咖啡碱又名 1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，是一种普遍存在于植物中的嘌呤类生物碱物质[1]，多从咖啡果[2]、可可豆[3]、可拉果、茶叶[4]等中提取而得。咖啡碱是一种中枢神经兴奋剂，人们获取咖啡碱的产品包括咖啡、能量饮料、药丸、茶水和苏打水[5]。然而，咖啡碱的使用可能会影响健康状况[6]，有研究表明高剂量地摄入咖啡碱会降低睡眠效率[7]，引起焦虑[8]、头疼、心血管疾病[9]，甚至胎儿畸形[10]、孕期妇女流产[11]、青少年钙流失[12]、运动功能受损[13-15]等不良影响，过度摄入咖啡碱还会影响人体对铁的吸收，从而造成贫血[16]。因此，低咖啡碱制品越来越受到消费者的欢迎。
目前主要的脱除咖啡碱的方法有水脱除法[17]、吸附分离法[18]、溶剂萃取法、超临界CO2萃取法[19]以及微生物法等。但前几种方法耗时费力且咖啡碱降解率不高，还会对环境造成一定程度的污染，而微生物法以安全无毒、降解效率高的优点获得了越来越多学者的青睐。国内外专家经研究发现细菌类的假单胞菌以及真菌类的曲霉菌降解咖啡碱的效果较好，但大多都不能直接应用于食品当中。因此本试验从茶叶基地土壤中筛选纯化出一株具有咖啡碱降解能力的酵母菌株，对其进行鉴定分析，并通过优化降解条件的方式提高其降解咖啡碱的能力，以期获得一株可应用于食品行业的具有脱除咖啡碱能力的菌株。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
本试验中所用的土壤由贵州省毕节市金沙县茶叶种植基地提供；咖啡碱标准品：Sigma公司；MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KH2PO4（均为分析纯）：成都科隆化学品有限公司；YPD培养基：北京奥博星生物技术有限公司。
内转录间隔区序列（internal transcriptional spacer sequence，ITS）测定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 主要仪器与设备
高温高压蒸汽灭菌锅（YXQ-30SI）：上海博讯实业有限公司；高效液相色谱仪（1260InfinityⅡ，配有7890A自动进样气相色谱仪）：安捷伦科技有限公司；恒温培养箱（MJ-250）：上海一恒科学仪器有限公司；光吸收型酶标仪（SPECTRA MAX190）：美国分子仪器公司。
1.3 培养基配方
培养基配制方法如表1所示。
表1 培养基的配制
Table 1 Culture medium
KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，酵母浸出粉 0.2 g/L，咖啡碱5.0 g/L。各组分分开经高温灭菌后混合，再根据需求分装使用YPD液体培养基培养基名称 配制方法富集培养基蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L（固/液）筛选培养基咖啡碱5.0 g/L，YPD液体培养基25.0 g/L，根据需求添加2%的琼脂制成固体培养基降解培养基KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，葡萄糖5.0 g/L，咖啡碱1.0 g/L
1.4 方法
1.4.1 可降解咖啡碱菌株的筛选与鉴定
1.4.1.1 菌株的筛选
以植株根系附近的土壤为媒介，经3次富集培养后，稀释富集液，配成不同浓度的菌悬液。将菌悬液涂布于固体筛选培养基中，30℃恒温条件下培养72 h，选取固体筛选培养基中的单菌落，并经多次平板划线将其分离纯化。
1.4.1.2 菌株的鉴定
通过菌落形态观察、细胞形态记录以及对ITS进行DNA测序，鉴定菌株的种属情况。
1.4.2 生长曲线的测定
取活化后的菌株，以2%（体积分数）的接种量接种至降解培养基中，在30℃，120 r/min的条件下振荡培养4 d，每隔6 h在600 nm下检测菌液浓度。
1.4.3 咖啡碱降解率测定
高效液相色谱条件[20]：色谱柱：Poroshell 120 ECC18（4.6mm×150mm，4μm）；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长285 nm；进样量10 μL；流动相A：0.5%甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脱，洗脱程序如表2所示。
表2 高效液相色谱条件
Table 2 Gradient operation in HPLC
