大果山楂又名广山楂、涩梨，为蔷薇科苹果亚科苹果属植物，主要分布在我国广西、广东、福建等南方地区。成熟时呈黄色或黄绿色，与北方盛产的红山楂外观上有明显区别[1-2]。大果山楂富含酚酸、多酚、黄酮和多糖等功能成分，并具有抗氧化、抑菌、降压、降脂、保肝、抗肿瘤和加强心肌收缩力等多种生物活性[2-7]。大果山楂每公顷产量可达30吨以上，但肉质硬实、酸而涩，不太适宜鲜吃。随着对大果山楂的药理和经济价值的深入研究，广西、广东等地区的栽培面积不断扩大，面临大规模深加工的需求。
传统的大果山楂加工方式主要是通过腌制、干燥等工艺制备果脯、果干等，其它类型加工方式的报道很少[8-10]。根据大果山楂果肉特性和化学成分特点，为保留生物活性成分和丰富的原果风味，前期研究了大果山楂酒发酵的优化工艺，结果表明，通过液体深层发酵生产果酒可有效释放大果山楂果肉组织的生物活性成分，并形成类似于香槟的清爽酒香。鉴于还没有文献对大果山楂酒的活性成分和抗氧化活性以及香气成分进行报道。在此基础上，本试验拟采用顶空固相微萃取（head-space solid-phase micro extraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用对不同发酵时段的样品香气成分进行提取与分析，并对不同发酵时段的样品的总酚含量以及抗氧化性进行研究，旨在为开发优质大果山楂酒高值化途径提供更为科学的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大果山楂鲜果：韶关锐新达农业科技有限公司。葡萄酒高活性干酵母（BV818型）：湖北安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；福林酚试剂（分析纯）：上海荔达生物科技有限公司；没食子酸一水合物（分析标准品）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗坏血酸（纯度≥98.0%）：上海吉如生物科技有限公司；DPPH：东京化成工业株式会社。
1.2 仪器与设备
振荡培养箱（SPX-250B-D）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；30 L全自动发酵系统（Bwg-6030型）：汇和堂生物工程设备（上海）有限公司；双光束紫外可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限公司；数显集热式磁力搅拌器（DF101B）：金坛大地自动化仪器厂；气质联用仪（QP-2010型）：日本岛津公司；胶体磨（E2-100 L-2）：上海德东电机厂；数显糖度计（PAL-1）：ATAGO（爱拓）中国分公司；平板密闭离心机（PSB800）：张家港市远华机械制造厂；立式硅藻土过滤机（LY-400-20）：上海滤盈设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 低温发酵制备大果山楂酒
采用前期优化的工艺进行果酒制备。选取成熟度高、无病害果，于90℃热水中热烫5 min，冷却后添加果重等量的水再经胶体磨打成细浆。于48℃恒温果胶酶酶解2 h，调整糖度至22°Bx，升温85℃灭菌15 min，冷却后加入偏亚硫酸钾。接种0.45%安琪低温酿酒酵母于24℃进行恒温酒精发酵，将酵母接入大果山楂发酵醪的时间记作0 h，第0 h即为大果山楂原浆，此时不含酒精，设置大果山楂酒样品采集时间分别为6、24 h，以后每隔12 h取一次样。直至残糖含量低于4 g/L时结束发酵。发酵液离心去渣，硅藻土过滤机精滤得到澄清的淡黄色大果山楂原酒。
1.3.2 分析方法
1.3.2.1 理化分析
1）酒精度：酒精计法。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
2）总酸含量：指示剂法。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
3）残糖含量：直接滴定法[11]。
4）总酚含量：Folin-Ciocalteu比色法，以没食子酸质量浓度（μg/L）为横坐标，765 nm处的吸光值为纵坐标[12]，得到回归方程为 y=0.0106x+0.025 7，R2=0.996 3。
5）DPPH自由基清除能力测定：以VC标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，对 DPPH·清除率为纵坐标[13]，得到回归方程为 y=0.380 1x+2.348 9，R2=0.996 3，本试验测定DPPH·清除能力用VC当量（VCEAC）来评价不同发酵阶段大果山楂果酒的抗氧化能力。
6）ABTS+·清除能力测定：以VC标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，对ABTS+·清除率为纵坐标[14]，得到回归方程为y=0.623 6x+0.659 8，R2=0.999 3，本试验测定ABTS+·清除能力用VC当量（VCEAC）来评价不同发酵阶段大果山楂果酒的抗氧化能力。
