黑木耳（Auricularia auricular）又称云耳、木菌，属真菌门、担子菌纲、木耳科、木耳属，性平、味甘，是著名的药食两用真菌[1]，素有“菌中之冠”之称。黑木耳多糖是黑木耳中含有的一种生物活性成分，研究表明其具有抑制肿瘤[2]、调节免疫力[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、调节血糖[7]、延缓衰老[8]、抗突变[9]、抗炎[10]、抗菌[11]等功效，在食品和保健医药领域应用广泛。
目前，黑木耳多糖提取方法有热水浸提法、稀碱浸提法、酶法、微波辅助法、超声波辅助法和超微粉碎法等[12-17]，传统的提取方法存在着提取率低、提取时间长、能耗大等缺点[18]。半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）是一种新的提取技术，它是基于“灰思维”方式，模拟人体胃肠环境，在一定的酸、碱度溶液中依次连续提取，从生物药剂学角度，以模拟给药的方式建立的一种提取技术[19-22]。超声波辅助提取是利用超声的空化效应、热效应和机械振动等作用，加速提取的进行[23]。目前超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的研究还未见报道。因此，本文以黑木耳为主要原料，采用超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，通过正交试验对其工艺进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑木耳：市售；葡萄糖、柠檬酸、盐酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、氢氧化钠、硫酸、苯酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
RE-2000B旋转蒸发仪：济南鑫贝西生物技术有限公司；BAS124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TDL-50B台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-2450紫外-可见分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；HH-M4电热恒温水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；PHS-3C酸度计：上海雷磁仪器厂；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖
根据半仿生法的原理，在模拟人体胃肠道环境的pH值分别为1.4、7.5和8.3的条件下，准确称取经烘干、粉碎后的黑木耳粉样品10 g，分别在上述pH值的溶液中，协同超声波法（一定的料液比、超声功率、超声时间、超声温度）各提取1次，3次提取液合并后在5 000 r/min条件下离心10 min，然后将上清液减压浓缩，浓缩液加3倍体积95%的乙醇后，在4℃冰箱中静置24 h，然后在5 000 r/min条件下离心10 min，沉淀物经真空干燥得到黑木耳粗多糖。
1.3.2 黑木耳多糖的测定
采用苯酚-硫酸法[24]进行测定。
1.3.3 黑木耳多糖提取率的计算
黑木耳多糖提取率根据下列公式计算[25-26]。
式中：c为由标准曲线计算得到的多糖质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；m为黑木耳干粉质量，g。
1.3.4 单因素试验设计
准确称取10 g黑木耳粉5份，在模拟人体胃肠道环境的pH值分别为1.4、7.5、8.3的条件下，按1.3.1的方法进行超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，考察不同因素对黑木耳多糖提取率的影响。在固定其中3个因素水平的条件下，对余下1个因素设计5个不同水平的试验，固定条件为：料液比 1∶30（g/mL），超声功率400 W，超声温度60℃，超声时间50 min。分别选取料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），超声功率 100、200、300、400、500 W，超声温度30、40、50、60、70 ℃，超声时间 30、40、50、60、70 min 进行单因素试验。
1.3.5 正交试验
在上述单因素试验的基础上，选取表1中所列的4个因素，采用L9（34）正交试验对黑木耳多糖的提取工艺进行优化。试验水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design
水平D超声时间/min 1 1∶20 300 50 40 2 1∶30 400 60 50 3 1∶40 500 70 60因素A料液比/（g/mL）B超声功率/W C超声温度/℃
1.4 数据处理
采用Office进行作图，正交设计助手ⅡV3.1专业版进行正交试验数据分析和方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验研究
2.1.1 料液比对提取率的影响
料液比对多糖提取率的影响见图1。
图1 料液比对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate
由图1可知，黑木耳多糖提取率随着溶剂量的增加逐渐升高，当料液比达到1∶30（g/mL），再继续增大溶剂的量，多糖提取率变化趋缓。这可能是因为，增加溶剂的量，黑木耳细胞内外的浓度差增大，传质速率就会加快，提取率升高；但当溶剂达到一定量时，溶质溶出基本完全，再继续增加用量，提取率也不再明显升高而是趋于稳定。故取料液比1∶30（g/mL）为佳。
