芥菜[Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.]是我国常见的一种特产蔬菜，十字花科，芸苔属一年生或二年生草本植物，分布于我国秦岭淮河以南的大部分地区[1]。芥菜营养丰富，含有维生素、胡萝卜素、膳食纤维、黄酮等多种天然营养与保健成分，具有利膈开胃、通肺、明耳目、抗癌、抑菌等多种生理功能[2-3]，其中黄酮是一类广泛存在于植物体中，并具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等特殊功能的天然高分子化合物，已广泛应用于食品、化妆品和医药等领域中[4-5]。
食用油脂在外界条件如酶、氧、热、光、微生物等的作用下会发生氧化而酸败变质，变质后的油脂会导致含油脂食品感官和营养品质的恶化[6-7]。为防止油脂的酸败，提高油脂食品的食用安全，延长其货架期，添加抗氧化剂是最有效的手段，而合成的抗氧化剂对人体存在一定的危害[8]，寻找高效、无毒的天然抗氧化剂来取代合成抗氧化剂具有极其重要的现实意义[9]。黄酮类化合物有延缓油脂脂质过氧化的作用，林国荣等[10]对柿叶黄酮进行提取与纯化，研究了柿叶黄酮的脂质抗氧化能力，结果表明柿叶黄酮对大豆油和猪油均有一定的抗氧化作用，且抗氧化作用强于维生素C。超声波辅助提取法是一项新型的天然产物辅助溶剂提取技术，能大大提高有效成分的提取率，同时具有耗时短、操作简便、有效成分损失少等优点，具有良好的应用前景[11]。为提高芥菜总黄酮的开发利用率，本文以芥菜为原料，采用超声波辅助提取法，对影响芥菜总黄酮提取率的工艺因素进行Box-Behnken设计与响应面优化，并评价了芥菜总黄酮的抗脂质氧化作用，为芥菜总黄酮的提取与应用于提高油脂产品的货架期提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
芥菜：市售；芦丁（标准品＞98%）：上海金穗生物科技有限公司；乙醇（食品级）：河南鑫河阳酒精有限公司。
KQ-100TDE型高频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；DHG-9030A型鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；TP-114型电子天平：丹佛仪器（北京）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 芥菜总黄酮的提取工艺
芥菜—洗净—烘干—粉碎—过筛—提取—过滤—浓缩—定容—芥菜总黄酮提取液
用蒸馏水将新鲜芥菜洗净，滤水，后置于50℃鼓风干燥箱中干燥，后粉碎，过80目筛，备用。用电子天平准确称取1.000 0 g备用的芥菜粉末于100 mL的圆底烧瓶中，加入一定体积和一定浓度的乙醇并装上冷凝管，后置于一定温度的超声波清洗器上进行超声回流提取一定的时间，结束后，将芥菜渣过滤，滤液进行浓缩，定容，计算芥菜总黄酮的提取率。
1.2.2 芥菜总黄酮的测定
1.2.2.1 标准曲线的测定
将芦丁标准品用乙醇溶解，并配制成一定质量浓度的芦丁母液，取芦丁母液配制成一系列质量浓度梯度的芦丁标准溶液，参照文献[12]方法加入一系列试剂进行显色，并在510 nm处测定吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线拟合得回归方程 y=9.930 7x-0.005 5，R2=0.999 4。
1.2.2.2 芥菜总黄酮提取率的测定
用移液枪准确吸取一定量体积的芥菜提取液，并按照1.2.2.1方法进行吸光度测定，通过回归方程计算得芥菜总黄酮的质量浓度，换算为芥菜总黄酮的提取率。
式中：b为总黄酮质量浓度，mg/L；V为提取液体积，L；m 为芥菜的质量，g。
1.2.3 单因素试验
除变量外固定其他工艺条件 [超声时间、液料比、乙醇浓度和超声温度为 25 min、30∶1（mL/g）、75%和70℃]不变的情况下，分别考察超声时间（10、15、20、25、30、35 min）、液料比 [15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g）]、乙醇浓度（60%、65%、70%、75%、80%和85%）、超声温度（55、60、65、70、75、80℃）对芥菜总黄酮提取率的影响。
1.2.4 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，以芥菜总黄酮提取率为响应值，进一步对所考察的超声时间（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）和超声温度（D）4个因素进行Box-Behnken试验设计，分别以-1、0、1对各因素的3个水平进行编码，见表1。