1.3.2.2 果酒芳香成分GC/MS测定
1）香气成分的提取
取5 mL样品溶液置于20 mL顶空瓶中，加入1 g氯化钠，再加入叔丁醇20 μL做为内标进行定量检测，加盖密封摇匀，于50℃水浴中平衡15 min，然后将老化好的 50/30 μm，DVB/CAR/PDMS针头插入样品瓶中，推出纤维头，保持在45℃恒温顶空吸附40 min，然后取出插入到GC-MS进样口进行挥发性成分分离鉴定。
2）色谱条件
HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：柱箱温度初始40℃保持2 min，以5℃/min升至80℃，再以3℃/min升到120℃，最后以10℃/min升至250℃，保持5 min；载气为高纯氦气（99.999%），分流比为10∶1。进样口温度：250℃，载气：He，压力48.95kPa；分流比为 10∶1，流速 1 mL/min。质谱条件：GC-MS接口温度250℃，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，扫描方式SCAN，质量扫描范围30 amu～550 amu，标准质谱谱库 NTST05。
各色谱峰对应的质谱图经联用仪的计算机谱库NIST 05.L检索并与标准谱图对照，并结合已有的报道进行定性分析。
1.3.2.3 数据处理
利用IBM SPSS Statistics 22进行数据分析，3组及以上数据的组间显著性差异采用单因素方差分析、最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）进行显著性分析，数据采用（
±SD）表示，p＜0.05 为差异显著。用Pearson双侧检验法对总酚含量、DPPH自由基清除能力以及ABTS+·清除能力进行相关性分析，p＜0.05表示有显著相关性。
2 结果与分析
2.1 大果山楂酒发酵过程中酒精度的变化
大果山楂鲜果经热烫钝酶护色、破果和酶解液化后接种经活化的酿酒酵母进行液态深层发酵，发酵过程中酒精度变化情况如图1所示。
图1 大果山楂酒酿造过程中酒精度变化
Fig.1 Dynamic changes in the alcohol content of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine during brewing
发酵第1天分别在6 h和24 h取样，平均酒精度分别达到（3.1±0.10）%vol和（7.9±0.06）%vol。此后每隔12 h取样跟踪酒精度变化，酒精度持续升高，72 h时达到峰值（12.7±0.10）%vol，96 h后测得残糖低于4 g/L，酒精度为（12.1±0.06）%vol。造成以上酒精度变化的原因可能是发酵初期，酵母代谢旺盛，所需营养物质充足，可用于自身生长繁殖与酒精发酵，使得酒精度迅速上升，随着酒精度的升高，糖类物质被消耗，酒精度变化趋于平稳。与许多水果的果酒酿造周期7 d～15 d相比，大果山楂酒能在24℃发酵温度下第1天酒精度就达到（7.9±0.06）%vol，并在72 h时酒精度达到最大，96 h结束整个干型果酒的发酵过程，其发酵速度是非常快的。一方面说明这种商用酿酒酵母活力较强，接种量适宜，同时也说明大果山楂果浆含有较全面的营养成分能够很好地满足酿酒酵母持续酒精发酵的代谢需求。对于果酒液态深层发酵，缩短发酵周期意味生产效率较高，也有利于减少因发酵蒸腾作用对原果香味造成的损失，这在果酒的实际生产过程中非常重要[15]。
2.2 大果山楂酒发酵过程中总酚的变化
果酒的酚类物质具有抗氧化和抗诱导有机体突变等作用，同时可赋予果酒醇厚、丰满、结构感强，后味悠长的特点[16]，可提高酒的耐储存能力。大果山楂果发酵过程总酚的变化如图2所示。
图2 大果山楂酒发酵过程总酚的变化
Fig.2 Dynamic changes of total phenols during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
由图2可知，发酵前大果山楂原浆的总酚含量为（1.53±0.02）GAE mg/mL，随着发酵的进行，总酚含量有所降低，但在整个发酵过程中总酚含量基本保持较小的变化幅度，发酵结束时总酚含量为（1.24±0.03）GAEmg/mL。大果山楂酒在整个发酵过程中总酚含量相对平稳，保留率均超过80%，而对比其他果酒发酵过程中总酚含量的变化，哈之才[17]发现寒富苹果酒发酵过程中总酚含量保留率仅为40%左右，且呈波动减少趋势。胡冀太[18]发现山楂酒发酵过程中总酚含量呈上升趋势，而李楠等[19]发现山楂酒发酵过程中总酚含量几乎保持平稳。可见果酒发酵过程中对总酚含量变化的研究结果并不一致，这可能与水果自身特性、发酵工艺条件（如浸渍工艺、发酵温度、时间）等有关。本试验中大果山楂汁带渣发酵，在发酵6 h开始检测到总酚含量有所降低，其原因可能是大果山楂经磨浆、酶解后已充分释放果肉组织中的酚类物质，总酚含量达到峰值，而在发酵过程中因氧化和微生物代谢作用有所降低[20-21]。
