雌激素是女性的主要性激素，在调节正常生理和各种疾病状态中起重要作用[1]，可分为内源性雌激素和外源性雌激素[2]。内源性雌激素是由体内腺体或细胞分泌的激素，最常见的有雌二醇、雌三醇和雌酮。而外源性雌激素包括合成雌激素、植物雌激素和环境雌激素。其中，植物雌激素是一种多酚类物质，是大豆、水果、蔬菜等食品中含有的天然成分，类似于内源性雌激素的结构。环境雌激素则属于（endocrine disruptors，EDCs），是天然或合成化合物。该类雌激素通过模仿或阻断内源性激素的作用，影响人体的内分泌功能[3-4]。生活中常见的环境雌激素有氯联苯、双酚A（bisphenol A，BPA）和邻苯二甲酸盐[5]。
研究表明，动物源食品中有较多的雌激素残留[6]，其中牛奶和乳制品中是人体雌激素的主要膳食来源，其中含有雌二醇等内源性雌激素[7-8]。研究表明，市场上部分商品牛奶中的雌二醇含量达到5 pg/mL～20 pg/mL[9]，而儿童血清中的雌二醇含量则低于2 pg/mL[10]。因此，长期摄入含有高雌激素含量的牛奶会导致儿童性早熟或对成人的内分泌系统产生干扰[8]。
此外，外源性雌激素也广泛存在于食品中，蜂王浆、茶、巧克力、咖啡渣[11]中均含有雌激素类化合物。由于豆制品是亚洲国家饮食中不可缺少的一部分，据统计，人体异黄酮的摄入量可达到15 mg/d～50 mg/d[12]，这可能会导致男性产生女性化的生理症状。玉米赤霉烯酮（zearalen-one，ZEN）和双酚 A（BPA）是近年来受到广泛关注的具有雌激素效应的物质。ZEN作为非甾体雌激素霉菌毒素，是一种主要的食物污染物[13-14]，具有雌激素干扰毒性。食用被ZEN污染的食物或饲料会对人类或动物产生有害影响，例如降低生育能力和生殖能力 [15]。而BPA作为具有雌激素作用的内分泌干扰物，被广泛用于聚碳酸酯婴儿瓶和环氧食品罐中。食用罐装食品会导致人体内BPA含量增加，从而增加肥胖、糖尿病和冠心病的风险[16]。
虽然雌激素有益于预防阿尔茨海默症、冠心病以及骨质疏松，但也会对人体产生许多不良影响。过量摄入雌激素不仅会干扰固有的激素平衡、增加乳腺癌的发病率[17]，还会诱发免疫介导的疾病[18]。目前，国际上对食品中BPA和ZEN的含量有明确的规定。根据欧盟2002/72/EC法规，塑料食品接触材料中BPA的迁移量为3 mg/kg，其最大理论每日摄入量为50 μg/kg·bw/d，与美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定相同。欧盟规定仔猪日粮中ZEN的最高限量为100 μg/L，而我国规定复合饲料和玉米中ZEN的最高限量为500 μg/L。目前，各国没有规定食品中内源性雌激素的标准含量，但商品牛奶中雌激素的水平和人类长期饮用牛奶对人体健康的不利影响越来越受到学术界的关注。同时调查表明，从不同国家和地区采集的13种食品补充剂样品中，在14.8%的非激素补充剂中检测到成分列表中未标记的类固醇激素成分[19]。因此，检测食品中的雌激素有利于保障人体健康，避免雌激素对人体的不利影响。
免疫分析和仪器分析是现阶段检测食品中雌激素的主要手段，但由于雌激素结构的多样性，这两种方法只能检测食品中已知的雌激素，有局限性，而利用雌激素对细胞和动物的生物学效应来评价不同物质的雌激素效应可以弥补这一不足。