2.1.2 超声功率对多糖提取率的影响
超声功率对多糖提取率的影响见图2。
图2 超声功率对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate
由图2可知，多糖提取率随着超声功率的增加呈现先升高后降低的趋势，在超声功率400 W时，多糖提取率达到最大，再继续增加超声功率，提取率反而降低。这可能是因为，增加超声功率，促使超声波的超声和机械效应增强，超声波对黑木耳细胞破壁程度增强，多糖溶出增多，提取率升高；当超声功率大于400 W后，超声波在其声源附近，会产生大量的空化气泡，形成空化屏蔽的环境，导致空化泡不能充分崩解，提取率降低。故取超声功率400 W为佳。
2.1.3 超声温度对多糖提取率的影响
超声温度对多糖提取率的影响见图3。
图3 超声温度对提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate
由图3可知，多糖提取率随着超声温度的升高呈现先升高再降低的趋势，在超声温度为60℃时，多糖提取率达到最高，再继续提高超声温度，提取率反而降低。这可能是因为，增加超声温度，溶剂扩散速度加快，多糖溶出增多，提取率升高，当温度大于60℃后，再继续升高温度，多糖会发生降解，提取率降低。故取超声温度60℃为佳。
2.1.4 超声时间对多糖提取率的影响
超声时间对多糖提取率的影响见图4。
图4 超声时间对提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate
由图4可知，多糖提取率随着超声时间的延长而逐渐升高，当超声时间达到40 min后，再继续延长超声时间，多糖提取率也不会明显升高而是趋于稳定。这可能是因为，增加超声时间，黑木耳细胞破碎程度和数量增加，多糖溶出增多，提取率升高，当超声时间超过40 min后，多糖已溶出完全，不会再明显变化。故取超声时间40 min为佳。
2.2 超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的工艺正交优化研究
正交试验结果见表2。方差分析见表3。
表2 正交试验结果
Table 2 The result of orthogonal experimental design
试验序号D超声时间/min 1 1∶20 300 50 40 18.42 2 1∶20 400 60 50 19.53 3 1∶20 500 70 60 19.82 4 1∶30 300 60 60 22.41 5 1∶30 400 70 40 22.46 6 1∶30 500 50 50 21.94 7 1∶40 300 70 50 20.12 8 1∶40 400 70 60 19.79 9 1∶40 500 60 40 20.61 k1 19.257 20.317 20.050 20.497 k2 22.270 20.593 20.850 20.530 k3 20.173 20.790 20.800 20.673 R 3.013 0.473 0.800 0.176 A料液比/（g/mL）B超声功率/W因素 黑木耳多糖提取率/%C超声温度/℃
表3 方差分析结果
Table 3 The variance analysis results
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A 14.316 2 270.113 19.000 *B 0.339 2 6.396 19.000 C 1.205 2 22.736 19.000 *D 0.053 2 1.000 19.000误差 0.05 2
由表2、表3的数据分析可知，4个因素的影响主次顺序为：A＞C＞B＞D，得出最优组合为 A2B3C2D3。料液比和超声温度对黑木耳多糖提取率的影响达到了显著水平，其它不显著。通过R值分析，超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工艺参数为：A2B3C2D3。该最优组合与正交试验表2中的较优组合A2B2C3D1不一致，故需进行验证试验，重复试验3次，取其平均值，其结果见表4。
表4 正交试验验证结果
Table 4 The result of orthogonal experimental verifies
黑木耳多糖提取率/%最优组合（A2B3C2D3）组合 A料液比/（g/mL）B超声功率/W C超声温度/℃D超声时间/min 1∶30 500 60 60 22.52较优组合（A2B2C3D1）1∶30 400 70 40 22.47
由表4可知，最终超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工艺组合为：A2B3C2D3，即料液比 1∶30（g/mL），提取温度60℃，超声功率500 W，超声时间60 min。在此最优组合条件下，得到黑木耳多糖提取率为22.52%（3次平均值）。
3 结论
本试验采用超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，经正交试验优化，最佳工艺参数为：料液比1∶30（g/mL），提取温度60℃，超声功率500 W，超声时间60 min，在此条件下，黑木耳多糖提取率为22.52%，本试验为黑木耳多糖的提取提供一种新的方法。
[1] LI Ling，DING Junnan.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular[J].Forestry Research，2005，16(1):61-64.