2.3 大果山楂酒发酵过程中抗氧化能力的变化
在大果山楂酒发酵过程中，对不同时段的样品检测了DPPH自由基清除能力和ABTS+·清除能力，以此来判断大果山楂酒抗氧化活性与总酚含量变化的相关性。大果山楂酒酿造期间自由基清除能力的变化如图3所示。
图3 大果山楂酒酿造期间自由基清除能力的变化
Fig.3 Changes of free radical scavenging ability during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
如图3所示，发酵前的大果山楂原浆自由基清除能力最高，发酵开始后，果酒的自由基清除能力有所下降。在整个发酵过程中，DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力基本保持较小的变化幅度，这个变化与果酒中总酚含量变化趋势基本相似，说明大果山楂酒的抗氧化能力主要与总酚含量有关。通过相关性分析可知，大果山楂酒抗氧化能力与其总酚含量呈正相关。这一现象与报道的白葡萄酒、红葡萄酒、果酒和糯米酒发酵过程中酒样的抗氧化活性变化相一致[22-23]。此外，DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力二者较为一致，通过Person相关性分析，它们的相关系数为 0.774（p＜0.05）。
2.4 大果山楂酒发酵过程中芳香成分的变化
在大果山楂酒发酵过程中，对不同时段样品的芳香物质进行检测，对样品中相对含量超过0.5%的成分进行了统计分析，大果山楂酒发酵过程中各类香气物质含量的变化如图4所示，大果山楂酒发酵过程中各种香气物质相对含量的变化如表1所示。大果山楂发酵前的大果山楂原浆中含有丰富的香气成分，发酵成果酒之后仍然能保持相应的香气成分。
图4 大果山楂酒发酵过程中各类香气物质含量的变化
Fig.4 Changes of the contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine
表1 大果山楂酒发酵过程中各种香气物质相对含量的变化
Table 1 Changes of relative contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine mg/100 mL
注：-表示检测为微量或未检出。
2-甲基丁基乙酸酯 1.00 0.88 0.33 0.32 0.50 0.67 0.44 0.61 0.62 3-羟基丁酸乙酯 - 0.21 0.61 0.50 0.48 0.25 0.27 0.20 0.21己酸乙酯 7.80 1.20 2.60 3.68 5.37 6.07 4.17 3.94 6.81乙酸异戊酯 - 0.89 1.25 2.79 3.71 5.27 4.48 5.14 6.50 2，4-己二烯酸乙基酯 4.47 4.11 3.99 4.07 3.21 3.22 3.01 2.55 2.63 3-甲硫基丙酸乙酯 1.33 1.17 1.23 1.35 1.56 2.02 1.95 1.32 0.93 3-羟基己酸乙酯 3.24 0.93 0.18 0.49 0.50 0.27 0.34 0.43 0.31苯甲酸乙酯 1.15 1.38 1.67 2.57 2.58 2.86 1.23 3.03 3.58苯乙酸乙酯 0.62 0.15 0.60 0.56 0.50 0.43 0.46 0.44 0.33乙酸苯乙酯 2.75 3.45 4.57 6.36 6.24 5.67 6.43 4.74 5.22邻苯二甲酸二乙酯 1.20 2.47 6.27 2.93 3.80 2.88 2.78 2.10 2.49邻苯二甲酸二丁酯 0.93 0.43 0.51 0.86 0.72 0.43 0.59 0.27 0.45顺-9-十六碳烯酸甲酯 1.14 - - - - - - - -辛酸乙酯 - 2.16 10.30 6.73 10.74 12.73 10.23 10.76 29.79癸酸乙酯 - 0.90 8.47 6.21 9.50 6.19 4.21 4.41 15.21棕榈酸乙酯 - 0.60 1.62 1.93 1.90 1.89 2.30 1.92 2.67肉豆蔻酸乙酯 - 2.32 1.45 4.99 3.45 3.69 6.64 3.99 2.98醇类物质类型0 h 6 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h酯类物质化合物名称2，7-二甲基-2，7-辛二醇 1.06 0.50 0.49 0.45 0.44 0.52 0.50 0.36 0.47 3-甲硫基丙醇 - 0.23 0.58 1.48 1.22 1.69 2.11 1.43 1.54异辛醇 9.83 6.69 5.45 5.40 5.22 4.54 5.13 4.23 4.91苯乙醇 