辣木（Moringa oleifera）是辣木科辣木属热带落叶乔木，起源自印度西北部，目前在我国云南、广西、广东等地区均有种植[1]。辣木中含有丰富的碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素和矿物质等营养物质[2]。有研究发现，辣木叶中含有类胡萝卜素、抗坏血酸、黄酮类、多酚类、多糖类和生物碱等多种生物活性物质，其中主要活性物质黄酮对机体具有调节代谢、抗氧化、杀菌抗炎、改善免疫力等作用[3]。
运动员由于长期高强度训练和比赛，容易出现运动性疲劳的症状[4]。运动性疲劳是训练和比赛负荷超过了机体承受的能力，而产生的暂时的生理机能减退现象，是训练的生理反应，也是人体的自我保护机制[5]。但如果人体长期处于疲劳状态，前一次运动产生的疲劳还未及时消除，新的疲劳又产生，疲劳就会积累，久之产生过度疲劳，导致机体尿素氮、睾酮、皮质酮、乳酸、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛等生化指标异常，引起暂时性的生理机能减退，影响运动成绩，严重的运动性疲劳可导致运动员运动能力急剧下降，危及运动员的身体健康[6]。因此，及时消除运动性疲劳，提高机体的运动能力，对于运动员至关重要[7]。辣木叶营养丰富，具有抗氧化、抗疲劳、抗菌等功效[8]。2012年我国卫生部批准辣木为新资源食品，可用于功能食品研发[9]。鉴于辣木叶黄酮类物质具有极强的抗氧化能力，本研究采用小鼠过度训练模型，研究辣木叶黄酮对过度训练小鼠缓解运动性疲劳的功效。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
SPF级健康雄性BALB/c小鼠：50只，4周龄，体重18 g～20 g，许可证号 SCXK（京）2019-0003，北京维通利华实验动物技术有限公司；辣木叶：云南天佑科技开发有限公司；红景天西洋参胶囊：广州赛健生物科技有限公司；血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、睾酮（testosterone，TTS）、皮质酮（corticosterone，CTC）、血乳酸（blood lactic acid，BLA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蒽酮等试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
ZH-PT型动物跑台：淮北正华生物仪器设备有限公司；TGL-20B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；AL204电子天平：上海梅特勒托利多仪器有限公司；FSH-2型匀浆机：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；ALPHA 1-2 LD plus真空冷冻干燥机：德国Christ公司；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；iMagic-M7全自动生化分析仪：深圳市库贝尔生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 辣木叶黄酮的制备
1）辣木叶去脂：将40 g辣木叶粉碎成粉末置于索氏提取器萃取管中，在烧瓶中加入400 mL石油醚设置温度恒定70℃，经8 h冷凝回流后，30℃干燥30 min，即为去脂辣木叶粉末[10]。
2）提取辣木叶黄酮：将去脂辣木叶粉末按照料液比 1∶50（g/mL）加入 70%乙醇溶液中，超声（200 W）辅助提取30 min，60℃下浸提90 min，然后8 000 r/min离心10 min，抽滤得到辣木叶黄酮上清液[10]。
3）分离纯化辣木叶黄酮：取辣木叶黄酮上清液10 mL用HPD-750树脂吸附2h，然后用20mL蒸馏水和30mL 70%乙醇依次洗脱树脂表面黄酮，再用乙酸乙酯萃取纯化，经测定黄酮含量为71.6%，通过反相高效液相色谱法测定其成分，异槲皮苷41.27%，槲皮素21.76%[10]。
将制备样品与蒸馏水按照一定比例混合，得到质量浓度为10、20、40 mg/mL的灌胃液，备用。
1.3.2 动物分组、模型制备及运动训练方案
试验小鼠饲养条件：温度20℃～22℃，相对湿度50%～55%，自然光照，自由饮水。小鼠普通饲料饲养一周，随机分为5个试验组，分别为模型组（MG组）、对照组（RG组）和辣木叶黄酮低（FMLL组）、中（FMLM组）、高剂量组（FMLH组），每组10只小鼠，共50只。
运动训练方案：实验小鼠先进行适应性跑台训练1周，跑台坡度10°，跑速10 m/min，持续30 min。之后正式训练8周，每周训练6 d，休息1 d，跑台坡度10°，跑速从10 m/min开始，每分钟速率增加1 m/min，直至增加到40 m/min结束。训练期间观察并记录实验小鼠的一般表现（精神状态、摄食量、睡眠、死亡率）及训练状况（动作协调性、跑步速度、是否疲劳、是否俯卧位、是否垂头等）。
模型组（MG组）：每日定时灌胃1次蒸馏水100 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照运动训练方案进行训练。
对照组（RG组）：将红景天西洋参胶囊与蒸馏水配制成浓度为20 mg/mL的溶液，每日定时灌胃1次，灌胃剂量10 mL/（kg·d），折算剂量为200 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照运动训练方案进行训练。