表1 响应面试验设计
Table 1 Experimental design of response surface
水平 A超声时间/min D超声温度/℃-1 20 25∶1 70 65 0 25 30∶1 75 70 1 30 35∶1 80 75 B液料比/（mL/g）C乙醇浓度/%
1.2.5 芥菜总黄酮的脂质抗氧化活性
1.2.5.1 芥菜总黄酮对大豆油的抗氧化活性
在6个小烧杯中分别加入50 g大豆油，依次加入0.00%、0.01%、0.02%、0.03%和 0.04%（以大豆油质量为基准）的芥菜总黄酮和0.02%的维生素C（使用时用75%乙醇将芥菜总黄酮和维生素C配制成50 g/L的溶液），置于（60±1）℃的恒温烘箱中，每隔1 d取样，并按GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》方法对油脂过氧化值（peroxide value，POV）进行测定。
1.2.5.2 芥菜总黄酮对猪油的抗氧化活性
在6个小烧杯中分别加入50 g猪油，依次加入0.00%、0.02%、0.04%、0.08%和0.1%（以猪油质量为基准）的芥菜总黄酮和0.04%的VC，置于（60±1）℃的恒温烘箱中，在试验第 0、2、4、7、10、15 天分别取样，测定油脂的过氧化值。
1.3 数据处理
采用Excel 2007、Origin 7.50和Design-Expert8.05b进行数据统计、制图、响应面设计及方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 超声时间对芥菜总黄酮提取率的影响
超声时间对总黄酮提取率的影响见图1。
图1 超声时间对总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effects of ultrasound time on the extraction yield of total flavonoids
从图1中可知，随着超声时间的延长，芥菜总黄酮提取率不断增大，在超声时间为25 min时达到最大，继续延长超声时间，总黄酮提取率反而下降，这是因为当超声时间较短时，芥菜颗粒与溶剂接触时间较短，部分黄酮类物质还没来得及溶出，总黄酮提取率较低，但超声时间过长时，部分稳定性较差的黄酮类分子在长时间的空化与热作用下会发生降解[13]，使得总黄酮的提取率反而降低。因此最佳超声时间选择为25 min。
2.1.2 液料比对芥菜总黄酮提取率的影响
液料比对总黄酮提取率的影响见图2。
图2 液料比对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effects of liquid-to-material ratio on the extraction yield of total flavonoids
从图2中可知，随着溶剂增多，芥菜总黄酮提取率不断增大，在液料比为 30∶1（mL/g）时达到最大，继续增大液料比，总黄酮提取率反而下降，这是因为当溶剂较少时，芥菜颗粒无法被溶剂充分浸润，总黄酮提取率较低，但溶剂增多时，后续浓缩过程会增加总黄酮的损失[14]，使得总黄酮的提取率反而降低。因此最佳液料比选择为 30∶1（mL/g）。
2.1.3 乙醇浓度对芥菜总黄酮提取率的影响
乙醇浓度对总黄酮提取率的影响见图3。
图3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids
从图3中可知，随着乙醇浓度的增大，芥菜总黄酮提取率不断增大，在乙醇浓度为75%时达到最大，继续增大乙醇浓度，总黄酮提取率反而下降，这是因为当乙醇浓度较低时，提取系统极性较大，部分极性较小的黄酮类物质无法溶出，总黄酮提取率较低，但乙醇浓度太高时，芥菜颗粒中一些极性较小的脂溶、醇溶性杂质也一并溶出，并与总黄酮产生溶出竞争[15]，使得总黄酮的提取率反而降低。因此最佳乙醇浓度选择为75%。
2.1.4 超声温度对芥菜总黄酮提取率的影响
超声温度对总黄酮提取率的影响见图4。
图4 超声温度对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids
从图4中可知，随着超声温度的升高，芥菜总黄酮提取率不断增大，在超声温度为70℃时达到最大，继续升高超声温度，总黄酮提取率反而下降，这是因为当超声温度较低时，提取系统的分子热运动较小，乙醇溶液与芥菜颗粒内物质的接触与碰撞频率较小，总黄酮提取率较低，但超声温度过高时，总黄酮中部分耐热性较差的分子会发生氧化或断裂[16]，使得总黄酮的提取率反而降低。因此最佳超声温度选择为70℃。
2.2 响应面工艺优化
2.2.1 响应面试验及分析方案
