在啤酒酿造过程中，啤酒酵母除产生主要代谢产物乙醇外，还会产生酸类、酯类、高级醇类、醛类、酚类等风味物质[1]。而高级醇是最重要的风味物质之一，主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和苯乙醇等。
啤酒中高级醇的含量一般为70 mg/L～100 mg/L，而部分优质的清爽型啤酒中高级醇含量能够控制在50 mg/L～90 mg/L[2]。高级醇含量过低，会使酒体不丰满，口感较差，但其含量过高，不仅影响酒体的协调性，还会对饮用者的身体产生明显的副作用。所以在啤酒的酿造过程中，如何把高级醇的含量控制在一个合理范围之内，是一个非常关键的问题。
1 啤酒酵母高级醇代谢途径
在啤酒酵母中，α-酮酸脱羧成醛后再被还原可以生成相应的高级醇。一般而言，根据α-酮酸来源方式的不同，将酵母生成高级醇的途径分为分解代谢途径（Ehrlich途径）和糖代谢途径（Harris途径）。
1.1 分解代谢途径（Ehrlich途径）
1907年，德国化学家Ehrlich首先提出由氨基酸可以生成高级醇，即所谓的Ehrlich途径，如图1所示。
图1 Ehrlich途径
Fig.1 Ehrlich pathway
啤酒酵母在利用糖类生成酒精的过程中，由蛋白质分解而来的氨基酸在转氨酶催化下生成相应的α-酮酸和谷氨酸，α-酮酸经脱羧酶和脱氢酶的作用转化为各种高级醇。研究发现，发酵液中的异丁醇、异戊醇、活性戊醇有大约25%来源于此途径[3]。在此途径下，缬氨酸生成异丁醇，亮氨酸生成异戊醇，苯丙氨酸生成苯乙醇，异亮氨酸生成活性戊醇[4]
1.2 糖代谢途径（Harris途径）
1953年，Harris提出高级醇可在葡萄糖经糖代谢合成氨基酸的过程中生成，如图2所示。
图2 糖代谢途径（Harris途径）
Fig.2 Metabolism pathway of carbohydrate（Harris pathway）
葡萄糖先后经过糖酵解途径、三羧酸循环生成的α-酮酸可以和NH3作用生成氨基酸，同时也可以在酮酸脱羧酶、脱氢酶的作用下生成高级醇。
2 高级醇代谢调控机理及关键基因
啤酒中的高级醇既可来源于Ehrlich途径，又可由糖代谢途径生成。当啤酒酵母在发酵过程中氨基酸含量十分丰富时，便会通过Ehrlich途径生成高级醇，主要包括酪醇、色醇、苯乙醇等10种高级醇的生成，相反，当某种必需氨基酸不足时，酵母会通过糖代谢途径合成氨基酸来满足自身生长需求，若此过程中氮源不足，糖代谢中间产物α-酮酸就会由于不能转变为相应氨基酸而积累，并在α-酮酸脱羧酶及醇脱氢酶的作用下生成高级醇，最重要的便是支链氨基酸的从头合成途径[5]。主要高级醇生成途径如图3所示。大致可以分为上下游两部分。上游途径：氨基酸/丙酮酸到α-酮酸；下游途径：α-酮酸脱羧还原为对应的高级醇。
图3 高级醇代谢途径
Fig.3 Metabolism pathway of higher alcohol
2.1 异丁醇途径及关键基因
异丁醇可以由缬氨酸分解而成（Ehrlich途径）。即缬氨酸经胞质支链氨基酸转氨酶（BAT2基因编码）作用转氨为 α-酮异戊酸（α-ketoisovalerate，KIV），随后KIV在酮酸脱羧酶（2-keto-acid decarboxylase，KDCs）、乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）催化下脱羧还原为异丁醇。同样，异丁醇也可由糖代谢途径生成。两分子糖酵解而来的丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（ILV2基因编码）的作用下缩合为2-乙酰乳酸（2-acetyl lactate，ALAC）和二氧化碳，乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）将 ALAC 还原为 2，3-二羟基异戊酸（2，3-dihydroxyisovalerate，DIV）后再经二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）作用脱水为KIV，生成的KIV可以在支链氨基酸氨基转移酶（BAT1基因编码）的催化下转化为缬氨酸，也可以经酮酸脱羧酶（ketonic acid decarboxylase，KDCs）和乙醇脱氢酶（ADHs）的催化生成高级醇。共同的中间产物KIV将异丁醇生成的两种途径相偶联，依据酵母需求生产高级醇[6]。