辣木叶黄酮低（FMLL组）、中（FMLM组）、高剂量组（FMLH组）：补充辣木叶黄酮溶液，浓度分别为10、20、40 mg/mL，每日定时灌胃 1 次，灌胃剂量10 mL/（kg·d），折算剂量为100、200、400 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照运动训练方案进行训练。
1.3.3 小鼠体质量测定
试验第1天和第56天定时（8：00）称量小鼠体质量并记录。
1.3.4 生化指标测定
小鼠末次运动后，眼球取血，血液样品以3000r/min离心10 min，取上清液于-20℃保存；小鼠脱颈处死，取其肝脏和双侧后腿肌肉制备组织匀浆，分别剪取肝组织或肌组织放入烧杯中，用0.9%生理盐水漂洗3遍，洗去血液，用滤纸擦干并称取1 g，加入9 g生理盐水，置于冷冻研磨机中粉碎匀浆，将制备的匀浆3 000 r/min离心10 min，取上清液于-20℃保存。血清、肝脏和肌肉组织严格按照试剂盒说明书检测血清尿素氮（BUN）、睾酮（TTS）、皮质酮（CTC）、血乳酸（BLA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肌糖原、肝糖原等含量或活力指标。
1.4 统计分析
检测数据表示为平均值±标准差，通过SPSS 19.0统计软件进行数据分析，以单因素方差分析进行显著性差异检验，P＜0.05具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 实验期间小鼠的一般表现
在整个实验过程中，辣木叶黄酮高剂量组和对照组小鼠精神状态、睡眠、食欲均良好。模型组小鼠及辣木叶黄酮低、中剂量组小鼠在第2周以后出现精神萎靡、食欲不振、嗜睡现象。第4周时，辣木叶黄酮低、中剂量组小鼠精神状态恢复，睡眠良好，较为活泼。
2.2 辣木叶黄酮对小鼠体质量的影响
实验期间辣木叶黄酮对小鼠体质量的影响如图1所示。
图1 辣木叶黄酮对小鼠体质量的影响（n=10）
Fig.1 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on body weight of mice（n=10）
*.与 MG 组比较差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，实验初期各组小鼠体质量无显著差异，8周运动训练后，各组小鼠体质量均增加，与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠体质量均显著升高（P＜0.05）。模型组小鼠由于未使用任何营养补充剂，疲劳程度较重，食欲不振，体质量也低于辣木叶各剂量组。
2.3 辣木叶黄酮对小鼠血清抗疲劳指标的影响
实验期间辣木叶黄酮对小鼠血清抗疲劳指标的影响如图2所示。
图2 辣木叶黄酮对小鼠血清抗疲劳指标的影响（n=10）
Fig.2 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the anti-fatigue levels of serum in mice（n=10）
*.与MG组比较差异显著（P＜0.05）；Δ.与RG组比较差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，模型组小鼠血清睾酮含量显著低于其它各组、皮质酮含量显著高于其它各组，表明该组疲劳程度较重。与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠血清中睾酮含量分别升高11.0%、21.7%、26.6%、23.3%（P＜0.05），皮质酮含量各组分别降低 9.1%、15.8%、20.6%、18.3%（P＜0.05）。与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠血清尿素氮含量各组分别降低12.7%、21.1%、25.6%、21.8%（P＜0.05），当长时间高强度运动时，糖和脂肪供能不能满足机体需求，蛋白质分解代谢水平加快，尿素氮是人体蛋白质代谢主要终产物，在肝脏中合成，血清中的尿素氮浓度随运动负荷增加而增加[11]。本研究发现，辣木叶黄酮低、中、高剂量组小鼠的血清尿素氮浓度显著低于模型组，表明辣木叶黄酮能有效减少运动中蛋白质的分解，延缓尿素氮的合成，提高机体对高强度运动负荷的适应能力[12]。与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠血乳酸含量分别降低12.5%、20.1%、22.2%、20.4%（P＜0.05），乳酸脱氢酶活力各组分别降低 12.6%、17.8%、20.5%、19.7%（P＜0.05），肌酸激酶活力各组分别降低18.7%、30.3%、38.1%、34.2%（P＜0.05）。在高强度运动中，机体以无氧酵解为主要供能方式，葡萄糖经过无氧酵解代谢后生成乳酸，随运动强度的增加，血液及肌细胞中乳酸也随之增加，乳酸脱氢酶可催化丙酸与L-乳酸之间的反应，其活力反映机体对运动负荷的适应能力，肌酸激酶在肌细胞中参与细胞内能量转运、三磷酸腺苷合成、肌肉收缩，运动后可导致其活性明显升高[13]。本研究发现，辣木叶黄酮低、中、高剂量组小鼠的血清中乳酸含量、肌酸激酶和乳酸脱氢酶活力显著低于模型组，表明辣木叶黄酮可以有效清除高强度运动中机体无氧代谢产生的乳酸，降低肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性，避免代谢产物堆积对机体产生的伤害，提高机体对高强度运动负荷的适应能力及抗疲劳能力[14]。与对照组比较，辣木叶黄酮中、高剂量组血清中睾酮含量、皮质酮含量、乳酸含量、尿素氮含量、乳酸脱氢酶活力和肌酸激酶活力没有显著差异，表明辣木叶黄酮改善运动性疲劳的效果与功效明确的抗疲劳物质功效类似[15]。
