栀子（Gardenia jasminoides Ellis）属茜草科栀子属植物，又名黄栀子、山栀、白蟾，是我国应用广泛的中药材，始载于《神农本草经》。栀子果是由新鲜成熟的栀子果实经干燥处理后所得的产物，栀子果中富含藏红花素类、环烯醚萜苷类、黄酮类、有机脂肪酸类等多种化学成分，具有良好的抗氧化[1]、抗炎镇痛[2-3]、抗微生物[4]、抗血栓[5]、消肿护肝[6]等功效。栀子中提取出的栀子色素作为天然色素，被广泛应用于食品行业中[7]。1998年卫生部公布栀子果为药食两用资源后，栀子在食品中的应用逐渐引起人们的重视。栀子苷是鉴别和评价栀子质量标准的依据，在保肝利胆[8]、抗抑郁[9]、解热镇痛和保护心血管内皮细胞等方面具有一定功效。目前国内外学者针对栀子的化学成分与药理药效方面研究较多，但将其作为保健食品以及在食品工业中的应用还不多见。
市面上常见的果冻，外观晶莹，色彩鲜亮，口感柔滑细腻，深受消费者的喜爱。但随着人们对健康生活的关注，具有高营养价值和一定保健功能的果冻可能是未来的发展方向[10]。梁晓娟等[11-13]通过使用百合、柿子和芹菜以及其它药食两用食品，对果冻的营养保健功效进行了研究。目前尚无关于以栀子苷为主要成分的果冻的研究报道。本研究针对栀子苷的提取工艺和栀子苷保健果冻制备工艺进行双优化，旨在开发出一款色泽诱人、口感光滑细腻且具有一定清热利胆功效的栀子苷保健果冻。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
栀子苷对照品（批号AF9032906，纯度≥98%）：成都埃法生物科技有限公司；栀子果实：市售，产自河南洛阳；乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙酸乙酯（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；琼脂粉、木糖醇：市售；试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津（中国）有限公司；S-114电子分析天平：上海梅颖浦仪器有限公司；800Y-304粉碎机：铂欧五金制品有限公司；HH-8数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵：长沙明杰仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪：北京科伟永兴仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 栀子果实的预处理
栀子果实经干燥粉碎后得到栀子粉末，过40目筛，备用。
1.3.2.2 栀子苷提取
取适量的栀子粉末与乙酸乙酯混合置于圆底烧瓶中，回流提取数小时后过滤，冷却至10℃～30℃，得到栀子苷提取液[14]。
1.3.2.3 调配
以一定的料液比，将琼脂粉加入水中，用小火煮胶，加热使其完全溶解，过程中需不断搅拌，再加入适量的木糖醇和栀子苷提取液，搅拌均匀。
1.3.2.4 罐装杀菌
趁热将混合好的果冻液倒进模具中，80℃～85℃条件下水浴加热，持续15 min后冷却至10℃～30℃，即得栀子苷保健果冻。
1.3.3 感官评价
由10名（5男5女）食品专业同学组成的评价小组，对试验制备的果冻进行感官评价，主要从栀子苷保健果冻的外观色泽、风味、口感和组织形态等多方面进行评价，具体的感官评定标准见表1[15]。
表1 感官评定标准
Table 1 Sensory assessment standard
项目 评定标准 分值色泽（20分）色泽呈浅黄色，颜色分布均匀 16～20色泽呈暗黄色，颜色分布较均匀 11～15色泽呈黄褐色，颜色分布不均匀 0～10风味（20分）栀子清香味浓郁，无不良风味 16～20栀子清香味较浓，无不良风味 11～15栀子清香味较淡，无不良风味 0～10口感（30分）入口顺滑，咀嚼时有弹性，酸甜适宜 21～30入口顺滑，咀嚼时有弹性，较酸或较甜 11～20入口顺滑，咀嚼时没有弹性，酸味或甜度过浓 0～10组织形态（30分）外观完整无裂纹，组织紧实无气泡 21～30外观完整有少量裂纹，组织较紧实有少量气泡 11～20外观不完整有大量裂纹，组织松散有大量气泡 0～10
1.4 试验设计
1.4.1 栀子苷提取工艺的单因素试验
选取提取时间、提取温度及栀子粉末与乙酸乙酯的料液比3个因素，进行单因素试验，以栀子苷提取率为指标，确定适宜的单因素水平。
1.4.2 栀子苷提取工艺的响应面试验设计
在单因素试验的基础上，选取提取时间、提取温度、栀子粉末与乙酸乙酯的料液比3个因素进行响应面试验，以栀子苷提取率作为评价指标，并采用Design-Expert 8.0.6软件对二次多项方程进行显著性分析，优化栀子苷提取工艺参数。响应曲面的试验因素和水平见表2。
表2 Box-Behnken试验因素水平
Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design
水平 因素A提取时间/hB提取温度/℃C料液比/（g/mL）-1 2 70 1∶4 0 3 75 1∶5 1 4 80 1∶6
1.4.3 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定栀子苷的含量
