水翁花开始记载于《岭南采药录》中，是桃金娘科植物水翁的干燥花蕾，别名水雍花、大蛇药、水榕花、酒翁、水香。具有清热解暑、生津止渴的功效，主要用于治疗伤风感冒、口渴腹胀或呕吐泄泻[1]。现代药理研究表明，水翁花具有抗炎镇痛、抗内毒素以及保护神经细胞等作用[2-4]。
水翁花主要分布于广东、广西、海南、福建等省，印度、越南、马来西亚等地也有分布。在民间应用非常广泛，疗效确切，夏季常作凉茶以解暑，也是“清热凉茶”等中成药的主要原料[5]。水翁花蕾中已知的化学成分有黄酮类、氨基酸、熊果酸、齐墩果酸、橙酮等[6-9]。其中，黄酮类化合物是水翁花的主要成分[10-12]，黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等多种作用[13-15]。本试验以水翁花为原料，采用纤维素酶法提取水翁花中的总黄酮，利用响应面优化其提取工艺条件，并研究水翁花总黄酮的抗氧化能力，以期为水翁花的研究及开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水翁花蕾：产于广东，粉碎过60目筛；纤维素酶（biological reagen，BR）（酶活：15 000 U/g）、芦丁标准品（光谱纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；BS224S精密天平：SARTORIUS公司；PHS-3C型pH计：上海佑科仪器仪表有限公司；DKS-24型电热恒温水浴锅：杭州蓝天化验仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 水翁花总黄酮提取率的测定
参考文献[16]，得到总黄酮质量浓度（Y，mg/mL）与吸光度（X）的标准曲线方程为Y=0.085 3X-0.000 8，R2=0.999 3。根据标准曲线，可算出总黄酮的质量浓度。
按标准曲线方程计算，按下式计算总黄酮的提取率。
式中：c为水翁花提取液总黄酮的质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为提取用水翁花的质量，mg。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 酶用量
精确称取1 g水翁花粉于三口烧瓶中，设置温度55℃，pH值为5.0，酶用量为0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%的条件下提取60 min。根据1.3.1项下方法，计算总黄酮的提取率。
1.3.2.2 酶解温度
精确称取1 g水翁花粉于三口烧瓶中，设置温度40、45、50、55、60 ℃，pH 值为 5.0，酶用量为 0.50%的条件下提取60 min。根据1.3.1项下方法，计算总黄酮的提取率。
1.3.2.3 酶解时间
精确称取1 g水翁花粉于三口烧瓶中，设置温度55℃，pH值为5.0，酶用量为0.50%的条件下提取20、40、60、80、100 min。根据 1.3.1 项下方法，计算总黄酮的提取率。
1.3.2.4 pH值
精确称取1 g水翁花粉于三口烧瓶中，设置温度55℃，pH 值为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶用量为 0.50%的条件下提取60 min。根据1.3.1项下方法，计算总黄酮的提取率。
1.3.3 响应面优化试验
以单因素试验为基础，以酶用量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH 值（D）为独立自变量，水翁花总黄酮提取率（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计原理，进行四因素三水平响应面试验设计[17]，因素及水平设计见表1。
表1 因素和水平设计
Table 1 Design of factors and levels
水平 因素A酶用量/% B酶解温度/℃ C酶解时间/min D pH值-1 0.25 50 40 4.5 0 0.5 55 60 5.0 1 0.75 60 80 5.5
1.3.4 水翁花总黄酮抗氧化活性的研究
1.3.4.1 清除ABTS+自由基能力
分别配制总黄酮质量浓度为 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mg/mL的水翁花总黄酮溶液和VC对照溶液，参照SINGH等[18]的方法测定ABTS+自由基清除率。
1.3.4.2 β-胡萝卜素/亚油酸抗氧化体系
参照文献[19]方法，并稍作修改。称取0.5 mg β-胡萝卜素、25 μL 亚油酸及 200 μL Tween-40，用氯仿将其定容到1 mL。取配好的溶液至圆底烧瓶中，40℃旋转蒸干，然后用蒸馏水将其定容到100 mL的容量瓶中。0.5 mL 不同浓度的黄酮溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）加入2.5 mL的上述新鲜配制的β-胡萝卜素/亚油酸介质液，50℃孵育60 min，470 nm处，测定吸光度。以丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）做阳性对照。抗氧化能力采用下式计算。