2.4 辣木叶黄酮对小鼠肝糖原和肌糖原储备量的影响
实验期间辣木叶黄酮对小鼠肝糖原和肌糖原储备量的影响如图3所示。
图3 辣木叶黄酮对小鼠肝糖原和肌糖原储备量的影响（n=10）
Fig.3 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the reserve of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice（n=10）
*.与MG组比较差异显著（P＜0.05）；Δ.与RG组比较差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠运动后体内肝糖原储备量和肌糖原储备量均有显著升高（P＜0.05）；与对照组比较，辣木叶黄酮低剂量组肝糖原和肌糖原储备量分别降低34.5%和 24.4%（P＜0.05），辣木叶黄酮中、高剂量组没有显著差异。长期高强度运动，机体能源物质消耗、代谢物质积累，是运动性疲劳产生的重要原因[16]。在运动中葡萄糖为机体提供大量能量，供能的葡萄糖主要源自肝糖原和肌糖原分解。随着运动耗能的持续，糖原储备量也随之减少，增加糖原的储备量、节省糖原的利用，可以有效地提高机体的运动能力[17]。本研究发现，辣木叶黄酮低、中、高剂量组小鼠的肝糖原和肌糖原储备量显著高于模型组，表明辣木叶黄酮具有增加糖原储备量、减少运动中能源消耗的作用，从而提高运动耐力，改善运动性疲劳的程度[18]。
2.5 辣木叶黄酮对运动疲劳小鼠血清和肝组织抗氧化效果的影响
实验期间辣木叶黄酮对运动疲劳小鼠血清和肝组织抗氧化效果的影响如图4所示。
图4 辣木叶黄酮对运动疲劳小鼠抗氧化效果的影响（n=10）
Fig.4 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the antioxidation of serum and hepatic tissue in mice（n=10）
*.与MG组比较差异显著（P＜0.05）；Δ.与RG组比较差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠运动后血清中丙二醛含量分别降低 13.1%、20.1%、23.4%、23.0%（P＜0.05），肝组织中丙二醛含量分别降低18.1%、21.3%、29.2%、30.6%（P＜0.05），机体高强度运动时产生自由基，自由基催化生物膜中的多不饱和脂肪酸产生丙二醛等脂质过氧化物[19]。通过机体内丙二醛含量评价其脂质过氧化程度和细胞损伤程度，是反映机体氧化损伤的重要指标[20]。本研究发现，辣木叶黄酮低、中、高剂量组小鼠血清、肝脏中丙二醛含量显著低于模型组，表明辣木叶黄酮可有效减弱过度训练中细胞氧化应激反应，降低机体脂质过氧化损伤，减少丙二醛的生成，维持抗氧化系统的正常功能，缓解运动性疲劳的产生[21]。
与模型组比较，辣木叶黄酮低、中、高剂量组、对照组小鼠运动后血清和肝组织中过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力均显著升高（P＜0.05），尤其是高剂量组，血清和肝组织中过氧化氢酶活力分别提高46.8%和20.4%，超氧化物歧化酶活力分别提高43.6%和19.2%，谷胱甘肽过氧化物酶活力分别提高31.2%和23.6%，随着辣木叶黄酮摄入剂量的增加，抗氧化酶活力的提高也越明显。与对照组比较，辣木叶黄酮中、高剂量组血清和肝组织中丙二醛含量、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽过氧化物酶活力没有显著差异。高强度长时间运动过程中，机体能量快速消耗，代谢产物大量积累，骨骼肌中氧自由基和其它活性氧/氮物质增加、抗氧化酶系不断减少，高浓度活性氧可引起脂类、蛋白质、核酸以及细胞活性成分等发生功能性氧化损伤，促使细胞凋亡及抗氧化系统平衡作用失调，从而引发机体产生运动性疲劳[22]。为维持机体抗氧化系统平衡，提高抗氧化酶活力是关键[23]。本研究发现，辣木叶黄酮低、中、高剂量组小鼠血清、肝组织中过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力均显著高于模型组，表明辣木叶黄酮可有效增强抗氧化酶的活力，提高抗氧化能力，加速清除自由基和活性氧，改善机体抗疲劳的能力[24]。
3 结论
综上所述，辣木叶黄酮可以有效提高机体肝糖原和肌糖原的储备量、增强过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶系的活力，加速血清尿素氮、丙二醛等代谢物质的清除，减少其在体内积累，降低氧化应激反应，保护细胞结构和功能的完整，抵抗和延缓运动性疲劳的产生[25]。本研究为辣木叶黄酮的开发利用提供参考。
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