色谱条件[16]：色谱柱ShimadzuC18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水体积比 15∶85；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：238 nm；进样量：10 μL。
对照品溶液的制备：精密称取2.03 mg栀子苷对照品于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，即得浓度为0.2 mg/mL的栀子苷对照品溶液。
样品溶液的制备：取1 mL优化后最佳工艺所得的栀子苷提取液于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，通过0.45 μm微孔滤膜后上机分析。
用50%甲醇将浓度为0.2 mg/mL的栀子苷对照品溶液逐级稀释，得到浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL的溶液。在上述色谱条件下进行测定，得到一元线性回归方程：Y=13 339X-10 393，R2=0.999 8，式中：Y为峰面积；X为栀子苷对照品浓度，μg/mL。回归方程显示在20.00 μg/mL～160.00 μg/mL的浓度范围内相关性良好。
1.4.4 果冻制备工艺的单因素试验
选取琼脂粉与水的料液比、栀子苷提取液添加量及木糖醇添加量3个因素，进行单因素试验，以果冻感官评分为指标，确定适宜的因素水平。
1.4.5 果冻制备工艺的响应面试验设计
在单因素试验基础上，选取琼脂粉与水的料液比、栀子苷提取液添加量、木糖醇添加量3个因素为自变量，以感官评分为响应值，利用Box-Behnken试验设计模型优化果冻制备工艺条件。响应曲面试验因素和水平见表3。
表3 Box-Behnken试验因素水平
Table 3 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design
水平B栀子苷提取液添加量/%因素A料液比/（g/mL）C木糖醇添加量/%-1 1∶40 4 6 0 1∶50 5 8 1 1∶60 6 10
1.5 数据处理
在数据分析过程中，采用Excel 2010对试验数据进行整理，利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面结果进行分析和作图。
2 结果与分析
2.1 栀子苷提取工艺的单因素试验
单因素试验结果见图1。
图1 提取时间、提取温度、料液比对栀子苷提取率的影响
Fig.1 Effects of extraction time，extraction temperature and material-liquid ratio on extraction rate of geniposide
由图1可知，当提取时间小于3 h时，提取率不断升高并在3 h达到最大值5.47%，当提取时间大于3 h时，可能由于栀子粉末中的杂质在长时间高温回流下不断被溶出，影响提取效果，提取率整体降低。因此，提取时间选择3 h为宜。
提取温度55℃～75℃时，提取率不断增大，75℃时提取率最高达到4.65%，继续升高温度，提取率降低。可能由于栀子粉末与乙酸乙酯回流温度过高，原料中的栀子苷被破坏，影响了提取效果。因此，提取温度选择75℃为宜。
料液比为 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）时，栀子苷提取率随溶剂体积增大不断提高，1∶5（g/mL）时提取率最高达到4.91%，若继续增加乙酸乙酯的体积，栀子苷提取率呈下降趋势，可能是由于栀子粉末与乙酸乙酯的混合溶液含有其它杂质成分，溶剂体积升高使得杂质溶出，反而不利于栀子苷的提取。因此，料液比选择1 ∶5（g/mL）为宜。
2.2 栀子苷提取工艺的响应面试验结果
2.2.1 回归模型的建立与检验
三因素三水平的响应面试验结果见表4。
表4 Box-Behnken设计方案及结果
Table 4 Experimental design and results for response surface analysis
序号 A提取时间 B提取温度 C料液比 Y栀子苷提取率/%1 -1 1 0 4.82 2 0 1 1 5.04 3 0 1 -1 5.13 4 0 0 0 5.88 5 1 -1 0 4.61 6 0 -1 -1 4.38 7 1 1 0 4.69 8 1 0 1 5.34 9 0 0 0 5.87 10 -1 0 1 4.75
续表4 Box-Behnken设计方案及结果
Continue table 4 Experimental design and results for response surface analysis
序号 A提取时间 B提取温度 C料液比 Y栀子苷提取率/%11 0 -1 1 5.09 12 0 0 0 5.76 13 0 0 0 5.73 14 -1 -1 0 4.40 15 -1 0 -1 4.55 16 1 0 -1 4.67 17 0 0 0 5.76