根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.05b软件对所考察的超声时间、液料比、乙醇浓度和超声温度进行Box-Behnken试验设计，结果见表2，方差及显著性检验见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface methodology
试验号ABCD提取率/（mg/g）1 1 0 1 0 25.36 2 0 1 -1 0 22.18 3 1 0 -1 0 23.75 4 0 0 1 -1 23.07 5 1 0 0 1 22.57 6 0 0 0 0 25.41 7 0 -1 -1 0 22.81 8 1 0 0 -1 22.49 9 0 -1 1 0 24.92 10 1 -1 0 0 24.54 11 -1 0 0 -1 20.31 12 0 0 1 1 24.11 13 -1 -1 0 0 22.29 14 -1 1 0 0 24.57 15 0 0 0 0 26.28 16 0 -1 0 -1 21.43 17 -1 0 1 0 24.84 18 0 0 0 0 27.29 19 0 0 -1 1 25.33 20 0 1 0 -1 20.13 21 0 -1 0 1 23.49 22 1 1 0 0 23.47 23 0 1 1 0 23.31 24 0 0 0 0 26.93 25 0 0 0 0 27.64 26 0 1 0 1 24.15 27 -1 0 0 1 24.65 28 0 0 -1 -1 20.12 29 -1 0 -1 0 22.88
表3 方差及显著性检验
Table 3 Variance and significance test
注：* 表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
方差来源 离差平方和 度 均方 F值 P值 显著性模型 103.39 14 7.39 14.74 ＜0.000 1 **A 0.58 1 0.58 1.16 0.299 8 B 0.23 1 0.23 0.46 0.506 9 C 6.08 1 6.08 12.13 0.003 7 **D 23.38 1 23.38 46.67 ＜0.000 1 **AB 2.81 1 2.81 5.60 0.032 9 *AC 0.031 1 0.031 0.061 0.808 3 AD 4.54 1 4.54 9.06 0.009 4 **BC 0.24 1 0.24 0.48 0.500 1 BD 0.96 1 0.96 1.92 0.187 8 CD 4.35 1 4.35 8.68 0.010 6 *A2 11.63 1 11.63 23.21 0.000 3 **B2 23.23 1 23.23 46.38 ＜0.000 1 **C2 9.63 1 9.63 19.23 0.000 6 **D2 42.93 1 42.93 85.69 ＜0.000 1 **残差 7.01 14 0.50失拟度 3.89 10 0.39 0.50 0.830 8绝对误差 3.12 4 0.78总离差 110.41 28自由
利用Design-Expert 8.05b软件对表2中的Box-Behnken试验设计结果进行分析，得到芥菜总黄酮提取率（Y）与所考察的提取工艺之间的二次多项式回归模型为：芥菜总黄酮提取率Y=26.71+0.22A-0.14B+0.71C+1.40D-0.84AB-0.088AC-1.06AD-0.25BC+0.49BD-1.04CD-1.34A2-1.89B2-1.22C2-2.57D2。
由表3的方差及显著性检验分析可以看出回归模型P＜0.000 1，说明该回归模型差异极显著；失拟度P=0.830 8＞0.05，不显著，说明该回归模型的预测值与试验真实值之间的误差小，拟合度较好；决定系数R2=0.936 5，说明该回归模型具有较好的拟合度与可靠性，有超过93.65%的试验真实值可以该回归模型来预测与描述；根据F值及P值的大小分析，可以得到所考察的工艺条件对芥菜总黄酮提取率的影响顺序为：D超声温度＞C乙醇浓度＞A超声时间＞B液料比。其中对芥菜总黄酮影响极显著（P＜0.01）的有一次项：乙醇浓度C、超声温度D、二次交互项：超声时间与超声温度交互项AD；二次项：超声时间A2、液料比B2、乙醇浓度C2、超声温度 D2；影响显著（0.01＜P＜0.05）的有二次交互项：超声时间与液料比AB、乙醇浓度与超声温度CD；影响不显著（P＞0.05）的有一次项：超声时间 A、液料比B、二次交互项：超声时间与乙醇浓度AC、液料比与乙醇浓度BC、液料比与超声温度BD。说明所考察的超声时间A、液料比B、乙醇浓度C和超声温度D与芥菜总黄酮提取率Y之间不是简单的线性关系。综上所述，该回归模型误差小，具有较高的拟合度和可靠性，可以用于芥菜总黄酮提取工艺的分析与预测。
