足，可促进乳酸菌的生长繁殖，而植物乳杆菌比鼠李糖乳杆菌更适宜该发酵环境。发酵30 h后，LP组和LR组中乳酸菌总数达到最大，分别为 8.21 lg（CFU/mL）和 8.04 lg（CFU/mL），随后开始下降，这是因为随着发酵时间的不断延长，发酵体系中营养物质不断被消耗及大量次级代谢产物的积累不利于乳酸菌的生长[19]。
2.2 发酵过程中pH值、总酸、可溶性蛋白和还原糖的变化
复合果蔬汁发酵过程中pH值、总酸、可溶性蛋白和还原糖的变化见图2。
图2 复合果蔬汁发酵过程中pH值、总酸、可溶性蛋白和还原糖的变化
Fig.2 Changes in the pH，total acidity，soluble protein content and reducing sugar content during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
A.pH 值；B.总酸；C.可溶性蛋白；D.还原糖；图中字母、数字和罗马数字不同表示显著差异（P<0.05）；大写字母代表LP组；小写字母代表LR；数字代表LP+LR；罗马数字代表同一发酵时间。
由图2A可知，复合果蔬汁在发酵过程中pH值呈逐渐下降的趋势，与XU等[20]报道一致。其中，LP+LR组在发酵36 h时具有最低的pH值，为3.52，显著低（P<0.05）于LP组和LR组，表明植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的互利共生关系有利于营养物质的消耗，促进其生长代谢，从而加速发酵环境的酸化。如图2B所示，复合果蔬汁在发酵过程中总酸含量整体上呈先快速增加后维持稳定的趋势，这可能是由于原料中有机酸的溶出及乳酸菌在生长代谢中产生了乳酸等有机酸[2]。随着发酵的不断延续，LP+LR组中总酸含量由最初的0.27 g/L增加至发酵36 h的2.04 g/L。LP+LR组发酵过程中总酸含量始终高于LP组和LR组，这与图1的结论相吻合，产酸量与菌落总数呈正相关。由图2C可知，复合果蔬汁在发酵过程中可溶性蛋白含量的变化趋势与总酸含量的变化趋势相反，与王越等[13]报道一致，这可能是由于可溶性蛋白能与脂肪、纤维素等结合形成致密且不溶于水的大分子物质，且发酵环境的不断酸化也会导致可溶性蛋白在大量H+水解作用下分解为多肽和氨基酸[13]。其中，在发酵36 h时，LP组和LR组中可溶性蛋白含量无显著差异（P>0.05），其含量分别为0.22 g/L和0.25 g/L，而LP+LR组中可溶性蛋白含量为0.17 g/L，显著低（P<0.05）于LP组和LR组发酵的复合果蔬汁。如图2D所示，复合果蔬汁在发酵过程中还原糖含量呈先增加后下降再保持稳定的变化趋势。LP组、LR组和LP+LR组中还原糖含量分别在发酵6、12 h和6 h达到最大值，其含量分别为72.62、70.64 g/L和67.01 g/L，说明乳酸菌生长代谢过程中产生的酶可将复合果蔬汁中其它种类糖类化合物分解成还原糖，造成发酵初期还原糖含量增加。随着发酵的进行，发酵体系中还原糖含量不断下降，这是由于乳酸菌的快速生长需要消耗大量碳源。在发酵36 h时，3种工艺发酵复合果蔬汁中还原糖含量无显著差异（P>0.05）。
2.3 发酵过程中有机酸的变化
复合果蔬汁的风味主要受有机酸、糖类等成分影响，其中，有机酸是影响其风味的重要指标[21]。复合果蔬汁发酵过程中有机酸的变化见表1。
表1 复合果蔬汁发酵过程中有机酸的变化
Table 1 Changes in the content of organic acids during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
注：表中数据为平均值±标准差，ND表示没有检出；不同字母和数字表示相应有机酸在不同发酵时间的含量存在显著差异（n=3，P<0.05）；大写字母代表LP组；小写字母代表LR；数字代表LP+LR；罗马数字代表同一发酵间存在显著差异（n=3，P<0.05）。