式中：A0为开始时，不同质量浓度下的吸光度；A60为孵育60 min，不同质量浓度下的吸光度；
为开始时，质量浓度为0的吸光度；
为孵育60 min，质量浓度为0的吸光度。
1.3.4.3 总还原能力
水翁花总黄酮的总还原能力测定，参照文献[20]，修改如下：0.5 mL不同浓度的黄酮溶液（0.15 mg/mL～0.75 mg/mL）与 0.5 mL 1%铁氰化钾溶液、0.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）充分混匀；溶液在50℃的水浴中反应30 min后，再加入10%的三氯乙酸0.5 mL，混匀。溶液在1500×g条件下，离心10min。取上清0.5 mL，与0.1 mL 0.1%FeCl3以及1.5 mL蒸馏水混匀，摇匀静止5 min，在700 nm测吸光度。阳性对照选用 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytolu-ene，BHT）。
1.4 数据处理
用Design Expert 10.0.7软件进行响应面分析，用OriginPro9.1软件作图，测定数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酶用量对总黄酮提取率的影响
酶用量对总黄酮提取率的影响如图1所示。
图1 酶用量对总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effects of cellulase dosage on yield of total flavonoids
由图1可知，随着纤维素酶添加量增大，水翁花总黄酮的提取率呈先上升后下降的趋势，在酶添加量为0.5%时达到最大值。其原因可能是酶用量的增加，纤维素酶与更多的水翁花细胞壁作用，促进了细胞内黄酮的溶出，提高了总黄酮提取率；而当酶用量过大时，酶与底物的作用达到饱和，酶解作用反而受到抑制，降低了提取率[21]。故酶用量选择0.5%为0水平，进行响应面法优化。
2.1.2 酶解温度对总黄酮提取率的影响
酶解温度对总黄酮得率的影响结果见图2。
图2 酶解温度对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on yield of total flavonoids
由图2可以看出，在酶解温度40℃～55℃时，随着酶解温度升高，总黄酮的提取率增大，最大值在55℃处获得，继续升高温度，提取率呈下降趋势，这可能是因为温度升高使得酶部分或全部变性，酶的活性降低，不利于黄酮的浸出与提取[22]。故酶解温度选择55℃为0水平，进行响应面法优化。
2.1.3 酶解时间对总黄酮提取率的影响
酶解时间对总黄酮提取率的影响见图3。
图3 酶解时间对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effects of hydrolysis time on yield of total flavonoids
由图3可得，总黄酮提取率在20 min～60 min内随着酶解时间延长而增大，再继续增加时间，总黄酮提取率反而下降。其原因可能是刚开始，酶解时间太短，酶解反应不完全，水翁花的细胞壁在这个过程中得到的破坏不大，其中黄酮成分不易溶出，提取率较低，随着时间的延长，黄酮成分不断溶出，提取率升高。但酶解时间过长，部分黄酮结构受到破环，反而降低了提取率[23]。故酶解时间选择60 min为0水平，进行响应面法优化。
2.1.4 pH值对总黄酮提取率的影响
pH值对水翁花总黄酮得率的影响结果见图4。
图4 pH值对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effects of pH on yield of total flavonoids
由图4分析可知，当溶液pH值小于5.0时，总黄酮提取率随着pH值的增大而增大，当pH值达到5.0时总黄酮提取率达到最大值，随后总黄酮提取率逐渐下降。这是因为酶解反应有适宜的pH值，在此pH值条件下纤维素酶的活力最大。在水翁花总黄酮提取过程中酶在pH值为5.0时为最适宜，过高或过低的pH值，酶的活性都会降低[24]，最佳的pH值选择为5.0。故pH值选择5.0为0水平，进行响应面法优化。
2.2 响应面试验
为进一步优化水翁花总黄酮提取条件，以黄酮提取率（Y）为响应值，应利用Design-Expert 10.0.7软件中的Box-Behnken设计四因素三水平的响应面分析试验，根据表1设定的因素和水平，共设计29个处理组，其中5个零水平处理组，响应面分析试验结果见表2。
表2 Box-Behnken试验结果
Table 2 The result of Box-Behnken experiment