参与异丁醇合成过程中的关键酶有支链氨基酸渗透酶（BAP2基因编码）、支链氨基酸转氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCATs）、乙酰乳酸合成酶（ILV2基因编码）、乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）及二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）。分别负责支链氨基酸的摄取、降解及中间产物KIV的生成，所以它们的表达将影响异丁醇的产量。支链氨基酸转氨酶（BCATs）位于线粒体（Bat1p）和胞浆（Bat2p）中，催化支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAAs）的转氨反应，有研究表明BAT1基因倾向于催化氨基酸合成，而BAT2基因更倾向于氨基酸的降解[7]，这可能是由于它们所处环境的不同所造成的。HAMMER等[8]研究发现，在酿酒酵母中敲除BAT1基因后能显著提高异丁醇的产量，特别是当培养基中不含缬氨酸时，可使异丁醇产量比出发菌株增加14.2倍。原因可能是敲除BAT1基因后KIV转化为缬氨酸的能力减弱，KIV在线粒体中积累促进了异丁醇的产生。恰好这也进一步验证了之前所说的BAT1基因更倾向于催化氨基酸合成以及大部分异丁醇是酵母通过糖代谢生成的观点。同时，MA等[9]研究发现，敲除BAT2基因或过度表达BAT1基因都可以降低异丁醇含量，而敲除BAT2基因的同时过表达BAT1基因可以使异丁醇的含量进一步降低；Bap2p作为支链氨基酸渗透酶，与一般氨基酸渗透酶（由GAP1基因编码）等一起负责氨基酸的摄取，不过它优先负责支链氨基酸的转运。有研究发现，BAP2基因的缺失可使缬氨酸摄取量减少45%左右[10]，而缬氨酸又参与异丁醇的合成，所以BAP2基因的表达与异丁醇有一定关联；乙酰乳酸合成酶（ILV2基因编码）、乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）、二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）是催化丙酮酸生成中间产物α-酮异戊酸（KIV）的关键酶，AVALOS等[11]研究表明，ILV基因的单独过表达可使异丁醇的产量增加约5倍；由于异丁醇天然途径中最后两步反应在细胞质中进行，所以KIV在线粒体中合成后需运输到胞浆后才能生成异丁醇。为了克服异丁醇合成过程中KIV跨膜运输的障碍，Brat等[6]将缬氨酸生物合成酶基因ILV2、ILV5和ILV3由线粒体中重新定位到细胞质，在细胞质中形成了完整的异丁醇合成途径从而提高异丁醇的产量。同时WESS等[12]也指明在细胞质中过表达缬氨酸合成途径的乙酰乳酸合成酶（ILV2基因编码）、乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）和二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）3种内源性酶的同时阻断线粒体缬氨酸合成的第一步，可使异丁醇产量增加22倍，达到0.22 g/L。
2.2 活性戊醇途径及关键基因活性
Ehrlich途径：异亮氨酸转氨为α-酮-3-甲基戊酸，α-酮-α-甲基戊酸可以通过酮酸脱羧酶脱羧转化为α-甲基丁醛后被还原成活性戊醇[13]。
Harris途径：丙酮酸合成的α-酮丁酸在ILV基因的作用下生成α-酮-3-甲基戊酸，后经酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶作用生成活性戊醇。其中，中间产物α-酮丁酸由丙酮酸途径、高丝氨酸途径、苏氨酸途径3种途径生成。
丙酮酸途径：糖酵解而来的丙酮酸在异丙基苹果酸合成酶（LEU1基因编码）催化下生成β-苹果酸甲酯，β-苹果酸甲酯再转化为α-酮丁酸。
