植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物[1]。谷类、豆类、水果、茶、蔬菜、巧克力是人们获取多酚的主要膳食来源[2]。由于多酚化学结构中存在芳香族环和羟基，是一种天然的抗氧化剂，能够保护植物免受氧化胁迫伤害[3]。许多研究已表明植物多酚拥有多种有益生物活性，例如抗炎、保护心脏、平喘、抗癌、抗菌、调节肠道菌群等[4-7]。由于天然抗氧化剂能改善自由基引起的氧化损伤，且比合成抗氧化剂更安全，因此植物多酚受到了人们广泛的关注[8]。
枣（Zizyphus jujuba）原产于中国，距今已有4 000多年的历史，广泛分布于亚洲、欧洲和美洲，是一种极佳的健康食品[9]。中医认为枣具有缓解心悸、失眠、贫血、脾虚腹泻、食欲不振、肝毒性、发热等功效[10]。CHENG等[11]研究发现枣皮多酚可以预防异氧所致大鼠心肌缺血和铝致氧化损伤。张兆英等[12]比较了不同方法提取金丝小枣多酚，发现快速溶剂萃取法提取率高于有机溶剂浸提法且用时更少。FU等[13]对62种水果抗氧化活性的研究表明，红枣富含酚类物质，可改善自由基引起的疾病，是一种极佳的天然抗氧化食品。圆铃1号是山东省果树研究所20世纪90年代从圆铃大枣中选出的优良品系，有产量高、不裂果、耐储藏的特点[14]。但目前加工利用率较低，以制干为主。为充分利用红枣资源，进一步提高其经济价值。本试验以圆铃1号枣为试验材料，优化其多酚的提取工艺，并测定酚酸组成、评价其体外抗氧化能力。旨在提高圆铃1号枣的经济价值，并为开发安全、高效的多酚抗氧化剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
枣：圆铃1号，采摘于山东德州乐陵百枣园，选取新鲜无损伤的圆铃1号除去果核，切片冻干，粉碎，过40目筛，收集样品置于-18℃冰柜密封备用。
1.1.2 试剂
DPPH：上海华蓝化学科技有限公司；水溶性维生素 E（Trolox）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）：上海麦克林生化科技有限公司；ABTS：合肥博美生物科技有限公司；（+）-儿茶素、绿原酸、咖啡酸、香豆素、芦丁、肉桂酸标准品：上海源叶生物科技有限公司；福林酚：Solarbio公司；没食子酸标准品：天津市百世化工有限公司，以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
R-3旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；LC-20A液相色谱仪、InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本岛津公司；754N紫外可见分光光度计：上海奥普勒仪器有限公司；KQ2200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TG16台式高速离心机：英泰仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 多酚含量测定
1.3.1.1 标准曲线的绘制
采用福林-酚比色法[15]测定多酚含量。精确称取10 mg没食子酸标准品，用60%乙醇溶解定容至50 mL容量瓶中，制得200 μg/mL的没食子酸标准溶液。精确吸取标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 具塞比色管中，加入0.5 mL福林-酚试剂（1∶2体积比稀释），振荡均匀，在 3 min～6 min内，加入 2.5 mL 10%的Na2CO3，用双蒸水定容，在黑暗处反应60 min后，检测波长765 nm。求得没食子酸标准曲线方程为：Y=9.552 9X+0.023 9，相关系数 r=0.998 1。
1.3.1.2 多酚含量测定
精密称取1.000 g冻干的圆铃1号枣粉末在50 mL具塞离心管中，在不同的乙醇体积分数、提取时间、提取温度和料液比下进行超声辅助提取，离心，残渣重提一次，合并2次提取液，用双蒸水定容至100 mL容量瓶中。吸取0.5 mL多酚样液于10 mL具塞比色管中，加入 0.5 mL福林-酚试剂（1∶2体积比稀释），振荡均匀，在 3 min～6 min内，加入 2.5 mL 10%的 Na2CO3，用双蒸水定容，在黑暗处反应60 min后，以空白对照作为参比液。并由公式（1）计算多酚提取量。
式中：m1为多酚含量，mg；V1为定容体积，mL；V2为吸取样液体积，mL；m0为枣粉质量，g。
1.3.2 多酚的提取工艺优化
固定其它条件，分别考察单因素：乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24（g/mL）]、提取温度（40、50、60、70、80 ℃）、提取时间（10、20、30、40、50 min）对圆铃 1 号枣多酚提取量的影响。并根据单因素试验的结果，设计四因素三水平正交试验对提取条件进一步优化，如表1所示。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and their coded levels used for orthogonal array design