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 95 5 7 90 10 10 82 18 35 50 50 40 95 5 43 95 5
咖啡碱降解率计算方法见公式（1）。
1.4.4 降解条件对咖啡碱降解率的影响
1.4.4.1 单因素试验
将活化后的菌种（活菌数为1×108CFU/mL）培养28 h后，分别以温度（20、24、28、32、37℃），菌种添加量（2%、4%、6%、8%、10%），发酵时间（12 h～72 h，每隔 4 h取样测定），摇床速度（100、120、140、160、180 r/min），咖啡碱添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）为因素设计单因素试验，其它条件分别固定为咖啡碱添加量0.5 mg/mL、菌种添加量4%、摇床速度140 r/min、温度28℃，以咖啡碱降解率为指标探究菌种降解咖啡碱的条件。
1.4.4.2 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选取温度、菌种添加量、发酵时间、咖啡碱添加量4个因素，以咖啡碱降解率为评价指标，对菌种降解咖啡碱的工艺进行优化，因素水平见表3。使用Design Expert 11软件进行数据分析。
表3 响应面试验因素水平
Table 3 Factors and levels of response surface experiments
水平D咖啡碱添加量/（mg/mL）-1 24 4 36 0.5 0 28 6 44 1.0 1 32 8 52 1.5 A温度/℃ B菌种添加量/%C发酵时间/h
2 结果与分析
2.1 可降解咖啡碱菌株的筛选与鉴定
经分离和纯化，得到一株可降解咖啡碱的菌种，命名为Y-1。Y-1菌株在YPD培养基上的形态如图1所示。
图1 Y-1菌形态观察图
Fig.1 Morphological observation of Y-1 bacteria
该菌的单个菌落呈圆形，菌落较大较厚，为乳白色，表面湿润且黏稠，容易被挑起。由图1（B）Y-1菌株在40倍光学显微镜下的细胞形态，可观察到视野中细胞呈圆形或椭圆形，且较大的母体细胞旁有芽体存在。
根据基因序列，使用MEGAX 10.1.8软件构建系统发育树，如图2所示。
图2 Y-1菌株系统发育树
Fig.2 The phylogenetic tree of strain Y-1
结果表明Y-1菌株与Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）同源性最高。经形态学和ITS基因测序与系统发育树构建，可以确定菌株Y-1属于酵母菌属。
2.2 生长状况与降解能力分析
酿酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡碱的降解培养基中生长，生长状况如图3所示。
图3 Y-1菌种在液体筛选培养基中的生长情况
Fig.3 Growth of Y-1 strain in liquid screening medium
酿酒酵母通常在5 h～12 h内就会进入对数生长期快速生长，酿酒酵母Y-1菌株在含有1 mg/mL咖啡碱的降解培养基中迟滞期延长到了22h，说明咖啡碱的存在对酿酒酵母Y-1菌株的生长有抑制作用。在30℃培养22 h后，菌体细胞密度（OD600）迅速上升，开始进入对数生长期，并在42 h时OD600值达到了0.600 2±0.023。
2.3 降解条件对菌种生长和咖啡碱降解率的影响
2.3.1 单因素试验结果
单因素试验结果见图4。
图4 培养条件对咖啡碱降解率的影响
Fig.4 Effects of culture conditions on theine degradation rate
从图4（A）中可知，咖啡碱降解率随时间的增加呈“S形”曲线式增加。在培养的20 h～36 h内，酿酒酵母Y-1菌株迅速代谢咖啡碱，并在第36小时达到了（39.06±2.38）%。36 h后咖啡碱的降解速率趋缓，52 h后咖啡碱降解率趋于稳定，在72 h时咖啡碱降解率为（45.85±1.52）%。
由 4（B）可知，酿酒酵母 Y-1 菌株在 32、28、24 ℃的培养条件下，降解咖啡碱的能力较好。酿酒酵母是兼性厌氧菌，在氧气存在的环境下进行有氧呼吸，大量繁殖，将葡萄糖分解为二氧化碳和水，并产生大量能量；在氧气不足的情况下进行无氧呼吸，产生乙醇、水和少量能量。摇床的速度主要影响的是培养液中氧气的含量。从图4（C）可知，摇床速度对酿酒酵母Y-1菌株利用咖啡碱进行代谢的影响较小，虽然咖啡碱的降解率随摇床速度的增加而增加，但各个速度之间的咖啡碱降解率差别不明显。