采用Design-Expert 8.0.6软件对表4的试验数据进行分析拟合，得到二次多项回归方程为：Y=5.80+0.099A+0.15B+0.19C-0.085AB+0.12AC-0.20BC-0.63A2-0.54B2-0.35C2。
为了更好地验证方程的有效性，对得出的栀子苷提取率的数学模型进行了方差分析，结果如表5所示。
表5 栀子苷提取率的方差分析
Table 5 Analysis of variance of geniposide extraction rate
注：* 表示 P＜0.05，差异显著；** 表示 P＜0.01，差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 4.55 9 0.51 43.26 <0.000 1 **A 0.078 1 0.078 6.67 0.036 3 *B 0.18 1 0.18 15.40 0.005 7 **C 0.28 1 0.28 23.74 0.001 8 **AB 0.029 1 0.029 2.47 0.159 9 AC 0.055 1 0.055 4.72 0.066 3 BC 0.16 1 0.16 13.69 0.007 7 **A2 1.65 1 1.65 141.27 <0.000 1 **B2 1.24 1 1.24 106.50 <0.000 1 **C2 0.50 1 0.50 43.18 0.000 3 **残差 0.082 7 0.012失拟项 0.062 3 0.021 4.29 0.096 7纯误差 0.019 4 4.850×10-3合计 4.63 16
根据表5分析可知，模型的P<0.000 1极显著[17]。模型的失拟项P>0.05，不显著，表明拟合的回归方程符合实际情况，该模型可行性高，误差小，可用此模型对栀子苷的提取工艺参数进行分析和预测[18]。由显著性检验分析得出，模型中 B、C 及 BC、A2、B2、C2均有极显著的影响。一次项A对响应值有显著影响。在所选取的水平因素范围内，由F值的大小，可得出影响栀子苷提取率强弱的顺序依次为C>B>A，即栀子粉末与乙酸乙酯料液比＞提取温度＞提取时间。
该模型的R2=0.982 3，R2Adj=0.959 6，表明该模型与实际情况拟合度较好，模型可行性好，试验误差小[19]。变异系数CV=2.13%，说明模型预测效果好，能较好地反映真实试验值，即栀子苷的最佳提取工艺可通过该方程来确定[20]。
2.2.2 响应面分析
响应面图倾斜程度越大，表明响应值对因素的变化越敏感。反之，表明响应值对因素的变化不敏感，结果见图2。
图2 各因素的交互作用对栀子苷提取率的影响
Fig.2 Effect of interaction of various factors on extraction rate of Geniposide
由响应面图可知提取时间、提取温度、料液比与栀子苷提取率存在相关性。采用Design-Expert 8.0.6软件分析，获得了栀子苷的最佳提取工艺为：提取时间3.10 h，提取温度75.41℃，栀子粉末与乙酸乙酯的料液比1∶5.26（g/mL），预测栀子苷的提取率可达到5.84%。根据实际操作的可行性，最佳配方修正为：提取时间3.00 h，提取温度75.00℃，栀子粉末与乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），为检验模型预测的准确性，采用以上工艺，重复试验3次，进行验证试验，此条件下测得的栀子苷提取率为5.81%，与预测值接近度为99.49%，表明该模型能很好地反映栀子苷的提取率与各影响因素之间的关系。
2.3 果冻制备工艺的单因素试验
单因素试验结果见图3。
图3 料液比、栀子苷提取液添加量、木糖醇添加量对果冻品质的影响
Fig.3 Effects of material-liquid ratio，geniposide extract and xylitol on the quality of jelly
由图3可见，感官评分随溶剂体积增大先升高后降低，若琼脂粉的添加量过少，果冻无法凝固、咀嚼口感不佳。当琼脂粉与水的料液比达到1∶50（g/mL）时，果冻的硬度、弹性及咀嚼性达到最佳状态。若琼脂粉的添加量过高，果冻质地过硬、失去弹性。因此，下一步试验中料液比选定为1∶50（g/mL）。
感官评分先随栀子苷提取液添加量的增加而增大，呈明显上升趋势，栀子苷提取液添加量5%时，感官评分达到最大值，之后下降趋势明显。栀子苷提取液添加量过少，易导致栀子风味不明显；添加过多，易导致产品口感过酸。因此，下一步试验中栀子苷提取液添加量选定为5%。
当木糖醇的添加量低于8%时，口感略酸。当添加8%的木糖醇时，口感适宜，能凸显栀子果冻的独特风味。高于8%时，又过于甜腻。因此，下一步试验中木糖醇添加量选定为8%。
2.4 果冻制备工艺的响应面试验结果
2.4.1 回归模型的建立与检验
选取琼脂粉与水的料液比、栀子苷提取液添加量、木糖醇添加量为自变量，以感官评分为响应值，进行三因素三水平的试验设计，对栀子苷保健果冻制备工艺参数进行优化，结果见表6。
表6 Box-Behnken设计方案及结果
Table 6 Experimental design and results for response surface analysis