浓度/（mg/mL）乙酸 草酸 苹果酸 柠檬酸 乳酸 琥珀酸 莽草酸 富马酸 丙酮酸LP 0 0.22±0.04FⅠ 0.14±0.03EⅠ 3.14±0.33AⅠ 0.26±0.04FⅠ NDFⅠ 0.31±0.03EⅠ 0.11±0.02BⅠ 0.01±0.01BⅠ 0.08±0.02DⅠ6 0.37±0.05EⅠ 0.32±0.04DⅠ 2.51±0.24BⅡ 1.10±0.12EⅠ 3.06±0.26EⅡ 0.36±0.03DⅠ 0.11±0.02BⅠ 0.02±0.01BⅠ 0.12±0.03CⅠ12 0.54±0.07DⅠ 0.56±0.06CⅠ 1.73±0.16CⅡ 2.54±0.22DⅠ 9.22±0.69DⅡ 0.43±0.05CⅠ 0.13±0.02ABⅠ 0.03±0.01ABⅠ 0.18±0.04BⅠ18 0.68±0.11CⅡ 0.73±0.08BⅠ 0.95±0.11DⅡ 5.07±0.42CⅠ 12.44±0.81CⅡ 0.48±0.05BCⅠ 0.12±0.03BⅠ 0.03±0.01ABⅠ 0.23±0.04AⅠ24 0.95±0.18BⅠ 0.93±0.10AⅠ 0.61±0.04EⅡ 7.04±0.51AⅡ 15.65±1.26BⅠ 0.55±0.04BⅠ 0.16±0.04AⅠ 0.05±0.02AⅠ 0.15±0.03BCⅠ30 1.14±0.20AⅠ 0.89±0.08AⅠ 0.47±0.03FⅡ 6.78±0.62ABⅡ 16.91±1.12AⅠ 0.64±0.05AⅠ 0.14±0.04AⅠ 0.04±0.02AⅠ 0.14±0.02CⅠ36 1.01±0.16ABⅡ 0.87±0.08AⅠ 0.43±0.03FⅡ 6.47±0.55BⅢ 16.18±0.99ABⅠ 0.59±0.06ABⅠ 0.14±0.03AⅠ 0.02±0.01BⅠ 0.17±0.03BⅠLR 0 0.22±0.04eⅠ 0.14±0.03dⅠ 3.14±0.33aⅠ 0.26±0.04eⅠ NDfⅠ 0.31±0.03dⅠ 0.11±0.02bⅠ 0.01±0.01bⅠ 0.08±0.02cⅠ6 0.23±0.04eⅡ 0.16±0.03dⅡ 2.89±0.27bⅠ 0.32±0.04eⅡ 0.54±0.04eⅢ 0.32±0.02dⅠ 0.11±0.02bⅠ 0.01±0.01bⅠ 0.09±0.01cⅠ12 0.39±0.06dⅡ 0.47±0.06cⅠ 2.16±0.22cⅠ 1.91±0.21dⅡ 4.62±0.51dⅢ 0.39±0.03cⅠ 0.12±0.02bⅠ 0.02±0.01abⅠ 0.15±0.02bⅠ18 0.53±0.07cⅢ 0.64±0.07bⅠ 1.63±0.19dⅠ 4.23±0.44cⅡ 8.29±0.77cⅢ 0.45±0.03bcⅠ 0.14±0.02aⅠ 0.03±0.01aⅠ 0.20±0.04aⅠ24 0.68±0.05bⅡ 0.75±0.05abⅡ 1.06±0.13eⅠ 6.56±0.59bⅢ 11.45±0.98bⅡ 0.49±0.05bⅠ 0.15±0.03aⅠ 0.03±0.01aⅠ 0.20±0.04aⅠ30 0.84±0.09aⅡ 0.84±0.08aⅠ 0.67±0.07fⅠ 7.26±0.63aⅠ 15.31±1.04aⅡ 0.58±0.05aⅠ 0.14±0.02aⅠ 0.02±0.01abⅠ 0.18±0.03abⅠ36 0.86±0.07aⅢ 0.83±0.06aⅠ 0.57±005fⅠ 7.06±0.69aⅠ 15.78±1.12aⅡ 0.60±0.07aⅠ 0.14±0.02aⅠ 0.02±0.01abⅠ 0.18±0.03abⅠLP+LR分组发酵时间/h 0 0.22±0.046Ⅰ 