由4（D）可知，当菌种添加量为10%时，培养的前20 h内咖啡碱的降解率都高于其它菌种添加量，但在20 h后其降解速率趋于平缓，并逐渐低于其它菌种添加量。产生这种现象的原因可能是由于环境营养有限，大量的酿酒酵母Y-1菌株过快地消耗了营养物质，使得环境内菌株的衰亡期提前到来，最终影响了咖啡碱的降解率。当菌种添加量为6%时，咖啡碱的降解率最高，其次是4%和8%的菌种添加量，因此可选择4%～8%作为较佳的菌种添加量。
由图4（E）可知，当咖啡碱添加量高于2 mg/mL时，酿酒酵母Y-1菌株对咖啡碱的利用率迅速下降，这可能是因为较高浓度的咖啡碱抑制了菌株的生长。酿酒酵母Y-1菌株在咖啡碱添加量为0.5 mg/mL～1.5 mg/mL时降解咖啡碱的能力较好，可以用于脱除茶叶中的咖啡碱。
2.3.2 响应面试验结果
Box-Behnken试验设计结果如表4所示。
表4 Box-Behnken试验设计及结果
Table 4 Results of response surface experiments
试验号A温度/℃B菌种添加量/%Y咖啡碱降解率/%1 28 8 44 1.5 34.2 2 28 8 44 0.5 50.61 3 28 4 52 1.0 44.68 4 32 6 44 0.5 59.74 5 24 8 44 1.0 36.96 6 24 6 52 1.0 45.28 7 28 8 52 1.0 46.77 8 32 6 36 1.0 46.58 9 24 6 36 1.0 37.08 10 28 6 36 1.5 36.69 11 24 6 44 0.5 46.15 12 28 6 44 1.0 46.8 13 28 4 44 0.5 50.62 14 32 6 52 1.0 50.72 15 28 4 36 1.0 38.27 C发酵时间/h D咖啡碱添加量/（mg/mL）
续表4 Box-Behnken试验设计及结果
Continue table 4 Results of response surface experiments
试验号A温度/℃B菌种添加量/%Y咖啡碱降解率/%16 28 4 44 1.5 32.89 17 32 6 44 1.5 36.09 18 28 6 52 0.5 58.76 19 24 4 44 1.0 36.78 20 24 6 44 1.5 34.83 21 28 6 36 0.5 47.88 22 28 6 44 1.0 49.21 23 28 6 44 1.0 47.48 24 32 8 44 1.0 47.48 25 28 8 36 1.0 39.87 26 28 6 44 1.0 47.52 27 28 6 44 1.0 46.79 28 28 6 52 1.0 38.77 29 32 4 44 1.0 42.98 C发酵时间/h D咖啡碱添加量/（mg/mL）
非线性回归二次多项式拟合分析得到咖啡碱降解率与各个因素间的回归方程：Y=47.56+3.88A+0.805 8B+3.22C-8.36D+1.08AB-1.02AC-3.08AD+0.122 5BC+0.330 0BD-2.20CD-2.06A2-4.38B2-0.722 9C2-1.24D2。
方差分析结果见表5。
表5 回归方程方差分析结果
Table 5 Analysis results of regression and variance
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1 352.69 14 96.62 163.09 ＜0.000 1 **A 180.27 1 180.27 304.28 ＜0.000 1 **B 7.79 1 7.79 13.15 0.002 7 **C 124.23 1 124.23 209.69 ＜0.000 1 **D 838.17 1 838.17 1 414.80＜0.000 1 **AB 4.67 1 4.67 7.88 0.014 0 *AC 4.12 1 4.12 6.95 0.019 5 *AD 38.01 1 38.01 64.15 ＜0.000 1 **BC 0.060 0 1 0.060 0 0.101 3 0.755 0 BD 0.435 6 1 0.435 6 0.735 3 0.405 6 CD 19.36 1 19.36 32.68 ＜0.000 1 **A2 27.47 1 27.47 46.37 ＜0.000 1 **B2 124.32 1 124.32 209.85 ＜0.000 1 **C2 3.39 1 3.39 5.72 0.031 3 *D2 9.94 1 9.94 16.78 0.001 1 **残差 8.29 14 0.592 4失拟 4.39 10 0.439 3 0.450 5 0.860 3 不显著误差 3.90 4 0.975 3总和 1 360.97 28 R2 0.993 9 R2 Adj 0.987 8 R2 Pred 0.976 9