雌激素通过雌激素信号途径实现其生理功能，其信号途径可分为基因组信号和非基因组信号，分别由经典核受体（estrogen receptor，ER）和G蛋白偶联受体（gproteincoupledreceptor，GPER）介导[20]。基因介导的信号途径通过经典的核受体：ERα和ERβ发挥作用[21]。雌激素刺激细胞后，与雌激素受体结合，诱导受体构象变化，形成二聚体，并直接或间接激活受体转录域[22]。二聚体可以直接与雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）结合以诱导转录[23]，而在没有 ERE 序列的情况下，二聚体可以由DNA转录因子介导，间接结合到转录域[24]。非基因介导的雌激素信号途径，通过GPER和雌激素的结合，激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），介导雌激素信号转录，引起丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）的激活、cAMP的产生和细胞内钙的动员[25]。
信号通路被雌激素激活后，可以调节细胞内基因和蛋白质的表达，并介导细胞发育、增殖、迁移和存活等一系列下游事件，从而对代谢调节组织如子宫、脂肪、骨骼肌等产生生理影响[26-28]。例如，双酚A通过ERα途径促进OVCAR-3细胞的增殖[29]；雌二醇通过激活GPR30信号通路增强LSD1的表达，介导人子宫内膜癌的增殖[30]；在ERα阳性MCF-7细胞中，雌激素激活ERα转录，诱导ΔNp63的表达，从而诱导整合素β4 的表达，导致蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）磷酸化，提高细胞活力和迁移能力[31]。为此，建立了一系列基于雌激素信号通路的生物检测方法，以满足特异性筛选雌激素效应物的需要。
雌激素原始的检测方法为体内实验，其中子宫营养试验和鱼类内分泌干扰试验是我国环境中筛选分泌物的常规方法。子宫营养试验被用于检测雌激素活性的活性效应，被认为是检测雌激素活性物质的“金标准”[32]。类固醇受体分布在动物子宫中，雌激素可通过受体信号途径调节子宫功能[33]。该方法需要选择去势成年雌性或幼龄雌性啮齿动物进行连续给药和称重，经过一段时间后，剥离动物子宫称重。通过计算子宫湿重和子宫与体重的比值，筛查样品中的雌激素。小鼠子宫增重实验可用于评价咖啡渣和食品包装中双酚A的雌激素效应，发现咖啡副产物及其主要成分具有雌激素样信号转导活性[34]。赵丕文等[35]利用子宫增重实验研究淫羊藿等10种中药的雌激素样作用，发现淫羊藿具有一定的植物雌激素活性。
鱼类内分泌干扰试验是以肝脏产生的卵黄蛋白（yolk protein，VTG）作为生物标记物，检测外源性雌激素[36-37]。卵黄蛋白原是卵黄蛋白原蛋白的主要成分，在外源性雌激素的刺激下其表达量会增加[38]。例如，BPA可通过ER受体介导途径诱导雄性鱼肝脏中VTG的表达[39]。选择在试验容器中饲养鱼体，并使其暴露于含有化学物质的水体。喂养一定时间后，取血液或组织进行卵黄原蛋白检测，以评价雌激素活性水平。通过研究雌二醇对瓦氏黄颡鱼产生的的激素效应，发现雄性瓦氏黄颡对雌激素较为敏感，可作为外源性雌激素的检测模型[40]。除此以外，斑马鱼也被用作雌激素的评估模型，用于比较不同物质的的雌激素效应[11]。
体内实验虽然是一种可靠的雌激素效应筛选方法，但该方法操作复杂，试验周期长，成本高。为了简化试验操作。因此，在鱼类内分泌干扰试验的基础上，建立了以原代肝细胞为模型的体外细胞检测方法。将细胞暴露于含有受试物的培养基中，用VTG水平评价受试物的雌激素活性[41]。该方法需要对细胞进行裂解，分别在基因和蛋白水平上检测VTG的表达水平。
为了提高检测效率，建立了一种基于雌激素样物质对靶细胞增殖影响的E-screen方法。许多研究表明，雌激素与雌激素受体结合后可介导乳腺癌细胞的增殖，如果受试物中含有雌激素作用的物质，其对乳腺癌细胞的刺激将促进细胞增殖。通过计算受试物作用前后的细胞相对增殖效应值或增值速度来评价受试物的雌激素活性[42]。