苏氨酸途径：天冬氨酸经高丝氨酸生成苏氨酸，苏氨酸在ILV1（苏氨酸脱氨酶）的作用下转化成α-酮丁酸。
高丝氨酸合成途径：此途径目前尚未被研究明确，可能是高丝氨酸依次转化为中间物质O-乙酰高丝氨酸、胱硫醚，最后形成最终产物α-酮丁酸[14]。据报道α-酮丁酸脱羧还原后可生成正丙醇[15]。
ILV基因、支链氨基酸转氨酶基因（BAT1、BAT2）是活性戊醇合成途径中的关键酶基因。同异丁醇途径相似，活性戊醇的上游途径也在线粒体中进行，其中间产物α-酮-3-甲基戊酸由ILV基因催化生成，有研究者发现，过度表达ILV基因可使活性戊醇的产生量与对照菌株相比略有增加[11]。
2.3 异戊醇途径及关键基因
如图3所示，异戊醇既可以通过Ehrlich途径由亮氨酸分解而成，也可以经亮氨酸生物合成途径产生。丙酮酸依次在乙酰乳酸合酶（ILV2基因编码）、乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）、二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）的作用下生成α-酮异戊酸，此部分在线粒体中进行，随后经2-异丙基苹果酸合酶（LEU4基因编码）、异丙基苹果酸异构酶（LEU1基因编码）和2-异丙基苹果酸脱氢酶（LEU2基因编码）作用生成α-酮异己酸（α-ketoisocaproate，KIC）。最后，KIC（由 Ehrlich 途径和亮氨酸从头合成途径而来）在α-酮酸脱羧酶（KDCs）和乙醇脱氢酶（ADHs）的催化下生成异戊醇。
啤酒酵母中异戊醇生成的上游途径（丙酮酸到α-酮异己酸）由乙酰乳酸合成酶（ILV2基因编码）、乙酰羟酸还原酶（ILV5基因编码）、二羟基酸脱水酶（ILV3基因编码）、2-异丙基苹果酸合酶（LEU4或LEU9基因编码）、异丙基苹果酸异构酶（LEU1基因编码）和2-异丙基苹果酸脱氢酶（由LEU2基因编码）共同作用；下游途径（从KIC到异戊醇）由α-酮酸脱羧酶（KDCs）和乙醇脱氢酶（ADHs）催化。YUAN等[16]发现将亮氨酸生物合成途径整合到酵母染色体上后异戊醇稍有提高，继续过度表达OAC1（α-IPM转运体）基因后异戊醇产量有了明显的增强，这表明过表达OAC1基因可以使α-IPM更为有效地运出线粒体膜，从而提高异戊醇的产量。SUNG等[17]研究发现在酿酒酵母中敲除BAT1、BAT2这两个基因并没有导致异戊醇减少，并且在添加L-亮氨酸之前就能检测到异戊醇，表明异戊醇主要是由糖代谢途径生成的。ILV基因负责上游途径中α-酮异戊酸的合成，它的表达将影响到异戊醇的产量。有研究者发现，在酿酒酵母中敲除ILV1基因后可使ILV2、ILV5及ILV3基因的表达水平显著增加，加强了异戊醇生物合成的前体α-酮异戊酸的生物合成，从而引起异戊醇产量的增加，而酵母中LEU1或LEU2基因的敲除减少了α-酮异己酸的生物合成，所以降低了异戊醇的产量[18]。
2.4 苯乙醇途径及关键基因
酵母可以利用芳香族氨基酸作为唯一的氮源，通过Ehrlich途径合成2-苯乙醇（2-phenyl ethanol，2-PE），这是酿酒酵母合成2-PE的主要途径，包括3个步骤。首先是L-苯丙氨酸（L-Phe）在两种氨基酸转氨同功酶（ARO8和ARO9基因编码）的催化下转化成苯丙酮酸，随后苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶（ARO10基因编码）催化下生成苯乙醛。最后苯乙醛还原为2-苯乙醇，5 种醇脱氢酶基因 ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5均能催化这一反应[19]。