由表5可知，该模型回归性极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.860 3＞0.05），说明模型在回归区域内的拟合度较高，实测值与预测值之间的相关性良好。回归方程中的一次项A、B、C、D都极显著，交互项AD、CD以及二次项A2、B2、D2也均达到了极显著水平，这表明各因素对响应值的影响不是呈简单的线性关系的。各因素对酵母菌Y-1降解咖啡碱的影响程度大小顺序为：咖啡碱添加量＞温度＞发酵时间＞菌种添加量。
各因素交互作用对咖啡碱降解率影响的响应面图见图5。
图5 各因素交互作用对咖啡碱降解率影响的响应面图
Fig.5 Response surface plot and contour map showing the interactive effects of two factors on decaffeination rate
采用Design Expert 11软件对数据进行优化预测，选择咖啡碱降解率最大值为排序条件，模型预测出的最优条件为：发酵温度30.673℃、发酵时间46.636 h，咖啡碱添加量0.530 mg/mL、菌种添加量6.906%，此条件下咖啡碱降解率为59.800%。结合试验中实际操作的可能性，将参数调整为：发酵温度31.00℃、发酵时间46.60 h，咖啡碱添加量0.50 mg/mL、菌种添加量6.90%。在修正参数的条件下进行3次平行试验，咖啡碱降解率为（59.39±0.28）%，与预测值相比，相对误差为（1.06±0.28）%。
3 结论
从茶叶种植基地的土壤中分离得到一株可降解咖啡碱的真菌，命名为Y-1，经过对其表型特征分析、ITS测序分析以及系统发育树分析鉴定为酿酒酵母的同源菌。以咖啡碱降解率为指标，通过单因素试验和响应面试验得到最佳培养条件为：发酵温度31.00℃、发酵时间46.60 h，咖啡碱添加量0.50 mg/mL、菌种添加量6.90%。在此条件下，菌株Y-1在培养基中的咖啡碱降解率最高可达（59.39±0.28）%。将其应用于食品行业生产茶酒饮料，可以有效去除产品中的咖啡碱，对低咖啡碱产品的开发具有重要意义。
[1]RÔMULO P Barcelos，FREDERICO D Lima，NELSON R Carvalho，et al.Caffeine effects on Systemic metabolism，oxidative-inflammatory pathways，and on exercise performance[J].Nutrition Research，2020，80:1-17.
[2]TEODULO Salinas Rios，TERESA Sánchez Torres，MARÍA Esther Ortega Cerrilla，et al.Changes in composition，antioxidant content，and antioxidant capacity of coffee pulp during the ensiling process[J].Revista Brasilra de Zootecnia，2014，43(9):492-498.
[3]ALANON M E，CASTLE S M，SISWANTO P J，et al.Assessment of flavanol stereoisomers and caffeine and theobromine content in commercial chocolates[J].Food Chemistry，2016，208:177-184.
[4] MA J Q，JIN J Q，YAO M Z，et al.Quantitative trait loci mapping for theobromine and caffeine contents in tea plant(Camellia Sinensis)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66(50):13321-13327.