水平D提取温度/℃1 50 1∶12 20 50 2 60 1∶16 30 60 3 70 1∶20 40 70因素A乙醇体积分数/%B料液比/（g/mL）C提取时间/min
1.3.3 粗多酚的制备
称取35 g冻干枣粉，按正交分析法优化的最佳提取工艺条件进行超声辅助提取，离心，提取两次，合并2次提取液，55℃浓缩提取液，冻干（-70℃，36 h）得到粗多酚样品，粉碎，-18℃冰柜密封保存。
1.3.4 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定单体酚酸
色谱条件：InerSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相组成：5%甲醇（0.1%三氟乙酸）（A）和甲醇（B）；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；检测器：二极管阵列检测器；检测波长280 nm；洗脱方式：梯度洗脱，详见表2。
表2 梯度洗脱
Table 2 Gradient elution
时间/min 流动相B/% 流动相A/%0 20 80 30 20 80 35 35 65 60 60 40 65 100 0 75 100 0 80 20 80 85 20 80
1.3.5 体外抗氧化试验
1.3.5.1 DPPH·清除能力测定
在比色管中分别加入0.2 mL多酚样品溶液、5.0 mL DPPH乙醇（0.1 mmol/L）溶液（现用现配），振荡均匀，室温（25℃）条件下暗反应30 min。用双蒸水作参比，检测波长517 nm，测定吸光度值[16]，由公式（2）计算DPPH·的清除率。并以水溶性维生素E含量为横坐标，DPPH·的清除率为纵坐标，得到标准曲线方程：Y=3.315 1X-0.015 7，R2=0.998 1。
式中：A0为空白吸光度；A1为样品与DPPH溶液的吸光度；A2为样品吸光度。
1.3.5.2 ABTS+·清除能力测定
将7 mmol/L ABTS溶液、2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按一定比例混合，于25℃下暗处反应13 h～18 h形成ABTS+·储备液（现用现配）。测定前，用体积分数80%乙醇稀释ABTS溶液，检测波长734 nm，当吸光度为0.700±0.020，即为ABTS测定液。在具塞比色管中依次加入多酚样品溶液0.2 mL、ABTS测定液5.0 mL，振荡均匀。暗反应8 min，用双蒸水作对照，检测波长734 nm，测定吸光度值[17]。由公式（3）计算 ABTS+·的清除率，并以水溶性维生素E含量为横坐标，ABTS+·的清除率为纵坐标，得到标准曲线方程：Y=7.770 1X-0.006 4，R2=0.999 3。
式中：A0为空白吸光度；A1为样品和ABTS溶液的吸光度。
1.3.5.3 亚铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
在具塞比色管中依次加入多酚样品溶液0.6 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，1%铁氰化钾溶液2.5 mL，振荡均匀后，在45℃水浴18 min。冷却后加入2.5 mL的10%三氯乙酸，摇匀离心，吸取2.5 mL上清液于另一具塞比色管中，依次加入2.5mL双蒸水、0.5 mL 0.1%三氯化铁，振荡均匀，反应8min，检测波长700nm，测定吸光度值[18]。并以水溶性维生素E含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到标准曲线方程：Y=1.2591X+0.017，R2=0.996 6。
1.4 数据分析
本试验所有数据独立测定3次，结果以
±s表示。使用SPSS 24软件进行方差分析和差异性显著分析，并用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
单因素试验结果见图1。
图1 乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度对多酚提取量的影响
Fig.1 Effects of ethanol volume fraction，solid to liquid ratio，extraction time and extraction temperature on extration rate of ployphenols
A.乙醇体积分数；B.料液比；C.提取时间；D.提取温度。
由图1A可知，随着乙醇体积分数的增大，多酚提取量也随之增大。当用60%的乙醇提取时，多酚提取量最高，为10.47 mg/g。随后继续提高乙醇体积分数，多酚提取量逐渐降低。这是因为水相比例较高时，水溶性的多糖、蛋白质等杂质增多，不利于多酚类物质的溶出。乙醇比例较高时，会使色素等脂溶性成分大量溶出，阻碍了多酚的溶出，且高浓度的乙醇更容易挥发[19-20]。因此乙醇体积分数60%为最佳水平。