为更好的模拟细胞在体内的生理环境，提高检测的可靠性，可在乳腺癌培养体系中加入大鼠肝S9体系。肝S9起到代谢化学物的作用，使得检测结果与体内实验结果高度吻合[43]。E-screen方法可用于检测环境水中的污染物[44]，评价中药提取物和蔬菜提取物[45]。与VTG法相比，E-screen法更敏感，通常结合体内试验确保试验的可靠性[46]。
2.3.1 表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器
表面等离子体共振（SPR）是电子在金属/介质界面上产生的强电磁振荡的现象，由于其对金属膜旁材料的敏感折射率而被广泛应用于各种生物传感器中，SPR反射金属在倏逝场中的反射指数（reflection index，RI）的变化与金属膜另一侧生物分子的密度成正比。因此，SPR无需进行任何标记，就可以实时检测金膜表面生物分子的结合和解离[47]。
基于此技术，研制了一种无标记SPR生物传感器芯片。以ERα和ERE作为生物特征元件，将其固定在生物芯片的金属膜上。当受试物中含有雌激素时，雌激素会迅速形成不稳定的ER/ERE复合物，改变ER与ERE之间的相互作用，通过检测结合效率和络合物稳定性的差异来评估雌激素效应[48]。同时，ERα和构象敏感肽可直接用于识别雌激素受体结合区的活性构象，以检测低剂量水平的雌激素[49]。目前，该生物传感器已应用于食品包装和玉米籽禅中双酚A的检测，检测限分别为5.2 pg/mL和7.07 ng/mL[50-51]。
2.3.2 细胞电化学生物传感器
电化学生物传感器以生物活性物质为生物功能性敏感基元，加入检测目标物后，通过信号转换器将生物学变化转化为电学信号，借此达到检测目的。而细胞电化学是基于生物电化学的原理，结合细胞和分子生物学技术，对细胞进行分析和表征的技术，揭示外源分子与细胞结构或功能的关系[52]。
雌激素的电化学检测方法是通过检测乳腺癌细胞中嘌呤引起的电信号变化来评估雌激素活性。乳腺癌细胞在雌激素的刺激下会产生增殖效应，从而导致细胞中嘌呤的增加[53]。细胞的电化学信号与鸟嘌呤的氧化有关。鸟嘌呤能迅速通过细胞膜到达电极表面，引起电化学信号的变化[54]。利用这一原理，可以评价不同物质的雌激素效应，但这种方法并没有很高的特异性，逐渐被电化学免疫传感器取代。
2.3.3 荧光细胞生物传感器
以雌激素受体控制的报告基因为基础的重组酵母筛选技术（pecombinant yeast estrogen system，RYES）是近年来被广泛应用于雌激素效应的筛选。其原理是将雌激素受体基因、雌激素效应元件和编码β-半乳糖苷酶（lac-z）的基因重组于酵母细胞[55]。当受试物具有雌激素样作用时，受试物与雌激素受体结合，介导雌激素效应元件的转录，从而激活lac-z报告基因，产生β-半乳糖苷酶，使底物β-d-半乳吡喃糖苷变黄。通过测量β-半乳糖苷酶的活性，定量检测受试物的雌激素效应[56]。YES技术的基础上，以荧光素酶作为报告基因，构建稳定表达ERE的重组HeLa细胞株，用于检测草鱼等鱼肉中雌激素样物质的含量，E2的加标回收率均在75%以上，相对标准偏差为7.3%～11.6%，具有较高的精密度[57]。