序号 A料液比 B栀子苷提取液添加量C木糖醇添加量 Y感官评分1-1 1 66 2 0-1 -1 74 0 3 -1 1 0 73 4 -1 0 -1 73 5 1 1 0 80 6 88 7 0 0 0 89 0 0 0 8-1 0 78 9 0 0 0 90 1 10 0 1 1 70 11 1 0 1 74 12 -1 0 1 60 13 -1 -1 0 68 14 1 0 -1 78 15 0 0 0 89 16 0 0 0 91 17 0 1 -1 84
采用Design-Expert 8.0.6软件对表6数据进行回归分析，得到二次多项回归方程为：Y=89.40+4.50A+2.63B-4.88C-0.75AB+2.25AC-1.50BC-8.45A2-6.20B2-9.70C2。
栀子苷果冻制备工艺响应面优化试验方差分析结果如表7所示。
表7 栀子苷保健果冻感官研究结果的方差分析
Table 7 Analysis of variance of sensory study results of geniposide health jelly
注：*表示 P＜0.05，差异显著；** 表示 P＜0.01，差异极显著。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1393.99 9 154.89 72.52 <0.000 1 **A 162.00 1 162.00 75.85 <0.000 1 **B 55.13 1 55.13 25.81 0.001 4 **C 190.13 1 190.13 89.02 <0.000 1 **AB 2.25 1 2.25 1.05 0.338 9 AC 20.25 1 20.25 9.48 0.017 8 *BC 9.00 1 9.00 4.21 0.079 2 A2 300.64 1 300.64 140.77 <0.000 1 **B2 161.85 1 161.85 75.78 <0.000 1 **C2 396.17 1 396.17 185.50 <0.000 1 **残差 14.95 7 2.14失拟项 9.75 3 3.25 2.50 0.1985纯误差 5.20 4 1.30合计 1 408.94 16方差
根据表7分析可知，模型的P<0.000 1，表明此模型极其显著，失拟项P>0.05，表现为不显著，因此模型成立，可用此模型对栀子苷果冻的制备工艺参数做出分析和预测。由显著性检验分析得出，模型中一次项A、B、C 及二次项 A2、B2、C2对果冻感官评分有极显著的影响。交互项AC有显著影响。在所选取的水平因素范围内，由F值的大小，可得出影响果冻感官评分强弱的顺序依次为C>A>B，即木糖醇添加量＞料液比＞栀子苷提取液添加量。
模型的回归系数为R2=0.989 4，校正回归系数为R2Adj=0.975 7，表明该回归模型拟合度较好，试验误差小，只有2.43%左右的变异不能用此模型进行分析。变异系数CV=1.88%，表示这个模型能反映各因素与果冻感官评分之间真实关系，即栀子苷保健果冻的最佳制备工艺可通过该方程来确定。
2.4.2 响应面图分析
通过Design-Expert 8.0.6软件绘制响应面分析图，见图4。
图4 各因素的交互作用对果冻感官评分的影响
Fig.4 Effects of interaction of various factors on sensory score of jelly
由响应面图可知在优化栀子苷保健果冻制备工艺配方的过程中，料液比、栀子苷提取液添加量、木糖醇添加量与感官评分存在相关性。采用Design-Expert 8.0.6软件分析，获得了栀子苷保健果冻的最佳制备工艺配方为：琼脂粉与水的料液比 1∶52.24（g/mL），栀子苷提取液添加量5.23%，木糖醇添加量7.76%，预测栀子苷保健果冻的感官评分可达到90.79分。根据实际操作的可行性，最佳配方修正为：琼脂粉与水的料液比 1∶52.00（g/mL），栀子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，为检验模型预测的准确性，采用以上工艺配方，重复试验3次，进行验证试验，此条件下制作的栀子苷保健果冻的感官评分为90.00分，与预测值接近度为99.13%，表明该模型能很好地反映栀子苷保健果冻的感官评分与各影响因素之间的关系。
3 结论
本研究采用响应面法，针对栀子苷的提取工艺和栀子苷保健果冻制备工艺进行双优化，得到栀子苷提取率3个影响因素的主次关系为：栀子粉末与乙酸乙酯的料液比＞提取温度＞提取时间，栀子苷最佳提取工艺的条件为：提取时间3.00 h，提取温度75.00℃，栀子粉末与乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），该工艺条件下，栀子苷提取率可达到5.81%。得出栀子苷保健果冻的最佳制备工艺条件为：琼脂粉与水的料液比1∶52.00（g/mL），栀子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，该条件下栀子苷保健果冻的感官评分可达到90.00分。
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