9.79 19.85 55.17 84.32 71.18 77.92 83.39 62.69 63.01豆蔻醇 1.10 1.36 2.92 0.60 4.15 0.27 1.15 0.44 0.56醛酮类物质苯甲醛 17.04 - - - - - - - -苯乙醛 2.67 - - - - - - - -壬醛 0.99 0.32 0.74 0.32 0.23 0.45 0.50 0.35 0.56 10-十一烯醛 0.60 - - - - - - - -（Z）-9-十八烯醛 0.14 1.01 1.30 1.78 12.03 1.01 1.26 0.87 0.83（Z）-7-十六烯醛 1.42 2.45 8.22 3.23 1.66 0.89 0.65 0.76 0.62顺-9-十六烯醛 - 3.21 5.73 0.96 6.75 2.11 1.34 0.69 1.05十三醛 - 1.21 1.51 0.23 0.76 0.45 0.56 0.27 0.42甲基庚烯酮 0.69 0.51 0.30 1.58 0.92 0.45 0.29 0.35 1.34其它物质辛酸 - 1.42 2.53 4.80 1.34 2.34 1.87 2.08 0.82环辛四烯 - 2.22 0.83 0.60 0.70 1.08 0.56 0.65 1.75 2，6-二叔丁基苯酚 1.11 0.76 0.93 0.96 0.68 0.47 0.82 0.52 0.37 2，2，3，4-四甲基戊烷 1.86 1.54 1.22 1.26 1.76 1.46 1.80 1.30 1.54十六烷 - 0.29 0.98 0.34 0.45 0.43 1.34 1.51 1.40十四烷 - 0.32 1.35 2.91 1.44 1.12 1.38 3.17 1.71
从动态发酵过程中检测出51种成分，由图4可知，主要是酯类、醇类和醛酮类成分，其特征成分包括苯甲醛、苯乙醇、异辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羟基己酸乙酯、苯乙醛等，这些成分也是常见的水果芳香成分，共同构成大果山楂原味果香[24-28]。使得发酵之后的大果山楂酒具有香槟的香气。
在大果山楂酒发酵过程及结束后形成的果酒中，芳香风味成分种类及含量与发酵前的大果山楂原浆相比均发生了明显变化。由图4可知，发酵6 h～24 h醇类、酯类含量呈上升趋势，这可能是因为醇与酰基辅酶A是酯合成的底物，随着醇类含量的上升，酯类含量也相应上升[29]，适宜的醇类物质含量可将酯类物质香气凸显出来，使得香气更加协调。发酵结束后样品中酯类和醇类成分的含量均有显著提高，这些成分中辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯和棕榈酸乙酯等属于发酵产生的新的代谢酯香成分。
由图4和表1可知，在发酵前，己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯和3-羟基己酸乙酯含量占酯类物质的60.5%。而在整个发酵过程中，辛酸乙酯占酯类物质含量基本保持在14.5%～36.9%，而辛酸乙酯具有类似白兰地的香气并带有甜味。发酵结束后，辛酸乙酯和癸酸乙酯占酯类物质含量最高，达到55.74%。苯乙醇作为原果芳香成分，同时也是酵母代谢产生的特征性成分，其含量增加量最高，发酵结束时占醇类物质的89.4%，苯乙醇不仅具有杀菌作用，还能赋予果酒玫瑰和茉莉花香，给人产生柔和愉悦的感觉。大果山楂原浆香味成分在发酵过程中存在变化，总体上香味因发酵的蒸腾作用有所减弱。其中异辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羟基己酸乙酯、乙酸苯乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯等原果香味成分虽有变化，但保留量也相对较多，保留率为50%～90%，这些成分属于识别大果山楂酒的重要原果香味。以上酯类和醇类特征成分共同构成了大果山楂酒的淡雅清香。但苯甲醛、苯乙醛、顺-9-十六碳烯酸甲酯等含量较高的原果香味成分在发酵终点基本检测不到。
3 结论
通过分析不同发酵时段样品的总酚含量、自由基清除能力以及利用HS-SPME结合GC-MS对大果山楂酒发酵过程中的香气成分进行定量分析。结果表明，经成分保护性预处理和果酒发酵，大果山楂成分可实现有效释放，获得较快的干型果酒发酵速度，既保证了生产效率，同时对提高果酒品质也有重要作用。在发酵过程中，总酚含量略有损失，但保存率均在80%以上，而且其自由基清除能力与总酚含量高度关联。快速发酵对形成大果山楂酒类似香槟特征的淡雅清香也十分重要，除形成新的代谢性酯类和醇类酒香成分以外，原果芳香成分保留量较高。基于以上试验结果，利用大果山楂可以开发高品质果酒，但在后期陈酿、碳酸化调配等工艺技术等方面还值得进一步研究和探索。
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