苯丙酮酸脱羧酶（ARO10基因编码）、氨基酸转氨酶（ARO8和ARO9基因编码）、锌簇转录激活剂CAT8、DNA结合蛋白MIG1，锌指转录激活子ARO80参与了2-苯乙醇的生物合成，其中，ARO80可以通过与ARO9和ARO10启动子结合位点结合激活ARO9和ARO10基因的表达；LEE等[20]研究发现ARO80和GATA因子在ARO9、ARO10和ARO80基因表达中的相互作用；GATA转录因子Gln3p和Gat1p调控渗透酶基因和分解代谢酶基因的转录，它们不仅能促进底物有效进入细胞，还能通过直接激活ARO9和ARO10来增强芳香转氨酶和苯丙酮酸脱羧酶的活性，因此GAT1与GLN3基因的过表达都可使2-PE合成得到显著加强[21]；一般氨基酸渗透酶基因GAP1负责芳香族氨基酸转运，过表达GAP1可促进底物L-Phe的转运，提高2-PE的产量。CAT8和MIG1是与碳代谢相关的转录因子，WANG等[22]研究发现在敲除MIG1后CAT8表达与2-PE的含量都有了提升，这可能是MIG1参与了CAT8的转录调控，MIG1缺失促进CAT8的表达，CAT8的高效表达又上调了ARO9和ARO10基因的转录水平，进而增强了2-PE的产生。
2.5 高级醇合成下游途径关键酶（KDCs与ADHs）
在酿酒酵母中，由糖代谢或氨基酸分解而来得α-酮酸需经α-酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶先后作用后才能生成高级醇。而酿酒酵母中有5种类似KDC的酶和6种乙醇脱氢酶（ADHs），通常分别由 PDC1、PDC5、PDC6、YDL080C/THI3、YDR380w/ARO10 与 ADH1、ADH2、ADH5、ADH6、ADH7、Sfa1 基因编码。
丙酮酸是酿酒酵母中一个非常重要的化合物，一方面，它可以经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶先后作用生成乙醇，另一方面，它也可以在一系列酶的作用下生成高级醇。丙酮酸脱羧酶（PDC1、PDC5、PDC6基因编码）位于细胞质基质中，主要负责催化丙酮酸的脱羧，所以它们的表达可以决定丙酮酸的流向，进而影响高级醇的生成。ZHANG等[23]研究表明，单敲除PDC1、PDC5、PDC6基因均可提高异丁醇产量，原因是由于敲除PDC基因后，丙酮酸生成乙醇途径受阻，迫使它流向高级醇代谢途径，从而提高了异丁醇产量，敲除PDC6基因的菌株中乙醇含量降低也进一步验证了这点。同时，LI等[24]研究发现PDC5基因的敲除是提高酿酒酵母异丁醇产量的主要因素之一，并且过表达ILV2和ARO10基因的同时敲除PDC5基因可导致异丁醇产量比对照菌株高8倍。李杨等[25]通过过表达ILV2、ILV3、BAT2基因的同时敲除PDC6基因将丙酮酸合成乙醇方向的代谢通量转向合成异丁醇的方向上，使乙醇的产率降低，而异丁醇的产率提高了11.4倍。
类丙酮酸脱羧酶（YDL080C基因编码）与苯丙酮酸脱羧酶（ARO10基因编码）主要负责α-酮酸的脱羧，而此反应在各种高级醇生成中又稍有不同。有研究报道，在异戊醇合成过程中，α-酮异己酸脱羧主要由YDL080C、ARO10基因负责，在缬氨酸分解异戊醇的代谢中，丙酮酸脱羧酶（PDC1、PDC5、PDC6 基因编码）中任意一种同工酶都可以将α-酮异戊酸脱羧成醛，而在活性戊醇的合成中，这5种酶中的任何一种都可以将α-酮-3-甲基戊酸脱羧[26]。苯丙酮酸脱羧酶（ARO10基因编码）是一种具有广泛底物特异性的脱羧酶，其活性依赖于酵母生在长过程中所使用的氮源[27]。当苯丙氨酸为唯一的氮源时，它的转录水平可增加30倍，且足以使苯丙酮酸脱羧[28]。
α-酮酸在脱羧成醛后还需经乙醇脱氢酶作用后才能生成高级醇，SHEN等[29]研究发现，与过表达ARO10基因相比，单独过表达ADH基因对2-PE的产生没有明显的影响。然而，当ADH1、ADH2或ADH5基因与ARO10基因共同表达时可导致2-PE明显增加。同时，KONDO等[30]也指出，当ADHs与来自乳球菌的脱羧酶KIVD在酿酒酵母中共表达时，ADH2和ADH5基因过表达可使异丁醇生产水平稍有增加、SFA1和ADH1基因过表达则对异丁醇的生产没有影响、而ADH6和ADH7基因的过表达可使异丁醇显著增加。
3 低产高级醇菌株的选育方法
啤酒酵母通常是由杂交而来的异源多倍体，不同品种的啤酒酵母由于其生理特性差异，即使采用相同发酵工艺，高级醇产量也大有不同。啤酒中高级醇含量普遍过高，想要将高级醇含量控制在合理范围内，选育低产高级醇的优良酵母菌株是最根本的方法。目前，原生质体融合育种、诱变育种及基因工程育种是菌种选育最常用的方法。
3.1 原生质体融合育种