由图 1B 可知，料液比为 1∶8（g/mL）～1∶16（g/mL）时，随着溶剂体积的增大，多酚提取量呈上升趋势，这是因为随着溶剂的增多提高了传质推动力，使得多酚较多地溶出[21]。但在 1∶16（g/mL）之后，多酚提取量基本保持不变，表明此时多酚物质已不再浸出。因而，本着节约成本的原则，选择料液比为1∶16（g/mL）作为最佳水平。
由图1C可知，提取时间为10 min～30 min时，随着提取时间的增加，多酚提取量也随之增大，且30 min时，多酚提取量达到最大值。提取时间超过30 min，多酚提取量反而略微降低。这可能是由于提取时间过长，导致部分多酚被分解或过程中发生了氧化分解。选择提取30 min作为最佳提取时间。
由图1D可知，提取温度为40℃～60℃时，随着提取温度的上升，多酚的提取量快速增大。这是由于升高温度，增加了溶质中各组分的扩散速率，使得多酚类物质更容易从溶质中浸出。当温度升高到60℃时达到最大值。继续升高温度多酚提取量有明显下降，这可能是一部分多酚在较高温度下被分解[20]，因次，选择60℃作为最佳提取温度。
2.2 正交试验设计及结果
正交试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results
试验号 A乙醇体 多酚提取量/（mg/g）1 1 1 1 1 9.94 2 1 2 2 2 10.16 3 1 3 3 3 10.05 4 2 1 2 3 9.33 5 2 2 3 1 10.56 6 2 3 1 2 10.64 7 3 1 3 2 10.03 8 3 2 1 3 10.39 9 3 3 2 1 10.09 K1 30.15 29.30 30.97 30.59 K2 30.53 31.11 29.58 30.83 K3 30.51 30.78 30.64 29.77 k1 10.050 9.767 10.323 10.197 k2 10.177 10.370 9.860 10.277 k3 10.170 10.260 10.213 9.923 R 0.127 0.603 0.463 0.354积分数 B料液比 C提取时间D提取温度
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of the extraction efficiency of polyphenols with various extraction conditions
注：*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01，差异极显著。
因素 偏差平方和 自由度 均方 F值A 0.092 2 0.046 0.878 B 1.871 2 0.935 17.918**C 1.027 2 0.514 9.84**D 0.616 2 0.308 5.904*误差 0.940 18 0.052总计 5.374
由表3可以看出，各因素对多酚提取量的影响顺序为：B＞C＞D＞A，且最佳工艺条件为 A2B2C1D2，即料液比为 1∶16（g/mL），提取温度为 60 ℃，提取时间 20 min，乙醇体积分数60%，方差分析表明，B（料液比）、C（提取时间）两个因素对多酚提取量有极显著影响，D（提取温度）对多酚提取量有显著影响，A（乙醇体积分数）对多酚提取量的影响不显著。
2.3 最佳提取工艺验证试验
精确称取3份1.000 g枣粉，按照优化的最佳提取工艺条件，即提取温度60℃、乙醇体积分数60%、料液比 1∶16（g/mL）、提取时间 20 min，平行测定 3 次。结果表明，在此提取工艺下多酚提取量高于正交试验的9个组合，平均提取量为（10.69±0.078）mg/g。表明此工艺条件下圆铃1号枣多酚提取量高、重复性好。
2.4 酚酸测定结果
为进一步探究圆铃1号枣中多酚的组分，本研究通过高效液相色谱法对样品中的6种单体酚酸进行定性和定量分析，结果如图2和表5所示。
图2 多酚样品中6种酚酸和标准品混合液的HPLC图
Fig.2 HPLC chromatograms of the 6 phenolic acid from polyphenols and the reference substance
A.多酚样品；B.标准品混合液；1.(+)-儿茶素；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.香豆素；5.芦丁；6.肉桂酸。
表5 6种单体酚的保留时间、标准曲线
Table 5 Retention time and standard curve of six monomer phenols
编号 多酚单体 保留时间/min 标准曲线 R2 线性范围/（μg/mL）1 （+）-儿茶素 13.583 Y=10 953X-1 258.4 0.999 5 4～24 2 绿原酸 20.164 Y=22 506X-778.33 0.998 1 0.2～-1.2 3 咖啡酸 25.878 Y=42 875X-8 138.9 0.999 5 1～6 4 香豆素 48.423 Y=63 877X-674 0.999 4 0.2～1.2 5 芦丁 52.974 Y=9 582.3X-3 238.7 0.999 6 4～24 6 肉桂酸 60.357 Y=107 800X-1 356.3 0.996 1 0.04～0.24