但对荧光素酶的检测需要预先对细胞壁进行破坏，操作步骤较为复杂。为此，BOVEE等[58]利用增强型绿色荧光蛋白（yEGF）改进了YES技术。以增强型荧光蛋白作为报告基因法，可以直接测定荧光蛋白的荧光值，简化了操作步骤。该方法检测雌二醇的半最大效应浓度（EC50）约为0.6 nmol/L，与传统YES方法的0.2 nmol/L相比更为灵敏[59]。除了酵母细胞模型，哺乳动物细胞系也可以作为载体来转移重组基因，其敏感性更高，但与子宫增重试验相关性较差[60]。曹旭等[61]以雌激素反应元件（ERE）及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因转染了乳腺癌细胞，雌二醇以剂量依赖的方式诱导稳定转染细胞系表达GFP，最大效应浓度为 1×10-10mol/L，EC50为 1.5×10-11mol/L。
荧光细胞生物传感器可作为动物源性食品中雌激素活性水平的快速筛选方法。采用该方法对4个城市采集的猪肉、鸡肉、牛肉、鱼类和鸡蛋样品进行了检测，结果显示，所有样本均具有雌激素活性[62]。除了动物源性食品外，食品添加剂、牛奶和啤酒也可以使用该方法评估雌激素活性[63-64]。
目前，检测食品中的雌激素含量多采用仪器分析和免疫分析方法，但雌激素的结构多样，这两种方法只能检测出已知结构的雌激素。同时，仪器分析前需要对样品进行预处理[65]，目标分析物需要预富集，操作复杂困难。更重要的是，液相、质谱等仪器价格昂贵，受场地限制。而免疫分析法虽然有更高的检测效率，但其对抗体的制备要求较高，不同雌激素的免疫检测需要对应的抗原支持，目前还难以完全覆盖，无法同时检测多种雌激素化合物，限制了雌激素效应物质的筛选。
基于雌激素效应途径的生物检测方法可以检测复杂基质的雌激素活性，弥补了仪器分析和免疫分析的不足。具有较高的特异性，可评价已知和未知物质的雌激素效应，不仅可以预测单一组分的雌激素效应，还能够评估混合物的联合雌激素活性[66]。但该方法不能实现单组分的准确定量，检测精度也不如仪器分析和免疫分析。
基于对雌激素的高度特异性，生物检测将成为食品中雌激素检测的首选。在未来的发展中，需要提高生物检测的准确性。同时，由于受试物中的化学物质未知，其中可能存在毒素因子，导致假阴性情况。因此，在后续检测中，有必要结合毒性试验，研究物质间相互作用对雌激素效应的影响，提高检测结果的准确性。同时，雌激素分子检测与毒性效应检测结合，有利于更好的了解食品中雌激素对人体的影响。以细胞毒性为基础建立的雌激素毒性效应检测，能够做到对食品基质以及水体中雌激素的定性检测。通过检测受雌激素特异性调控的基因或蛋白的表达量变化，对样品中的雌激素含量进行检测，能够更全面的评估雌激素对人体的生物学效应。
检测手段和设备的便携化、数字化也是食品检测未来的发展趋势。在生物检测分析方法的基础上，研制雌激素检测试剂盒。并在此基础上，开发便携式检测设备，并与移动应用连接，实现实时检测。这不仅有利于提高检测效率，也能满足现场检测的需要。此外，雌激素预测模型的建立将是雌激素检测的关键工作。MANSOURI等[67]建立了协同雌激素受体活性预测项目（collaborative estrogen receptor activity prediction project，CERAPP），以预测数千种化学品的雌激素受体相关活性。在没有试验数据的情况下，该模型可以为试验人员提供缺少的信息，并进行有针对性的试验。因此，雌激素检测的数字化发展对食品检测具有重要意义。
总的来说，食物中的雌激素会通过食物链进入人体，通过雌激素信号途径干扰人体内分泌系统，产生不良的生理效应。雌激素的生物学检测方法不仅满足了广泛筛选食品中雌激素效应物质的需要，而且具有较好的特异性，弥补了仪器检测和免疫检测的不足。但其定量分析余仪器分析相比不够准确，需要在今后的发展中加以解决。同时，生物方法与数字化相结合，也有利于推动食品检测向高效化方向发展。
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