[5]SIMONE RODDA，NATALIA BOOTH，JESSICA MCKEAN，et al.Mechanisms for the reduction of caffeine consumption:what，how and why[J].Drug and Alcohol Dependence，2020，212:108024.
[6]TEMPLE JENNIFER L，BERNARD CHRISTOPHE，LIPSHULTZ STEVEN E，et al.The safety of ingested caffeine:A comprehensive review[J].Frontiers in Psychiatry，2017，8:80-96.
[7] LANDOLT H P，DIJK D J，GAUS S E，et al.Caffeine reduces lowfrequency delta activity in the human sleep EEG[J].Neuropsychopharmacology:official publication of the American College of Neuropsychopharmacology，1995，12(3):229-238.
[8]PAULO HENRIQUE S BOTTON，DANIELA POCHMANN，ANDREIA S ROCHA，et al.Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior[J].Physiology and Behavior，2017，170:47-53.
[9]KÖKSAL EDA，YARDIMCI HÜLYA，KOCAADAM BETÜL，et al.Relationship between dietary caffeine intake and blood pressure in adults[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition，2017，68(2):227-233.
[10]JAHANFAR SHAYESTEH，JAAFAR SHARIFAH HALIMAH.Effects of restricted caffeine intake by mother on fetal，neonatal and pregnancy outcomes[J].The Cochrane Database of Systematic Reviews，2015(6):26058966.
[11]JING J Q，QI C，SEAN M WARD，et al.Impacts of caffeine during pregnancy[J].Trends in Endocrinology and Metabolism，2020，31(3):218-227.
[12]WIKOFF DANIELE，WELSH BRIAN T，HENDERSON RAYETTA，et al.Systematic review of the potential adverse effects of caffeine consumption in healthy adults，pregnant women，adolescents，and children[J].Food and Chemical Toxicology，2017，109:585-648.
[13]GERALD C CLAGHORN，ZOE THOMPSON，KRISTIANNA WI，et al.Caffeine stimulates voluntary wheel running in mice without increasing aerobic capacity[J].Physiology and Behavior，2017，170:133-140.
[14]CHRISTOPHER IRWIN，SAMAN KHALESI，BEN DESBROW，et al.Effects of acute caffeine consumption following sleep loss on cognitive，physical，occupational and driving performance:A systematic review and meta-analysis[J].Neuroscience and Biobehavioral Reviews，2020，108:877-888.
[15]TATSUYA YOSHIHARA，MASAYOSHI ZAITSU，FUMIE SHIRAISHI，et al.Influence of genetic polymorphisms and habitual caffeine intake on the changes in blood pressure，pulse rate，and calculation speed after caffeine intake:A prospective，double blind，randomized trial in healthy volunteers[J].Journal of Pharmacological Sciences，2019，139(3):209-214.
[16]BUERGE I J，POIGER T，MÜLLER，et al.Caffeine，an anthropogenic marker for wastewater contamination of surface waters[J].Environmental Science and Technology，2003，37(4):691-700.
[17]LIANG H，LIANG Y，DONG J，et al.Decaffeination of fresh green tea leaf(Camellia sinensis)by hot water treatment[J].Food Chemistry，2006，101(4):1451-1456.
[18]SAKANAKA SENJI.A novel convenient process to obtain a raw decaffeinated tea polyphenol fraction using a lignocellulose column[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(10):3140-3143.
[19]MICHELI NOLASCO ARAÚJO，ANA QUEREN PALADONAI LEANDRO AZEVEDO，FABIANE HAMERSKI，et al.Enhanced extraction of spent coffee grounds oil using high-pressure CO2plus ethanol solvents[J].Industrial Crops and Products，2019，141:111723.
[20]李莎莎，于娟，谭淑瑜，等.HPLC法测定不同产地咖啡中咖啡因、咖啡酸及绿原酸的含量[J].江西中医药大学学报，2017，29(1):90-93.