通过图2A与图2B中各标准品的色谱峰保留时间对比，共分析鉴定出6种酚酸：（+）-儿茶素、绿原酸、咖啡酸、香豆素、芦丁、肉桂酸，其含量分别为（13.66 ± 0.62）、（2.11 ± 0.13）、（4.05 ± 0.16）、（0.3 ± 0.03）、（17.09±0.48）、（0.1±0.01）mg/100 g DW。目前，很多研究表明这些单体酚能够预防和治疗很多由氧化应激引起的相关疾病，例如（+）-儿茶素、咖啡酸有较为广泛的抗菌[22-23]、抗病毒活性[24-25]等。芦丁能够在体内转化生成槲皮素，从而抑制脂肪细胞分化，起到缓解肥胖的作用[26]。因此，枣多酚作为一种天然优质抗氧化剂，具有重要的研究开发价值。
2.5 体外抗氧化活性测定结果
为进一步探讨圆铃1号枣多酚物质与抗氧化活性的关系，研究了其多酚提取物对DPPH·和ABTS+·的清除能力，结果见图3。每克多酚提取物的抗氧化活性相当于多少毫克Trolox，结果见表6。
图3 不同浓度枣多酚提取物和Trolox对DPPH·和ABTS+·清除率测定结果
Fig.3 The DPPH·and ABTS+·scavenging activities of polyphenols extracts of different concentration from jujube and Trolox
A.枣多酚样品；B.阳性对照（Trolox）。
表6 圆铃1号枣多酚提取物体外抗氧化活性测定
Table 6 Antioxidant activities in vitro of polyphenols extracts from Yuanling 1
测定项结果/（mg Trolox/g）DPPH·清除能力 17.96±0.95 ABTS+·清除能力 27.79±3.06亚铁离子还原能力 32.89±2.17
如图3A所示，枣多酚提取物对DPPH·和ABTS+·均有较强的清除效果，且在相同浓度下对ABTS+·的清除能力要明显高于DPPH·。结果表明枣多酚提取物质量浓度为16.0 mg/mL时对DPPH·已有较高的清除能力，此时清除率达到（85.4±0.8）%，继续提高多酚质量浓度，清除率基本保持不变；枣多酚提取物质量浓度为8.0 mg/mL时，已有较高的ABTS+·清除率，为（97.3±2.33）%。
由表6可以看出，枣多酚提取物的亚铁离子还原能力为（32.89 ± 2.17）mg Trolox/g，且对 ABTS+·的清除活性要高于DPPH·。
3 结论
圆铃1号枣多酚最佳提取条件：料液比1∶16（g/mL），提取温度60℃，提取时间20 min，乙醇体积分数60%，此时多酚提取量最高，为（10.69±0.078）mg/g。通过高效液相色谱共鉴定出6种酚酸：芦丁、香豆素、咖啡酸、肉桂酸、（+）-儿茶素、绿原酸，其中芦丁含量最高为（17.09±0.48）mg/100 g DW。多酚提取物的 DPPH·和ABTS+·清除能力、FRAP 还原力分别为（17.96±0.95）、（27.79± 3.06）、（32.89± 2.17）mg Trolox/g，可以作为优良的天然抗氧化物质。研究结果为圆铃1号枣多酚在食品及营养保健领域的应用提供了良好的理论依据。
[1]AL-RAWAHI A S，EDWARDS G，ALSIBANI M，et al.Phenolic constituents of pomegranate peels(Punica granatum L.)cultivated in Oman[J].European Journal of Medicinal Plants，2014，4(3):315-331.
[2]NIKNEJAD F，MOHAMMADi M，KHOMEIRI M，et al.Antifungal and antioxidant effects of hops(Humulus lupulus L.)flower extracts[J].Advances in Environmental Biology，2014，8(24):395-401.
[3]ESPINOSA-PARDO F A，NAKAJIMA V M，MACEDO G A，et al.Extraction of phenolic compounds from dry and fermented orange pomace using supercritical CO2and cosolvents[J].Food and Bioproducts Processing，2017，101:1-10.
[4] QUEEN B L，TOLLEFSBOL T O.Polyphenols and aging[J].Current Aging Science，2010，3(1):34-42.
[5] CORY H，PASSARELLI S，SZETO J，et al.The role of polyphenols in human health and food systems:A mini-review[J].Frontiers In Nutrition，2018，5:87.
