添加各类乳化剂是提高食品稳定性的有效措施。蛋白质作为一种天然乳化剂，在降低界面张力方面不如一些低分子量表面活性剂，如卵磷脂、单甘油脂和双甘油脂等，但蛋白质作为大分子的稳定性却要明显优于这些小分子量的乳化剂。这是因为蛋白质除了可以降低界面张力外，还可以在油滴周围形成一层连续的黏弹性界面膜，而低分子量表面活性剂却不能形成这种黏弹性膜[1]。因此，蛋白质作为食品乳化剂的一个主要潜在优势是能够保护脂质不受铁离子催化氧化的影响。在pH值低于等电点时，蛋白质在油滴周围形成带正电荷的界面膜，使静电排斥水相中存在的任何Fe2+离子和Fe3+离子，从而防止油滴中多不饱和脂类的氧化[2]。
此外，蛋白质中的氨基酸可以清除自由基、螯合氧化金属。明胶是由动物的皮、骨骼以及肌腱中胶原蛋白变性或水解制成的，具有一定的表面活性，能够在水包油乳状液中起乳化剂的作用[3]。近年来，利用鱼类的副产物提取明胶成为人们研究的热点，然而，与哺乳动物明胶相比，鱼类明胶的乳化性能较差。因此，提高鱼类明胶的功能特性成为当下研究的重点。
天然植物源酚类化合物是指具有羟基取代基的芳香环化合物，可作为金属离子螯合剂、供氢剂、单线态氧猝灭剂或还原剂。这些酚类化合物容易被氧、臭氧或多酚氧化酶氧化成醌。醌可以在副反应中形成二聚体，或通过共价或氢键与蛋白质氨基侧链反应[4]。因此，氧化酚类化合物可以作为蛋白质交联剂，来改善蛋白质的功能性质。并且，酚类化合物可以修饰蛋白质的抗氧化活性。氧化酚类化合物还可以与蛋白质相互作用形成相当稳定的复合物，这些复合物能够抵抗蛋白质变性剂的破坏[5]。然而，关于酚类化合物对明胶的改性及其对乳状液稳定性和脂质氧化影响的研究还很少。因此，本研究通过氧化绿原酸（oxidized chlorogenic acid，OCA）对鳕鱼皮明胶进行改性，探讨改性后鳕鱼皮明胶的乳化特性和抗氧化活性以及其对乳状液脂质氧化的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鳕鱼皮：大连天宝绿色食品有限公司；绿原酸、十二烷基磺酸钠、2，4，6-三硝基苯磺酸：美国Sigma公司；盐酸、过氧化氢、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、亚硫酸钠、三氯化铁：上海化学试剂有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthacenesulfonis acid，ANS）：艾美捷科技有限公司；透析袋：索莱宝科技有限公司；所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
T18匀浆机、C-MAGHS10型磁力搅拌器、5500型冷浆离心机：日本KUBOTA以司；C-MAGHS10型磁力搅拌拌器：德国IKA公司；AH-basic型高压均质机：上海顺仪实验设备有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；ANS-荧光探针：美国Sigma公司；5500型冷冻离心机：日本KUBOTA公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鳕鱼皮明胶的提取
将鳕鱼皮冲洗后切成小块（1 cm×1 cm），25℃下用0.05 moL/L NaOH搅拌鳕鱼皮6 h，每隔1 h更换一次溶液，持续6 h。然后用蒸馏水清洗碱处理过的鳕鱼皮，直到洗涤水的pH值为中性。用5% H2O2漂白48 h，然后用蒸馏水冲洗3次。用蒸馏水（60℃）从漂白过的鳕鱼皮中提取明胶，提取时间为12 h，样品与水比为1∶2（g/mL）。使用冷冻离心机在8 000 r/min下离心30 min，以去除不溶性物质，收集上清液并冷冻干燥。
1.3.2 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶的改性
将鳕鱼皮明胶溶解于含0.02%叠氮化钠的蒸馏水中，得到最终浓度为1.2%的蛋白质。用1 moL/L NaOH将明胶溶液调节至pH 9.0。在蒸馏水中溶解浓度为2%的绿原酸溶液，然后用1 moL/L NaOH调节至pH 9.0。然后在40℃下用氧气将溶液鼓泡1 h，将绿原酸转化为氧化形式。向75mL明胶溶液中添加不同浓度（2.5%、5.0%、10.0%和20.0%）的氧化绿原酸溶液。使用蒸馏水（pH 9.0）将最终体积补至90 mL，使用磁力搅拌器在25℃下以200 r/min连续搅拌混合物12 h。此后，样品透析24 h，以去除游离酚类化合物（未与蛋白质结合）。
1.3.3 游离氨基含量的测定
根据BENJAKUL等[6]的方法测定样品的游离氨基含量。向125 μL样品中添加2.0 mL 0.2 moL/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0）和 1.0 mL 0.01%2，4，6-三硝基苯磺酸溶液充分混合，并置于50℃的水浴中进行30 min暗反应。添加2.0 mL 0.1 moL/L亚硫酸钠终止反应，并将混合物在25℃下冷却15 min。在420 nm处测吸光度，并以L-亮氨酸表示游离氨基含量。
1.3.4 表面疏水性的测量
根据BENJAKUL等[6]的方法进行测定，用1-苯胺基萘-8-磺酸作为探针，明胶溶液（4 mg/mL）在含有0.6 moL/L NaCl的10 mmoL/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中稀释，得到0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的蛋白质浓度。在0.1 moL/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，将稀释的蛋白质溶液（2 mL）与20 μL 8 mmoL/L ANS混合。在374 nm的激发波长和485 nm的发射波长下，测定荧光强度。荧光强度与蛋白质浓度作图，斜率为表面疏水性。