[2]SONG Guanglei，DU Qizhen.Isolation of a polysaccharide with anticancer activity from Auricularia polytricha using high-speed countercurrent chromatography with an aqueous two-phase system[J].Journal of Chromatogra-phy A，2010，1217(38):5930-5934.
[3] 郑林用，何希德，何权，等.毛木耳对小鼠免疫功能的影响研究[J].中国食用菌，2010，29(5):43-45.
[4] 夏尔宁，陈琼华.黑木耳多糖的生物活性[J].中国药科大学学报，1989，20(4):227.
[5] 沈丛微，罗霞，江南，等.毛木耳多糖的药理研究进展[J].安徽农业科学，2011，39(22):13407-13408，13411.
[6]SUN Yong xu，LI Tian bao，LIU Ji cheng.Structural characterization and hydroxyl radicals scavenging capacity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Auricularia polytricha[J].Carbohydrate Polymers，2010，80(2)：377-380.
[7] 薛惟建，王淑如，陈琼华.银耳及银耳孢子多糖及黑木耳多糖的抗溃疡作用等[J].中国药科大学学报，1987，18(1):45.
[8] 申建和，陈琼华.木耳多糖、银耳多糖和银耳孢子多糖的降血脂作用[J].中国药科大学学报，1989，20(6):344.
[9] 薛惟建，鞠彪，王淑如，等.银耳多糖和木耳多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖的防治作用[J].中国药科大学学报，1989，19(4):42.
[10]陈依军，夏尔宁，王淑如，等.黑木耳、银耳及银耳孢子多糖延缓衰老作用[J].中国现代应用药学，1989，6(2):470-472.
[11]刘波.中国药用真菌[M].太原：山西人民出版社，1978：576.
[12]林敏，吴冬青，李彩霞.黑木耳多糖提取条件的研究[J].河西学院学报，2004，20(5):87-89.
[13]包海花，高雪玲，祖国美.一种改良的黑木耳多糖提取方法[J]中国林副特产，2005(4):29-29.
[14]姜红，孙宏鑫，李晶，等.酶法提取黑木耳多糖[J].食品与发酵工业，2005，31(6):131-133.
[15]王雪，王振宇.响应面法优化超声波辅助提取黑木耳多糖的工艺研究[J].中国林副特产，2009(3):1-5.
[16]张钟，高智谋.微波辅助野生黑木耳多糖的提取工艺条件优化[J].包装与食品机械，2006，24(2):7-10.
[17]杨春瑜，薛海晶.超微粉碎对黑木耳多糖提取率的影响[J].食品研究与开发，2007，28(7):34-38.
[18]SHAM P W Y，SCAMAN C H，DURANCE T D.Texture of vacuum microwave dehydrated apple ch-ips as affected by calcium pretreatment，vacuum level，and apple variety[J].Journal of Food Scien-ence，2001，66(9):1341-1347.
[19]孙秀梅，张兆旺.建立中药用“半仿生提取”研究的技术平台[J].中成药，2006，28(4)：614-616.
[20]张兆旺，孙秀梅.关于中药药剂现代化的沉思[J].中成药，2001，23(11):843-846.
[21]张瑞亭，张兆旺，孙秀梅.思维方式的转换与中药“半仿生”提取法[J].中国中药杂志，1997，22(9):542-544.
[22]张兆旺，孙秀梅.半仿生提取法的特点与应用[J].世界科学技术：中医药现代化，2000，2(1)：35-38.
[23]LETICIA X，LOPEZ Martinez，ROSA M，et al.Antioxidant activity，phenolic compounds and anthocyanins content of eighteen strains of mexican maize[J].Food Science and Technology，2009，42(6):1187-1192.
[24]池源，王丽波.苯酚-硫酸法测定南瓜籽多糖含量的条件优化[J].食品与机械，2014，30(1):89-92.
[25]BAO Hongkun，SUN Lijuan，ZHU Ying，et al.Lentinan produces a robust antidepressant-like effect viaenhancing the prefrontal Dectin1/AMPA receptor signaling pathway[J].Behavioural Brain Research，2017，317(15):263-271.
[26]罗其昌，崔春，李文治.提取温度对香菇多糖理化性质和免疫活性的影响[J].现代食品科技，2017，33(11):23-30.