0.14±0.035Ⅰ 3.14±0.331Ⅰ 0.26±0.046Ⅰ ND6Ⅰ 0.31±0.034Ⅰ 0.11±0.022Ⅰ 0.01±0.013Ⅰ 0.08±0.023Ⅰ6 0.41±0.065Ⅰ 0.32±0.044Ⅰ 2.32±0.262Ⅲ 1.23±0.115Ⅰ 3.42±0.315Ⅰ 0.36±0.044Ⅰ 0.13±0.022Ⅰ 0.02±0.0123Ⅰ 0.10±0.023Ⅰ12 0.58±0.074Ⅰ 0.56±0.053Ⅰ 1.46±0.173Ⅲ 2.76±0.254Ⅰ 10.92±0.874Ⅰ 0.43±0.023Ⅰ 0.15±0.031Ⅰ 0.04±0.0212Ⅰ 0.19±0.042Ⅰ18 0.83±0.093Ⅰ 0.73±0.062Ⅰ 0.73±0.084Ⅲ 5.35±0.443Ⅰ 13.74±1.083Ⅰ 0.48±0.0623Ⅰ 0.16±0.041Ⅰ 0.06±0.021Ⅰ 0.31±0.061Ⅰ24 1.01±0.112Ⅰ 0.93±0.091Ⅰ 0.48±0.065Ⅲ 7.38±0.911Ⅰ 16.25±1.332Ⅰ 0.55±0.052Ⅰ 0.16±0.031Ⅰ 0.06±0.021Ⅰ 0.31±0.051Ⅰ30 1.19±0.141Ⅰ 0.89±0.071Ⅰ 0.40±0.0456Ⅱ 7.21±0.541Ⅰ 17.61±1.151Ⅰ 0.64±0.051Ⅰ 0.14±0.0212Ⅰ 0.04±0.0112Ⅰ 0.27±0.0312Ⅰ36 1.24±0.221Ⅰ 0.87±0.081Ⅰ 0.38±0.046Ⅱ 6.74±0.632Ⅱ 16.82±1.021Ⅰ 0.59±0.0412Ⅰ 0.13±0.022Ⅰ 0.03±0.012Ⅰ 0.22±0.032Ⅰ
由表1可知，在未发酵的复合果蔬汁中有机酸以苹果酸为主，其含量占整个有机酸的73.54%，与陆敏等[22]研究结果相一致，但接种乳酸菌发酵会使复合果蔬汁中苹果酸含量随发酵时间的延长而降低。莽草酸、富马酸和丙酮酸在3种不同工艺的复合果蔬汁发酵过程中变化均不明显，乙酸、草酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸则呈先增后降的变化趋势。复合果蔬汁发酵过程中乳酸的变化最显著，其在未发酵的复合果蔬汁中不能被检测，而在发酵36 h时的含量为15.78 mg/mL～16.82 mg/mL，其中，LP+LR组中乳酸含量最高，而LR组最低。此外，在发酵36 h时，LP+LR组中柠檬酸、乙酸和草酸的含量分别为6.74、1.24、0.87 mg/mL。3种工艺发酵复合果蔬汁中，除草酸含量无显著差异（P>0.05）外，LP+LR组中乙酸含量显著高于LP组（1.01mg/mL）和LR组（0.86mg/mL），而LR组中柠檬酸含量最高，可达7.06 mg/mL，显著高于LP+LR组和LP组（6.47 mg/mL）。综上可知，乳酸和柠檬酸是乳酸菌发酵复合果蔬汁中最主要的两种有机酸，两者之和占整个有机酸的87%左右。说明乳酸和柠檬酸是决定乳酸菌发酵复合果蔬汁口感的主要因素之一。
2.4 发酵过程中总黄酮和总多酚的变化
黄酮类化合物是一类广泛存在于果蔬中的天然有机化合物，具有抗氧化、抗炎及抗菌等多种生物活性。复合果蔬汁发酵过程中总黄酮和总多酚的变化见图3。
图3 复合果蔬汁发酵过程中总黄酮和总多酚的变化
Fig.3 Changes in total flavonoids contents and total polyphenol contents during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
A.总黄酮；B.总多酚；图中字母、数字和罗马数字不同表示显著差异（P<0.05）；大写字母代表LP组；小写字母代表LR；数字代表LP+LR；罗马数字代表同一发酵时间。