1.3.5 浊度的测定
根据PEARCE等[7]的方法测定，稍作修改。大豆油（2 mL）和明胶溶液（1%蛋白质，6 mL）用均质机以20 000 r/min的速度均质1 min。在放置0和10 min时取乳状液用0.1%十二烷基硫酸钠稀释100倍后振荡10 s，测得的吸光值A500为浊度。
1.3.6 抗氧化活性的测定
1）DPPH自由基清除活性：根据BINSAN等[8]的方法，稍加修改。将1 mL样品和4 mL 0.10 mmol/L的1，1-二苯基-2-苦味酸（DPPH）溶液混合，25℃下黑暗放置30 min后在517 nm波长处进行比色。
式中：A为加入样品后溶液的吸光度；B为样品的吸光度；C为未加样品溶液的吸光度。
2）Fe2+的螯合活性：根据 NOOSHKAM 等[9]方法测定。将4.7 mL样品与0.1 mL 2 mmol/L氯化亚铁和0.2 mL 5 mmol/L三氯化铁混合，在25℃下静置20 min，然后在562 nm处读取吸光度。
式中：A为样品的吸光度；B为空白的吸光度。
1.3.7 硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactant，TBARS）的测定
根据BUEGE等[10]的方法，并稍作修改。将大豆油和氧化绿原酸改性后的明胶溶液（1∶9，体积比）在10 000 r/min下均质2 min，然后在40 MPa的压力下高压均质2次，加入0.02%的NaN3作为抗菌剂。将2 mL乳状液样品分散于10 mL硫代巴比妥酸溶液（0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 moL/L盐酸）。混合物在沸水中加热10 min后冷却。混合物在3 600 g下离心20 min，在532 nm处测定上清液的吸光度。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷做标准曲线确定硫代巴比妥酸值。
1.4 统计分析
每一个试验重复操作3次，结果以平均值±标准差的形式表示。数据统计分析采用Statistix 8.1中Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。
2 结果与分析
2.1 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶游离氨基含量的影响
不同浓度氧化绿原酸改性鳕鱼皮明胶的游离氨基含量见图1。
图1 不同浓度氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶游离氨基含量的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on free amino content of cod skin gelatin
不同大写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，氧化绿原酸改性明胶的游离氨基含量均低于对照明胶（不含OCA），这表明亲核氨基可能与酚类化合物的氧化形式亲电醌相互作用，导致游离氨基含量降低。随着OCA浓度的增加，游离氨基的损失增加（P＜0.05）。经 2.5%、5.0%、10.0%和 20.0%的OCA修饰后，鳕鱼皮明胶的游离氨基含量分别下降到8.24、8.01、7.83、7.30 mmol/L。这是因为氧化后的酚类化合物可与蛋白质分子的色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸和脯氨酸等亲核基团反应[11]。并且，氧化后的酚类化合物转变成醌类化合物，其中包含了大量的反应性亲电分子，这些分子很容易与蛋白质或氨基酸的官能团发生反应，导致蛋白质游离氨基含量降低[12]。
2.2 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶表面疏水性的影响
氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶表面疏水性的影响见图2。
图2 不同浓度氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶表面疏水性的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on the surface hydrophobicity of cod skin gelatin
不同大写字母表示差异显著（P＜0.05）。
1-苯胺基萘-8-磺酸是一种荧光探针，可与苯丙氨酸、色氨酸等含芳环的疏水性氨基酸结合，可用来指示蛋白质的表面疏水性。由图2所示，与对照明胶相比，OCA修饰的鳕鱼皮明胶表面疏水性显著降低（P＜0.05）。所有OCA改性的明胶表面疏水性随OCA浓度的增加而降低（P＜0.05）。明胶表面疏水性的降低表明，氧化酚类化合物可以帮助明胶分子形成亲水性更强的构象。氧化酚类化合物改性的明胶表面疏水性的降低可能是由于酚类化合物的羟基和羧基附着在明胶上所致。酚类化合物的共价结合复合物对蛋白质的亲水性造成阻碍，如氨基和硫醇基[13]。另一方面，引入的非极性基团（苯环）和极性基团（如酚酸中的羟基和羧基）的数量也在增加[3]。
2.3 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶浊度的影响
氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶浊度的影响见图3。