试验号 因素 提取率/%A B C D 1 0 0 0 0 3.77±0.08 2 0 1 0 1 3.11±0.07 3 1 1 0 0 3.31±0.08 4 0 0 0 0 3.73±0.08 5 1 0 0 1 2.83±0.07 6 -1 0 -1 0 2.68±0.07 7 1 0 -1 0 3.07±0.07 8 -1 0 1 0 2.43±0.06 9 0 0 1 1 2.65±0.06 10 0 0 1 -1 3.20±0.07 11 -1 0 0 -1 2.64±0.06 12 -1 -1 0 0 2.48±0.05 13 1 0 1 0 2.89±0.07 14 0 -1 0 1 2.77±0.07 15 -1 0 0 1 2.79±0.07 16 0 -1 1 0 3.05±0.08 17 0 0 -1 1 2.85±0.07 18 0 1 0 -1 3.41±0.08 19 0 1 1 0 3.09±0.06 20 1 -1 0 0 3.01±0.06 21 -1 1 0 0 2.85±0.06 22 0 0 -1 -1 2.81±0.06
续表2 Box-Behnken试验结果
Continue table 2 The result of Box-Behnken experiment
试验号 因素 提取率/%A B C D 23 1 0 0 -1 3.34±0.07 24 0 0 0 0 3.82±0.09 25 0 -1 0 -1 3.03±0.06 26 0 0 0 0 3.89±0.10 27 0 -1 -1 0 2.60±0.06 28 0 0 0 0 3.85±0.10 29 0 1 -1 0 3.02±0.06
根据表2数据进行二次多元回归拟合，得到总黄酮提取率（Y）对酶用量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH值（D）的回归模型为：Y=3.81+0.22A+0.15B+0.023C-0.12D-0.018AB+0.018AC-0.16AD-0.095BC-0.010BD-0.15CD-0.053A2-0.35B2-0.53C2-0.39D2，其中Y为水翁花总黄酮提取率。对该模型进行方差分析，结果见表3。
表3 水翁花黄酮提取回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Cleistocalyx operculatus
注：*.差异显著，P＜0.05；**.差异高度显著，P＜0.01；***.差异极显著，P＜0.001。
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 4.80 14 0.34 30.16 ＜0.000 1 ***A 0.55 1 0.55 48.81 ＜0.000 1 ***B 0.29 1 0.29 25.10 ＜0.000 2 ***C 0.006 533 1 0.006 533 0.57 0.460 9 D 0.17 1 0.17 15 0.001 7 **AB 0.001 225 1 0.001 225 0.11 0.747 5 AC 0.001 225 1 0.001 225 0.11 0.747 5 AD 0.11 1 0.11 9.58 0.007 9 **BC 0.036 1 0.036 3.18 0.096 4 BD 0.000 4 1 0.000 4 0.035 0.853 9 CD 0.087 1 0.087 7.66 0.015 1 *A2 1.81 1 1.81 159.69 ＜0.000 1 ***B2 0.81 1 0.81 71.00 ＜0.000 1 ***C2 1.80 1 1.80 158.18 ＜0.000 1 ***D2 0.99 1 0.99 86.90 ＜0.000 1 ***残差 0.16 14 0.011失拟项 0.14 10 0.014 3.56 0.116 4纯误差 0.016 4 0.000 402总和 4.96 28
由方差分析可知，该模型的F=30.16，P<0.000 1，回归模型达到极显著，能够正确反映各因素与响应值之间的变化关系。失拟项P=0.116 4>0.05，模型失拟度不显著，表明该模型拟合程度比较好，试验误差小。决定系数R2=0.969 7，表明可用该模型解释96.97%的试验数据；调整的确定系数
，表明有93.58%的总黄酮提取率变异分布与所研究的A、B、C、D 4个工艺因素相关。模型的CV较小，为3.47%，说明试验稳定、可靠。一次项 A、B 和二次项 A2、B2、C2、D2的 P＜0.001，表明 A、B 和 A2、B2、C2、D2对总黄酮提取率的影响是极显著的；一次项D和交互项AD的P＜0.01，表明D和AD对总黄酮提取率的影响是高度显著的；交互项CD的P＜0.05，表明CD对总黄酮提取率有显著影响。而一次项 C、交互项 AB、AC、BC、BD 的 P＞0.05，表明其对总黄酮提取率没有显著性影响。在试验考察范围内，各因素对水翁花总黄酮提取率的影响主次顺序为：酶用量＞酶解温度＞pH值＞酶解时间。