如图3A所示，复合果蔬汁在发酵过程中总黄酮含量整体上呈先增加后维持稳定的趋势，这是因为乳酸菌在生长过程中会产生各种酶，这些酶会促进纤维素、果胶等大分子物质的分解，使大量黄酮类化合物溶于发酵体系中，从而提高果蔬汁中总黄酮的含量[23]。当发酵进行30 h后，3种工艺发酵果蔬汁的总黄酮含量趋于稳定，其中LP+LR组发酵的复合果蔬汁中总黄酮含量最高，为0.45 g/L，而LP组发酵的复合果蔬汁中总黄酮含量最低，为0.35 g/L，LR组发酵的复合果蔬汁中总黄酮含量介于两者之间，为0.41 g/L，显著高于LP组（P<0.05）。结合图1的结论可知，在复合果蔬汁发酵体系中鼠李糖乳杆具有比植物乳杆菌更强的合成黄酮类化合物的能力。
复合果蔬汁的颜色、味道等感官特性也受多酚类物质含量的影响[24]。由图3B可知，复合果蔬汁在发酵过程中总多酚含量整体上呈先增加后下降的趋势，这主要是因为随着发酵过程中单体酚类化合物的生物合成，促进总多酚含量的增加，而酚类物质的氧化与生成也是同时进行的，到了发酵后期，生成的速率降低，而氧化过程仍在继续，导致酚类物质的减少[13,25]。在发酵30 h时，LP+LR组发酵的复合果蔬汁中总多酚含量达到最高，为12.22g/L，显著高于LP组（9.92g/L）和LR组（10.58 g/L）（P<0.05）。此外，乳酸菌发酵复合果蔬汁可显著提高（P<0.05）总多酚含量，比未发酵的复合果蔬汁增加了74%～113%，表明发酵技术有利于增加复合果蔬汁多酚类生物活性物质的含量。
2.5 发酵过程中体外抗氧化能力的变化
复合果蔬汁发酵过程中体外抗氧化能力的变化见图4。
图4 复合果蔬汁发酵过程中体外抗氧化能力的变化
Fig.4 Changes in antioxidant activity during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
A.总黄酮；B.总多酚；图中字母、数字和罗马数字不同表示显著差异（P<0.05）；大写字母代表LP组；小写字母代表LR；数字代表LP+LR；罗马数字代表同一发酵时间。
如图4所示，复合果蔬汁在发酵过程中DPPH自由基清除率和羟自由基清除率整体上均呈现先上升后下降的趋势。3种工艺的DPPH自由基清除率均在发酵30 h达到最大，其中，LP+LR组的DPPH自由基清除率最大，可达91.57%，而LP组的DPPH自由基清除率最低，为88.03%，LR组的DPPH自由基清除率介于两者之间，为88.98%。此外，3种工艺的羟自由基清除率最大值则出现在发酵24 h，其中，LP+LR组的羟自由基清除率最大，为71.57%，显著高（P<0.05）于LP组（66.43%）和LR组（67.98%）。这可能与乳酸菌的代谢产物及复合果蔬汁中活性物质的变化有关[26]。综上，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌耦合发酵可明显改善复合果蔬汁的体外抗氧化能力。
3 结论
本文使用不同益生菌及其组合发酵以沙棘、胡萝卜和黑枣为原料制备的复合果蔬汁，探究复合果蔬汁发酵过程中关键理化性质、有机酸、总黄酮和总多酚类活性物质及体外抗氧化能力等的变化规律。结果表明，相比直接利用植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌发酵复合果蔬汁，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌耦合发酵可显著增加（P<0.05）乳酸菌的菌落总数，并提高（P<0.05）总酸、总黄酮、总多酚、乙酸和乳酸等物质的含量及增加（P<0.05）体外抗氧化活性。3种工艺发酵复合果蔬汁中还原糖含量无显著差异。本研究不仅丰富了复合果蔬汁的产品种类，还为乳酸菌发酵复合果蔬汁的加工和生产提供数据支持。
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