2.2.2 因素交互作用分析
为进一步分析所考察的超声时间、液料比、乙醇浓度和超声温度对芥菜总黄酮提取率的影响，固定所考察因素中的任意两个因素，绘制出另两个因素交互作用的响应面和等高线图，如图5所示。
图5 各工艺因素交互作用对总黄酮提取率的影响
Fig.5 Effect of interaction of various factors on the yield of total flavonoids
从响应面和等高线图中可直观的看出所考察的各工艺因素间交互作用，直观反映工艺条件对响应值的影响。响应面的曲面坡度和等高线疏密程度可以反映工艺条件间交互作用的显著强度，响应面曲面的坡度越陡，即倾斜度越高，等高线形状越趋向椭圆，等高线密度越大，说明两自变量之间的交互作用显著。对图5中的响应面和等高线图进行分析可知，响应面曲面倾斜度最大，等高线密度最大的是超声时间与超声温度交互作用图，说明超声时间与超声温度的交互作用对芥菜总黄酮提取率的影响最显著；依次分析响应面曲面倾斜度和等高线密度可得各工艺因素间交互作用对芥菜总黄酮提取率的影响显著顺序依次为AD、CD、AB、BD、BC、AC。
2.2.3 最佳工艺及模型验证
利用Design Expert 8.0.5b软件对所得的二次多项式回归模型进一步分析，得到芥菜总黄酮的最佳工艺条件为：超声时间 24.94 min，液料比 29.91 ∶1（mL/g），乙醇浓度75.97%和超声温度71.16℃，在该提取工艺条件下，芥菜总黄酮提取率的预测值为26.94 mg/g，从试验操作的便利性考虑，将提取工艺修正为超声时间25 min，液料比 30∶1（mL/g），乙醇浓度 76%和超声温度71℃。根据修正后的工艺进行3次验证试验，测得芥菜总黄酮的提取率为26.82 mg/g，与最佳工艺的预测值（26.94 mg/g）相比，其相对误差为0.45%，说明该二次多项式回归模型准确率高、可靠性强，可用于芥菜总黄酮提取工艺的优化与预测。
2.3 芥菜总黄酮的脂质抗氧化活性
2.3.1 芥菜总黄酮对大豆油的抗氧化性能
维生素C和总黄酮对大豆油的抗氧化性能见图6。
图6 维生素C和总黄酮对大豆油的抗氧化性能
Fig.6 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on soybean oil
从图6中可知，在所考察的浓度范围内，芥菜总黄酮对大豆油的抗氧化作用均有一定的效果，且随着时间的延长，加入不同含量芥菜总黄酮的大豆油过氧化值（peroxide value，POV）值均增大，但均小于空白对照值，说明芥菜总黄酮对大豆油有一定作用，能起到抗氧化效果，且随着总黄酮含量的增大，大豆油的POV值逐渐减小，说明总黄酮含量越高，对大豆油的抗氧化效果越好，当总黄酮含量为0.03%时，对大豆油的抗氧化效果超过0.02%的维生素C。
2.3.2 芥菜总黄酮对猪油抗氧化性能
维生素C和总黄酮对猪油的抗氧化性能见图7。
图7 维生素C和总黄酮对猪油的抗氧化性能
Fig.7 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on lard
从图7中可知，在所考察的浓度范围内，芥菜总黄酮对猪油的抗氧化作用均有一定的效果，且随着时间的延长，加入不同含量芥菜总黄酮的猪油POV均增大，但均小于空白对照值，说明芥菜总黄酮对猪油有一定作用，能起到抗氧化效果，且随着总黄酮含量的增大，猪油的POV值逐渐减小，说明总黄酮含量越高，对猪油的抗氧化效果越好，当总黄酮含量为0.08%时，对猪油的抗氧化效果超过0.04%的维生素C。综上分析芥菜总黄酮具有一定的脂质抗氧化性能，并与抗氧化活性呈现出量效关系，可作为添加剂添加到油脂产品中，以提高产品的货架期。
3 结论
以芥菜为原料，在单因素试验的基础上结合响应面实验设计得到芥菜总黄酮提取率与超声时间、液料比、乙醇浓度和超声温度的二次多项式回归模型，经验证，该回归模型拟合度好，误差小，准确率高，能较好地对芥菜总黄酮的提取进行分析与预测。芥菜总黄酮的最佳提取工艺条件为超声时间25min，液料比30∶1（mL/g），乙醇浓度76%、超声温度71℃，实际总黄酮提取率为26.82 mg/g，与理论预测值26.94 mg/g的相对误差为0.45%，说明二次回归模型拟合度好，误差小，准确率高，适用于芥菜总黄酮提取工艺的优化。芥菜总黄酮对大豆油和猪油的抗氧化能力表明芥菜总黄酮具有一定的脂质抗氧化能力，与抗氧化活性呈现出量效关系，可作为添加剂添加到油脂产品中，以提高产品的货架期。
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