图3 不同浓度氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶浊度的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on turbidity of cod skin gelatin
不同大写字母表示差异显著（P＜0.05）。
浊度的大小能够反映出蛋白质的乳化活性，可用来研究蛋白质与酚类化合物之间通过共价或非共价相互作用的复杂行为[14]。图3显示了不同浓度下氧化绿原酸改性鳕鱼皮明胶的浊度。与对照组相比随着OCA浓度（2.5%～10.0%）的增加，浊度显著增强（P＜0.05）。这可以解释为氧化酚类化合物与明胶的相互作用可能导致明胶分子的聚集[15]。WANG等[16]研究表明，玉米醇溶蛋白水解物和单宁酸之间形成的微聚集可显著提高溶液的乳化活性。由于明胶与氧化酚类化合物的相互作用，通过共价C-S键或C-N键与巯基或氨基侧链形成二聚体或共价共轭物，从而导致微聚集。蛋白质的表面疏水性通常与其表面活性有关，通过降低界面张力，改善乳化活性。然而，当OCA的浓度超过5%时，浊度有所下降，并且随着氧化酚类化合物浓度的增加，这种下降更为明显。这可能是氧化酚类化合物降低了明胶在油水界面的定位能力，明胶可能无法在油水界面展开，无法有效地在油滴周围形成薄膜[17]。因此，氧化酚类化合物在明胶中较高的添加量对改性明胶的乳化性能有不利影响。
2.4 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶抗氧化性的影响
氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶抗氧化性的影响见表1。
表1 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶抗氧化性的影响
Table 1 Effect of oxidized chlorogenic acid on antioxidant activity of cod skin gelatin
注：数据表示为平均值±标准差（n=3）；同一列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
OCA/% DPPH自由基清除能力/% Fe2+的螯合活性/%0 5.04±0.27E 1.89±0.21E 2.5 33.78±0.41D 9.65±0.15D 5.0 38.94±0.49C 11.06±0.09C 10.0 43.25±0.16B 14.58±0.18B 20.0 50.06±0.22A 17.32±0.32A
如表1所示，与对照相比，当明胶与2.5%、5%、10%、20%的OCA混合时，自由基清除活性分别提高到33.78%、38.94%、43.25%和50.06%。结果表明，在明胶中引入酚类化合物有助于提高明胶的抗氧化活性。氧化酚类化合物对明胶DPPH自由基的清除作用可能是由于它们的供氢能力。氧化酚类化合物的游离醌主要还原为羟基，这些羟基可以为DPPH自由基提供氢。此外，Fe2+作为促氧化剂，可以催化生成羟基自由基，从而加速脂质过氧化链式反应。明胶的金属螯合活性随着OCA浓度的增加而增加（P＜0.05）。可见，OCA改性的明胶能够减少过渡金属的可用性，限制自由基介导的氧化连锁反应，使氧化前的金属被隔离，导致氧化程度降低[18]。
2.5 氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶TBARS值的影响
氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶TBARS值的影响见图4。
图4 不同浓度氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶TBARS值的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of oxidized chlorogenic acid on TBARS value of cod skin gelatin
如图4所示，随着OCA浓度的增加，明胶中的TBARS值显著降低（P＜0.05）。在贮存的前3 d内，明胶中的TBARS值较低。此后，明胶中的TBARS值显著增加，尤其是对照组增加的尤为显著。可能是较高浓度的OCA改性的明胶对脂质氧化的预防作用，可能与油滴周围较厚的薄膜有关，这可以更有效地防止氧气渗入油滴，能够有效地延缓脂质氧化。因此，氧化绿原酸改性明胶具有延缓水包油乳状液TBARS生成的能力。INTARASIRISAWAT等[19]研究表明蛋白水解物稳定乳状液，通过加入不同量的氧化绿原酸，可以显著抑制脂质氧化。氧化绿原酸的附着可以诱导更多的羟基，从而提高明胶的供氢能力，从而保护乳状液免受氧化。并且，氧化绿原酸改性的明胶在界面膜上提供了一个改进的物理屏障，促进了乳状液在储存期间的氧化稳定性。
3 结论
在本研究中不同浓度的氧化绿原酸对鳕鱼皮明胶的抗氧化能力和乳化性能都具有一定的影响。氧化绿原酸可与明胶分子中的亲核基团反应，并且氧化绿原酸的羟基和羧基能够附着在明胶上，导致蛋白质游离氨基含量和表面疏水性降低。氧化绿原酸和明胶之间形成的微聚集可显著提高溶液的浊度，5.0%氧化绿原酸改性明胶的浊度最高，较高浓度的氧化绿原酸会影响明胶的乳化性能。氧化绿原酸能够增加明胶的供氢能力，提高自由基清除能力。氧化绿原酸改性的明胶可作为螯合剂，减少过渡金属的可用性，增加抗氧化活性。此外，利用氧化绿原酸改性的明胶在贮藏期内比对照明胶能更有效地抑制脂质氧化。
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