[6]FRAGA C G，CROFT K D，KENNEDY D O，et al.The effects of polyphenols and other bioactives on human health[J].Food Funct，2019，10(2):514-528.
[7] JIAO X Y，WANG Y H，LIN Y，et al.Blueberry polyphenols extract as a potential prebiotic with anti-obesity effects on C57BL/6 J mice by modulating the gut microbiota[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2019，64:88-100.
[8]ANAGNOSTOPOULOU M A，KEFALAS P，PAPAGEORGIOU V P，et al.Radical scavenging activity of various extracts and fractions of sweet range peel(Citrus sinensis)[J].Food Chemistry，2005，94(1):19-25.
[9] SHAN S H，XIE Y，ZHAO H L，et al.Bound polyphenol extracted from jujube pulp triggers mitochondria-mediated apoptosis and cell cycle arrest of HepG2 cell in vitro and in vivo[J].Journal of Functional Foods，2019，53:187-196.
[10]MAHAJAN R T，CHOPDA，M Z.Phyto-pharmacology of Ziziphus jujuba Mill-A plant review[J].Pharmacological Reviews，2009，3(6):320-328.
[11]CHENG，D，ZHU，C Q，CAO，J K，et al.The protective effects of polyphenols from jujube peel(Ziziphus Jujube Mill)on isoproterenolinduced myocardial ischemia and aluminum-induced oxidative damage in rats[J].Food and Chemical Toxicology，2012，50(5):1302-1308.
[12]张兆英，赵峥桦，陈新，等.不同方法提取金丝小枣多酚比较研究[J].食品研究与开发，2020，41(12):153-159.
[13]FU L，XU B T，XU X R，et al.Antioxidant capacities and total phenolic contents of 62 fruits[J].Food Chemistry，2011，129(2):345-350.
[14]王斌，郭裕新，周广芳，等.枣优良制干新品种——圆铃1号[J].园艺学报，2001，28(4):377.
[15]李海平，高艳芳，姚宇，等.响应面法优化超声辅助提取壶瓶枣多酚工艺研究[J].食品研究与开发，2019，40(6):139-144.
[16]张国强，郭晓东，薛文华，等.西藏野生卷叶黄精多酚的提取及其抗氧化活性分析[J].食品科学，2017，38(6):236-241.
[17]杨迎，谢凡，龚胜祥，等.响应面法优化辣木籽多酚提取工艺及其抗氧化活性[J].食品工业科技，2018，39(3):172-178.
[18]DUAN X，LI M，MA H J，et al.Physicochemical properties and antioxidant potential of phosvitin-resveratrol complexes in emulsion system[J].Food Chemistry，2016，206:102-109.
[19]刘仙俊，范向前，史起鹏，等.燕麦总多酚的微波辅助提取工艺研究[J].食品研究与开发，2016，37(17):55-59.
[20]谢佳函，刘回民，刘美宏，等.红豆皮多酚提取工艺优化及抗氧化活性分析[J].中国食品学报，2020，20(1):147-157.
[21]丁双华，叶立斌，陈卫，等.响应面优化提取桑叶多酚的研究[J].中国食品学报，2012，12(1):52-58.
[22]BERNAL-MERCADO A T，GUTIERREZ-PACHECO M M，ENCINAS-BASURTO D，et al.Synergistic mode of action of catechin，vanillic and protocatechuic acids to inhibit the adhesion of uropa-thogenic Escherichia coli on silicone surfaces[J].Journal of Applied Microbiology，2020，128(2):387-400.
[23]LI Q，HE Y N，SHI X W，et al.Clerodens E-J，antibacterial caffeic acid derivatives from the aerial part of Clerodendranthus spic atus[J].Fitoterapia，2016，114:110-114.
[24]LANGLAND J，JACOBS B，WAGNER C，et al.Antiviral activity of metal chelates of caffeic acid and similar compounds towards herpes simplex，VSV-Ebola pseudotyped and vaccinia viruses[J].Antiviral Res，2018，160:143-150.
[25]YOU H L，HUANG C C，CHEN C J，et al.Anti-pandemic influenza A(H1N1)virus potential of catechin and gallic acid[J].Journal of the Chinese Medical Association，2018，81(5):458-468.
[26]SELLOUM L，REICHL S，MÜLLER M，et al.Effects of flavonols on the generation of superoxide anion radicals by xanthine oxidase and stimulated neutrophils[J].Arch Biochem Biophys，2001，395(1):49-56.