原生质体融合技术又称细胞融合技术，是指两种不同的亲株用酶法去壁后，得到的原生质体置于高渗溶液中，在一定融合剂的促融作用下使两者相互凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组获得新菌株的育种方法[31]。蔡车国等[32]以发酵度较高的非絮凝性的啤酒酵母菌株和发酵度较低、絮凝性较强的啤酒酵母菌株为亲本进行原生质体融合得到一株需酪素水解物的营养缺陷型菌株。该菌株经优化和原生质体融合后得到一株絮凝性较强且总高级醇含量显著降低的优良菌株。王芬等[33]以紫外线灭活的菌株JW1-1（双乙酰、总高级醇的含量较低，但发酵度较低）原生质体和热灭活的菌株NW7-45（双乙酰、总高级醇的含量较高，发酵度较高）原生质体为亲本进行融合。经筛选得到了发酵度为69.5%，双乙酰，乙醛和总高级醇的含量适中的优良菌株。
3.2 诱变育种
诱变是指采用物理、化学因素诱发机体发生遗传性变异，并经过筛选，鉴定从而获得新品种的方法。紫外诱变、微波诱变、室温常压等离子体（atmospheric room temperture plasma，ARTP）诱变育种是酵母常用的育种方法。SHEN等[34]利用紫外诱变技术，并经长期驯化后获得了产高级醇与酯的比例低于对照菌株的突变株D-A-14。朱莉娜[35]等采用微波诱变技术对啤酒酵母进行诱变处理，经过乳酸培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖-碳酸钙培养基、氯化三苯基四氮唑显色培养基等一系列鉴别培养基初筛后进行啤酒发酵复筛，得到7株高级醇产量降低的菌株。室温常压等离子体（ARTP）是一种新型全细胞诱变工具，其突变率高于紫外辐射或化学诱变剂，且处理温度较低，非常适用于酵母菌株的诱变。王国正等[36]运用常温常压等离子体诱变技术筛选得到了一株高级醇产量降低20%的酿酒酵母菌株ARTP5，并且通过与原始菌株CF4胞内蛋白组差异相比，发现诱变菌株ARTP5的ADH1蛋白表达被下调，这可能是导致ARTP菌株产高级醇降低的原因之一。
3.3 基因工程育种
在过去的几十年里，随着分子学微生物的兴起，基因工程的合理运用已经成为遗传育种首选的方法。所谓的基因工程是指把某种生物的个别基因复制出来，经改造加工后放到另一个生物里面，定向的改变生物的遗传性状，从而获得人们想要的物种的一种技术。为了探究BAT基因表达对酵母风味化合物影响，LILLY等[37]构建了BAT2/BAT1基因缺失突变株，结果发现任何一个基因的缺失都可以使异丁醇、异戊醇产量下降。石钰等[38]运用同源重组技术构建了LEU1基因缺失的菌株，该菌株与出发菌株发酵试验表明，突变株在降低异戊醇含量的同时提升了正丙醇和异丁醇的产量；ZHENG等[39]采用无痕敲除技术在BAT2基因位点过表达ALD6基因而构建了不含任何外源基因和外源 DNA 片段的菌株 （HJΔB-AG、HJΔB-AP 和HJΔB-AC），这些菌株产生的高级醇浓度分别降低了39.91%、45.55%和52.80%，且可以安全地应用于工业生产之中；同时，LI等[40]以I-SCEI内切酶为DNA双键断裂（DNA strand breaks，DSB）诱导剂，采用两步整合技术构建了BAT2缺失和ATF1过表达的菌株。该突变株对高级醇的降低和酯的提高有明显的效果。
4 结论与展望
20世纪初期已有研究者开始研究高级醇，经过100多年的研究，已经在碳源和氮源如何调控高级醇方面取得了不少进展，并且随着基因工程的兴起，高级醇在代谢通路，关键调控因子方面已愈发明朗，该文以啤酒酵母为研究对象，对其高级醇的合成途径、关键调控基因（BAT2、BAT1、BAP2、ILV、LEU、PDC、ARO、ADH、YDL080C）及菌种选育手段进行重点描述，为适当的控制高级醇含量提供指导。
近年来人们主要从菌种的选育和发酵工艺两方面对啤酒中高级醇进行控制，利用基因工程与诱变技术均可获得低产高级醇的菌株，并且基因工程育种已实现了无痕改造，转基因产品中已不包含任何外源基因和DNA片段，克服了不少安全隐患，未来有很好的应用前景，为此，还需继续深入研究基因与代谢通路，使基因工程菌更加广泛的运用于工业生产中。
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