应用Design-Expert 10.0.7软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应曲面图如图5所示。
图5 各因素两两交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图
Fig.5 Response surface map of the effect of the interaction between the two test variables and the yield of total flavonoids
由图5可知，各因素对水翁花总黄酮的提取率的影响不同。其中，酶用量的影响最为显著，随着酶用量的延长，总黄酮提取率先增大后减少，表现为曲面较陡；酶解温度和pH值的影响次之，表现为曲面相对平缓；酶解时间的影响最小，曲面最为平缓。可见，响应面图分析结果与方差分析结论一致。
2.3 验证试验
利用Design Expert 10.0.7软件分析，得到最佳提取工艺参数为：酶用量0.558 25%、酶解温度56.05℃、酶解时间60.74 min、pH值4.89。为便于试验操作，将最佳提取条件进行修正为：酶用量0.56%、酶解温度56℃、酶解时间61 min、pH值4.9，进行验证试验，得到水翁花总黄酮实际提取率为（3.85±0.09）%，与预测值（3.87±0.08）%稳合的很好。
2.4 抗氧化结果
2.4.1 ABTS+自由基清除作用
ABTS试剂与过二硫酸钾反应，可以生成绿色的ABTS+自由基，该自由基在734 nm有最大吸收。加入具有抗氧化活性的物质会抑制ABTS+自由基的生成，使颜色减弱，所以，通过检测734 nm的吸光度，可以评价抗氧化物质的抗氧化能力[25]。总黄酮对ABTS+自由基的清除作用见图6。
图6 总黄酮对ABTS+自由基的清除作用
Fig.6 Inhibition effects of total flavonoids on ABTS+radical
由图6可知，当水翁花总黄酮从0.15 mg/mL增加到0.75 mg/mL时，对ABTS+自由基的清除率从（19.4±2.2）%增长到70.6±3.0%。总黄酮对ABTS+自由基有很好的清除作用，对ABTS+自由基的清除率与总黄酮浓度成正比。总黄酮的IC50=0.41 mg/mL，VC的IC50=0.20 mg/mL，IC50越小说明抗氧化活性越好。
2.4.2 对β-胡萝卜素/亚油酸体系的影响
β-胡萝卜素/亚油酸抗氧化体系广泛的应用于抗氧化能力的评价[26]。亚油酸自动氧化，生成的自由基与β-胡萝卜素反应，引起β-胡萝卜素的黄色衰减（在470nm处吸光度减小）；在有抗氧化剂存在时，褪色速度被减缓[27]。总黄酮及BHA对油脂氧化的清除率见图7。
图7 总黄酮对油脂氧化的抑制作用
Fig.7 Inhibition effects of total flavonoids on oil oxidation
由图7可知，总黄酮显示出一定的抑制油脂氧化作用，并且随着浓度的增加，对油脂氧化的抑制作用也增强，在最高质量浓度1.6 mg/mL时，对油脂氧化的清除率为（58.7±2.4）%。而BHA在此质量浓度下，清除率已达（98.6±3.3）%。
2.4.3 总还原能力的测定
物质的还原能力与其抗氧化活性之间存在密切关系。具有还原作用的物质，通过给出电子，把Fe3+还原成Fe2+，使Fe2+发生普鲁士蓝反应。普鲁士蓝在700nm处有最大吸收峰，故700 nm处吸光值越高，则还原力越强[28]。总黄酮总还原能力见图8。
图8 总黄酮总还原能力
Fig.8 Reducing power of the of total flavonoids
从图8可知，水翁花总黄酮的还原能力随浓度的增大而逐渐增大，具有浓度依赖性。当浓度为0.75 mg/mL时，总黄酮和BHT的还原力（以700 nm处的OD值表示）分别为（0.60±0.03）和（0.83±0.05）。尽管黄酮的还原活性比具有极强还原能力的BHT要弱一点，但仍表现出很好的还原能力。
3 结论
试验采用酶法提取水翁花中的黄酮类化合物，同时对其抗氧化活性进行评价。在单因素试验的基础上，利用响应面试验设计和优化了总黄酮的提取工艺，获得最佳工艺为：酶用量0.56%、酶解温度56℃、酶解时间61 min、pH值4.9，总黄酮提取率为（3.85±0.09）%。抗氧化活性研究表明，当总黄酮溶液浓度为0.75 mg/mL时，其对ABTS+自由基的清除率达到（70.6±3.0）%，对ABTS+自由基的半数清除浓度IC50值为0.41 mg/mL；当浓度为1.6 mg/mL时，对油脂氧化的清除率为（58.7±2.4）%；当总黄酮溶液浓度为0.75 mg/mL时，测得700 nm处的吸光度值为（0.60±0.03），其还原力稍弱于BHT。试验结果表明水翁花总黄酮提取液具有较好的抗氧化活性，可以为水翁花黄酮类化合物的开发利用提供理论依据和试验数据。
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